聚合酶链反应原理及应用

引物—— 5’ATCCGGAC
Mg2+
耐热DNA聚合 酶
酶活化因子
dGTP dTTP dATP dCTP
底物
二 PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 解旋解链 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进
行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动 化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
三、PCR原理
（一）Mullis的设想
94℃变性
50-65℃退火
适度延伸
94℃
55℃
37℃
Mullis最初使用的DNA聚合酶是E. coli DNA聚合 酶1的Klenow片段，起主要缺点是：不耐高温， 加热时会变性失活，每次循环都要重新加入；引 物链延伸反应在37 ℃下进行，容易发生模板和引 物之间的碱基错配，产物特异性较差，合成的 DNA片段不均一。
3’
解旋解链 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCT 聚D合NA酶GGAUCG 5‘
合成引物
5‘AUCGCG 聚ADT合NAA酶GCGTAGCTGCGAGGATCG
3’
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
1971年，Khorana提出：经过DNA 变性，与合适引物杂交，用DNA聚 合酶延伸引物，并不断重复该过程 便可克隆tRNA基因。
PPCCRR反过应程条件7925℃
PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理 Taq
PPCCRR反过应程条件957502℃
PCR的特点
Taq
Taq
Taq
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件72℃
PCR的特点
第2轮结束
模板DNA
第1轮扩增 第2轮扩增
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件95℃
PCR的特点
1 2 模板D3NA
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆 基 因 成 为 可 能 ， 所 以 ， Khorana 的设想被人们遗忘了……
1985 年 ， 美 国 PE-Cetus 公 司 的 Kary B. Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）
基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该
一、概念
（一）PCR: polymerase chain reaction
聚合酶链反应
PCR技术是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，亦称为 无细胞分子克隆技术。它是以待扩增的双链DNA为模板，在一对人工合成的 寡核苷酸引物的介导下，以四种dNTP为底物，通过耐高温DNA聚合酶的酶 促作用，经过变性、退火、延伸的循环快速特异地扩增出特定的DNA片断。
1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行 PCR，扩增的DNA片段均一，真实性好，特异性 高。但是该酶不耐热，每次循环仍需加入新酶。
（二）Erlich发现耐高温的DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80
活 性
60
40
(%)
20
40 50 60 70 80 90 100
第四章 聚合酶链反应 原理及应用
聚合酶链反应(PCR)是 80年代中期发展起来的 体外核酸扩增技术。它 具有特异、敏感、产率 高、快速、简便、重复 性好、易自动化等突出 优点；能在一个试管内 将所要研究的目的基因 或某一DNA片段于数小 时内扩增至十万乃至百 万倍,使肉眼能直接观 察和判断；可从一根毛 发、一滴血、甚至一个 细胞中扩增出足量的 DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天 几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物 医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
简单的讲， PCR技术即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向 DNA合成。
（二）PCR反应Baidu Nhomakorabea件
模板 （template） 上、下游引物（primer） 4种dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 酶 （Taq DNA polymerase）
PCR扩增体系
模板—— 3’TTAGGCCTGGATAAGCGCCTGGA 5’
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
DNA引物
PPCCRR反过应程条件955℃
PCR的特点
引物1
引物2
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件5702℃
PCR的特点
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
3’
合成引物
3’ 解旋酶解链酶
5’
子链延长
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
GGAUCG 引5‘物酶
RNA引物
合成引物
RNA引
5‘AU物CGCG
子链延长 引T物A酶GCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
温度(℃)
Taq DNA聚合酶的特点：
耐热性：在70 ℃下反应2h后起残留活性大 于原来的90%；
在热变性时不会被钝化，不必再每次扩增 反应后再加新酶；
大大提高了扩增片段的特异性和扩增效率， 增加了扩增长度。
94℃
55℃
72℃
PCR循环
（三）PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR的过程
标准的PCR反应体系
4种dNTP
各200umol/L
引物
各100pmol
模板DNA
0.1～2ug
Taq DNA－pol 2.5u
Mg2+
1.5mmol/L
温 度 （℃）
94 72
55
22
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
DNA 2
形
成
条 单 链
变 性
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