华中科技大学发酵工程 第二章 工业用微生物菌种
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阻遏； 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
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抗生素产生菌的筛选
筛选模型：试验菌
筛选方法：
▪ 固体培养筛选
铺菌法 复印平板法
▪ 液体培养筛选
从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ； 从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目
的的优良菌株 ； 从已知菌种和大自然中分离新菌株
寻找新的发酵产品的产生菌； 寻找老产品的新的优良菌株。
➢ 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 经济性 指导性
有筛选意义。
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最常用的工业微生物
细菌
醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌 乳酸杆菌 枯草杆菌 丙酮丁醇梭菌 大肠杆菌 谷氨酸棒状杆菌
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最常用的工业微生物
酵母菌
当S<S0时，富集什么菌株？ 当S>S0时，富集什么菌株？
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连续富集培养技术分离菌株的优点
分离的菌株特别适合连续发酵生产过程 有利于分离具有某种工业生产特性的菌株 可以筛选出能共生的稳定混合培养物
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2. 菌种选择的要求（续）
菌种不易变异退化； 对放大设备的适应性强； 菌种不是病原菌，不产生任何有害的生
物活性物质和毒素。
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（二）分离筛选原理与技术
1. 筛选的指导思想 2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面 3. 新种分离筛选原理与技术
菌种纯化
初步工艺条件摸索
再复筛 生产性能测试
较优菌株1-3株
保藏及进一步做生产试验 或作为育种的出发菌株
某些必要试验和 毒性试验等
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含微生物样品的采集
采样时应注意的问题: 土壤微生物的分布 采土深度 土壤植被情况 采样季节 土壤的酸碱度
酿酒酵母 假丝酵母属
产朊假丝酵母 解脂假丝酵母 热带假丝酵母
毕赤酵母属、汉逊酵母属
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最常用的工业微生物
霉菌 曲霉属 米曲霉 黑曲霉 青霉属 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉 根霉属 德氏根霉 米根霉、小麦曲根霉 红曲霉属 紫红曲霉
或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式
▪ 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题
▪ 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
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A
μ
B
S0 基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（μ）的影响
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1. 筛选的两种指导思想
先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。 分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。
结果有两种可能：
▪ 获得适于工业发酵菌株 ▪ 只获得选育所需的出发菌株
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2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面
再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后
产氨基酸菌落周围有生长圈
对应到copy前相应
位置，找到目的菌落
目的菌落进行液体培养，
对产物进行定量测定
筛选产物含量高的菌株
多糖产生菌的筛选
取样特点：碳水化合物工业的废弃物 筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液
状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来 筛选高产菌。
B. 固体培养技术
常用于分离某些酶产生菌 选择压力：在选择培养基中加入所需酶
的基质
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随机分离原理与技术
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速
灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应 筛选方法的确定。
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最常用的工业微生物
放线菌
链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
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未培养微生物
定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养 方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微 生物群落中占有非常高的比例，约为99％。
对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准： 土壤来源广泛 在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新 菌种
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样品的预处理
目的：提高分离效率 方法：
物理方法：热处理；膜过滤法；离心法 化学方法 诱饵法
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赖氨酸生产菌种的选育改良思路
出发菌株：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌 育种思路 1.优先合成的转换——渗漏缺陷型的选育 2.切断支路代谢——营养缺陷型的选育：高丝氨酸缺陷型 3.抗结构类似物突变株的选育：AEC 4.解除代谢互锁：Leu- 、 抗Leu结构类似物、 喹啉s 、 苯醌s 5.增加前体物的合成和阻塞副产物的生成：
Ala-、抗Asp结构类似物 选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株 6.改善细胞膜的透过机能 7. 选育温度敏感突变株 8. 应用细胞工程和基因工程育种
1. 菌种选择的总趋势
野生菌→变异菌 自然选育→代谢控制育种 诱发基因突变→基因重组的定向育种
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2. 菌种选择的要求
