孚尔根染色

孚尔根染色法中Schiff试剂配方的研究

一、实验目的

1、进一步深入了解孚尔根染色的基本原理

2、探究尝试用非传统的方法配置Schiff试剂并观察其染色效果

二、实验原理

DNA是遗传的物质基础，应用Feulgen反应法显示细胞DNA是常用的组化染色技术，其中Sehitt试剂是染色成败的关键因素。Sehiit试剂(希夫试剂)，又称品红醛试剂，与醛类反应呈紫红色。它有多种不同的配制方法，归结起来有经典热配法以及冷配法。实验室经常采用的热配法，配制过程繁琐，常会因一个步骤的偏差而造成配制失败，实验中尝试改用冷配法，可收到与热配法同样的染色效果。

Schiff试剂的主要成分是碱性品红，属三氨基三苯甲烷类，它由副品红、品红、二号碱性品红组成四。碱性品红在酸性环境下与亚硫酸盐作用，生成无色品红。其配制方法有2种：热配法(将碱性品红加热煮沸)是通过热效应来加速分子运动，使染料溶解与脱色；冷配法(室温下采用振荡或搅拌的方法)是通过增加分子间的碰撞，促进染料溶解与脱色。2种方法的反应机制相同。

三、实验器材

实验材料：蚕豆根尖

实验器具：显微镜、载玻片、盖玻片、电炉、滤纸、烧杯、纱布、量筒、锥形瓶、标签、刀片、容量瓶

实验药品：蒸馏水、卡诺氏液、0.1mol/L的盐酸、碱性品红、盐酸、偏重亚硫酸钠、活性炭。

四、实验方法

1.浸种催芽

选择无虫、饱满、大小均匀的蚕豆种子50粒放入蒸馏水的烧杯中， 25℃浸泡24h,其中换水1次。种子吸胀后，在培养皿中铺一层脱脂棉，倒入足量的蒸馏水，将种子置于其中25 ℃培养2至3天，期间随时补充水分，大部分初生根长至1～2cm左右。

2.不同试剂配置

1. 热配法（常规法）

称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角瓶），时时振荡，继续煮5min（勿使之沸腾），充分溶解。然后冷却致50℃时用滤纸过滤，滤液中加入10ml1mol/L HCl，冷却致25℃时，加入0.5g偏重硫酸钠，充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24h（有时需要2至3天），使其颜色退至淡黄，然后加入0.5g 活性碳，用力振荡一分钟，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封瓶塞，外包黑纸。滤液应为无色也无沉淀，贮于4℃冰箱中备用。如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏生亚硫酸钠或钾，使之再转变为无色时，仍可再用。

2．冷配法

(1) Kodousek法将1g碱性品红溶于10rnl无水乙醇中，放入250ml烧瓶振荡10min 使之溶解，再加入186ml蒸馏水和5g偏重亚硫酸钠。然后加入34fnl浓盐酸，振荡至完全溶解后溶液呈浅黄色，加500mg活性炭，振荡3min，用0．2mol／L盐酸把容

量调整到200ml，过滤使之无色。

(2) Lillie和Fullmer法 1g碱性品红和1．9g偏重亚硫酸钠溶于0．15mol／L盐酸100ml中。在机械振荡器上振荡2h，溶液呈黄色或浅棕色透明液体。加500mg活性炭，振荡1—2min，过滤后加蒸馏水调至100ml。

(3)陈啸梅法碱性品红0．5g加1moVL盐酸15rnl，振荡使之溶解，再加0．6％偏重亚硫酸钠85rnl。盖紧瓶塞混匀后在室温下避光放置24h，溶液呈草黄色，加活性炭300n1g，振荡1min，过滤后呈无色液体。

(4)渡边恒彦法 1g碱性品红溶解于0．15mol／L盐酸100ml内，用磁力搅拌器搅拌12h。再加入偏重亚硫酸钠1．9g，混合搅拌1—2h，这时液体稍呈透明状，加500mg 活性炭。混合2min以后过滤，过滤后呈无色液体。

3.固定

配置固定液：无水乙醇:冰乙酸=3:1

将蚕豆根尖取下用蒸馏水冲洗三分钟放入固定液中固定12~15h

4.解离

配置1N HCL解离液 1.18g/mlHCL量取8.39ml加水定容到100ml，放到60℃水浴锅上预热

将固定好的根尖用水冲洗三分钟并吸干各加入到预热好的相应的解离液管中，解离10~13min染色

5.染色

吸去水分，加入Schiff试剂避光染色30min，然后用漂洗液漂洗2-3次，经水洗后准备压片。

6.压片

取一根尖置于载玻片上，切下生长区部位，加一滴清水或45%醋酸水溶液压片镜检。

7.镜检、观察

观察各种不同的方法染色的染色效果有何差异

五、结果与分析

热配法：

冷配法：Kodousek法

冷配法：Lillie和Fullmer法

冷配法：陈啸梅法

冷配法：渡边恒彦法

比较冷配法和热配法：认为冷配法比热配法优越。冷配法无需加热，程序简便易行，节约时间；不会因为温度和时间掌控不准确而影响配制效果。冷配法配制的Schiff试剂较热配法使用周期长，试剂稳定性好。这可能是热配法中碱性品红加热煮沸，染料受热分解，丢失了部分有效成分之故。热配法的温度控制要求较严，药液保存的稳定性较差，暴露后再使用效果不佳。Sehiff试剂应密封贮存在阴暗处，倘若受热或见光，或露置于空气中过久。试剂中的二氧化硫易失，造成试剂显色。

(1)冷配法与热配法相比有以下优点：①配制在常温下进行，元需煮沸，避免了加

热后再冷却杂质析出问题；②排除人为因素的影响(降温、测温的操作)，减少测量误差。增强了反应的稳定性，使用周期增长；③免去过滤、净化与吸附等繁琐步骤；④以浓盐酸取代1mol／L盐酸，加速了对染色剂色素的破坏速度，缩短了配制时间，提高了工作效率。

(2)失败原因主要为：Schiff试剂中含有磺酸基、氨基，磺酸基易被氧化剂氧化，

氨基在碱性条件下不稳定。因此，配制Sehitt试剂应在冷溶液及酸性条件下进行。试剂显色是由于亚硫酸盐被消耗，转化为二氧化硫气体逸出，醌式结构重新恢复，无色品红又被氧化生成碱性品红。

六、实验感想

本小组通过运用不同方法对希夫试剂的配置进行研究，通过染色的比较观察，最终归纳出各种方法的优缺点，在这次实验过程中，尽管初期遇到一些问题，但是我们还是通过对方法的改进成功的完成了我们的实验，在实验过程中对于试剂的配置及研究过程中小组成员各司其职，配合良好，尽管实验过程付出了很多努力，也很辛苦，但是最终圆满完成预期目标，因此我们觉得很值的。这次实验中我们学到了很多，增强了我们的动手能力和团队意识。让我们对遗传学实验进一步深入了解了许多，十分感谢老师能给我们这样的机会去做实验。