能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成 的目的产物产量高、易于回收；
生长速度和反应速度较快，发酵周期较短； 培养条件易于控制； 抗噬菌体及杂菌污染的能力强；
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本章内容
一、常用的工业微生物 二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术 三、发酵工业菌种改良
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对产物进行菌种筛选时，有两条经验：
进化上向上兼容； 次生代谢在进化上后移，芽孢菌以上才
性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）
乳酸生成量测定（滴定法）
Rf值定性 （有机酸呈黄斑点）
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放线菌的分离： 以产链霉素菌种的分离为例
（从退化菌种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
▪ 抗药性筛选
筛选模型：氨苄青霉素和β-内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同
I
II
无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大 有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性
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试验菌
金黄色葡萄球菌209p 枯草杆菌6633 大肠杆菌 耻垢分枝杆菌607 白色念珠菌 青霉菌
随机分离技术举例
抗生素产生菌的筛选
药理活性化合物产生菌的筛选
生长因子产生菌的筛选
多糖产生菌的筛选
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高产培养基设计的几个原则
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素；
使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物
在麦芽汁固体培养基上，25℃培养48-72h
形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用
纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次
性能测定
①生成子囊孢子速度测定 ②发酵力测定 ③热死温度测定 ④凝集力测定 ⑤双乙酰含量测定
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菌种选育改良的具体目标
生长条件的选择与控制原理 控制营养成分 控制培养基酸碱度 添加抑制剂 控制培养温度 控制通气条件
选择性分离技术 富集液体培养技术 施加选择压力，进行定向筛选 固体培养技术
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A.富集液体培养
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长
能性实现） 菌种分离
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根据目的菌株及其产物特点分
选择性分离方法
(定向筛选←选择压力)
随机分离方法
(用筛选方案- 检测系统进行间接分离）
富集液体培养 固体培养基条件培养 (初筛)
菌种纯化Fra Baidu bibliotek
复筛
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生长因子产生菌的筛选
筛选模型：营养缺陷型试验菌 筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进
营养缺陷型试验菌生长
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氨基酸产生菌的筛选
样品
预处理
初筛（除真菌）
在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（copy 法）
平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 u.v线杀死长好的菌落
代表微生物类型
革兰氏阳性球菌 革兰氏阳性杆菌 革兰氏阴性肠道细菌
结核杆菌 酵母状真菌 丝状真菌
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药理活性化合物产生菌的筛选
药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一 个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到 治疗的目的。
筛选模型：目标酶
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细菌分离：以乳酸菌为例
取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中
加麦芽汁至瓶口处，封塞，25℃培养24-48h
培养基中长出绢丝状波动物，镜检 杆状，阳性染色 初步断定乳酸菌
用选择性培养基分批富集培养2-3代
稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基 根据透明圈挑选菌落
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设计筛选方案时必须考虑两个要点
▪ 选择性 ▪ 灵敏度
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3. 新种分离与筛选的步骤
调查研究（包括资料查阅）
试验方案设计 含微生物样品的采集 （如何使样品中含所需微
生物的可能性大？） 样品预处理 （如何在后续的操作中使这种可
提高目标产物的产量 提高目标产物的纯度，减少副产物 改良菌种性状，改善发酵过程 改变生物合成途径，以获得高产的新产品
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发酵工业菌种改良方法
常规育种(诱变育种) 细胞工程育种 基于代谢调节的育种技术 基因工程育种 蛋白质工程育种 代谢工程育种
分离方法的选择
根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法
菌种的营养特征独特 生长特征独特
选择性分离
无选择性特征 根据产物的特征进行
随机分离
▪ 选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控 制，从而实现定向富集筛选。
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选择性分离原理和技术
研究方法 模拟自然培养法: 原位培养、培养条件优化、 单细胞操作 宏基因组分析法
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二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术 （一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 （二）分离筛选原理与技术 （三）应用举例
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采用稀释法制平板，获取单菌落
根据高产菌的特点，选择目的菌落
筛选模型：形态依据
斜面保藏 高产菌恢复 放大培养，发酵液性能测试
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真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例
稀释分离法
取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7 取0.1ml 加入固体培养基铺平皿（×2）
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抗生素产生菌的筛选
筛选模型：试验菌
筛选方法：
▪ 固体培养筛选
铺菌法 复印平板法
▪ 液体培养筛选
从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ； 从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目
的的优良菌株 ； 从已知菌种和大自然中分离新菌株
寻找新的发酵产品的产生菌； 寻找老产品的新的优良菌株。
➢ 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 经济性 指导性
有筛选意义。
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最常用的工业微生物
细菌
醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌 乳酸杆菌 枯草杆菌 丙酮丁醇梭菌 大肠杆菌 谷氨酸棒状杆菌
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最常用的工业微生物
酵母菌
当S<S0时，富集什么菌株？ 当S>S0时，富集什么菌株？
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连续富集培养技术分离菌株的优点
分离的菌株特别适合连续发酵生产过程 有利于分离具有某种工业生产特性的菌株 可以筛选出能共生的稳定混合培养物
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2. 菌种选择的要求（续）
菌种不易变异退化； 对放大设备的适应性强； 菌种不是病原菌，不产生任何有害的生
物活性物质和毒素。
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（二）分离筛选原理与技术
1. 筛选的指导思想 2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面 3. 新种分离筛选原理与技术
菌种纯化
初步工艺条件摸索
再复筛 生产性能测试
较优菌株1-3株
保藏及进一步做生产试验 或作为育种的出发菌株
某些必要试验和 毒性试验等
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含微生物样品的采集
采样时应注意的问题: 土壤微生物的分布 采土深度 土壤植被情况 采样季节 土壤的酸碱度
酿酒酵母 假丝酵母属
产朊假丝酵母 解脂假丝酵母 热带假丝酵母
毕赤酵母属、汉逊酵母属
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最常用的工业微生物
霉菌 曲霉属 米曲霉 黑曲霉 青霉属 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉 根霉属 德氏根霉 米根霉、小麦曲根霉 红曲霉属 紫红曲霉
或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式
▪ 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题
▪ 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
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A
μ
B
S0 基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（μ）的影响
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1. 筛选的两种指导思想
先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。 分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。
结果有两种可能：
▪ 获得适于工业发酵菌株 ▪ 只获得选育所需的出发菌株
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2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面
再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后
产氨基酸菌落周围有生长圈
对应到copy前相应
位置，找到目的菌落
目的菌落进行液体培养，
对产物进行定量测定
筛选产物含量高的菌株
多糖产生菌的筛选
取样特点：碳水化合物工业的废弃物 筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液
状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来 筛选高产菌。
B. 固体培养技术
常用于分离某些酶产生菌 选择压力：在选择培养基中加入所需酶
的基质
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随机分离原理与技术
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速
灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应 筛选方法的确定。
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最常用的工业微生物
放线菌
链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
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未培养微生物
定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养 方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微 生物群落中占有非常高的比例，约为99％。
对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准： 土壤来源广泛 在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新 菌种
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样品的预处理
目的：提高分离效率 方法：
物理方法：热处理；膜过滤法；离心法 化学方法 诱饵法
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赖氨酸生产菌种的选育改良思路
出发菌株：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌 育种思路 1.优先合成的转换——渗漏缺陷型的选育 2.切断支路代谢——营养缺陷型的选育：高丝氨酸缺陷型 3.抗结构类似物突变株的选育：AEC 4.解除代谢互锁：Leu- 、 抗Leu结构类似物、 喹啉s 、 苯醌s 5.增加前体物的合成和阻塞副产物的生成：
Ala-、抗Asp结构类似物 选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株 6.改善细胞膜的透过机能 7. 选育温度敏感突变株 8. 应用细胞工程和基因工程育种
1. 菌种选择的总趋势
野生菌→变异菌 自然选育→代谢控制育种 诱发基因突变→基因重组的定向育种
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2. 菌种选择的要求
能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成 的目的产物产量高、易于回收；
生长速度和反应速度较快，发酵周期较短； 培养条件易于控制； 抗噬菌体及杂菌污染的能力强；
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本章内容
一、常用的工业微生物 二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术 三、发酵工业菌种改良
http://jpkc.hust.edu.cn/jpkc
对产物进行菌种筛选时，有两条经验：
进化上向上兼容； 次生代谢在进化上后移，芽孢菌以上才
性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）
乳酸生成量测定（滴定法）
Rf值定性 （有机酸呈黄斑点）
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放线菌的分离： 以产链霉素菌种的分离为例
（从退化菌种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
▪ 抗药性筛选
筛选模型：氨苄青霉素和β-内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同
I
II
无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大 有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性
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试验菌
金黄色葡萄球菌209p 枯草杆菌6633 大肠杆菌 耻垢分枝杆菌607 白色念珠菌 青霉菌
随机分离技术举例
抗生素产生菌的筛选
药理活性化合物产生菌的筛选
生长因子产生菌的筛选
多糖产生菌的筛选
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高产培养基设计的几个原则
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素；
使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物
在麦芽汁固体培养基上，25℃培养48-72h
形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用
纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次
性能测定
①生成子囊孢子速度测定 ②发酵力测定 ③热死温度测定 ④凝集力测定 ⑤双乙酰含量测定
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菌种选育改良的具体目标
生长条件的选择与控制原理 控制营养成分 控制培养基酸碱度 添加抑制剂 控制培养温度 控制通气条件
选择性分离技术 富集液体培养技术 施加选择压力，进行定向筛选 固体培养技术
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A.富集液体培养
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长
能性实现） 菌种分离
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根据目的菌株及其产物特点分
选择性分离方法
(定向筛选←选择压力)
随机分离方法
(用筛选方案- 检测系统进行间接分离）
富集液体培养 固体培养基条件培养 (初筛)
菌种纯化Fra Baidu bibliotek
复筛
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生长因子产生菌的筛选
筛选模型：营养缺陷型试验菌 筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进
营养缺陷型试验菌生长
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氨基酸产生菌的筛选
样品
预处理
初筛（除真菌）
在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（copy 法）
平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 u.v线杀死长好的菌落
代表微生物类型
革兰氏阳性球菌 革兰氏阳性杆菌 革兰氏阴性肠道细菌
结核杆菌 酵母状真菌 丝状真菌
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药理活性化合物产生菌的筛选
药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一 个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到 治疗的目的。
筛选模型：目标酶
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细菌分离：以乳酸菌为例
取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中
加麦芽汁至瓶口处，封塞，25℃培养24-48h
培养基中长出绢丝状波动物，镜检 杆状，阳性染色 初步断定乳酸菌
用选择性培养基分批富集培养2-3代
稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基 根据透明圈挑选菌落
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设计筛选方案时必须考虑两个要点
▪ 选择性 ▪ 灵敏度
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3. 新种分离与筛选的步骤
调查研究（包括资料查阅）
试验方案设计 含微生物样品的采集 （如何使样品中含所需微
生物的可能性大？） 样品预处理 （如何在后续的操作中使这种可
提高目标产物的产量 提高目标产物的纯度，减少副产物 改良菌种性状，改善发酵过程 改变生物合成途径，以获得高产的新产品
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发酵工业菌种改良方法
常规育种(诱变育种) 细胞工程育种 基于代谢调节的育种技术 基因工程育种 蛋白质工程育种 代谢工程育种
分离方法的选择
根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法
菌种的营养特征独特 生长特征独特
选择性分离
无选择性特征 根据产物的特征进行
随机分离
▪ 选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控 制，从而实现定向富集筛选。
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选择性分离原理和技术
研究方法 模拟自然培养法: 原位培养、培养条件优化、 单细胞操作 宏基因组分析法
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二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术 （一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 （二）分离筛选原理与技术 （三）应用举例
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采用稀释法制平板，获取单菌落
根据高产菌的特点，选择目的菌落
筛选模型：形态依据
斜面保藏 高产菌恢复 放大培养，发酵液性能测试
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真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例
稀释分离法
取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7 取0.1ml 加入固体培养基铺平皿（×2）