重组质粒在大肠杆菌中的表达
外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤
目的基因在大肠杆菌中的诱导表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。
[主要试剂]1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）： IPTG溶于100ml ddH2O中,μm 滤膜抽滤，-20℃保存。
[操作步骤]1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为BamHⅠ和HiindⅢ），PCR循环获得所需基因片段。
PCR反应体系为：。
PCR反应条件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。
2、构建重组表达载体（1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
（2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。
连接反应体系为：#3、获得含重组表达质粒的表达菌种（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。
否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
（3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21（DE3）的感受态细胞。
4、诱导表达1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。
2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含100mlLB培养基的300ml 培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌（最好，大约需3hr）。
3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM 作为实验组，两组继续于37℃、200rpm震荡培养3hr。
重组质粒的诱导表达——表达宿主菌的选择
重组质粒的诱导表达——表达宿主菌以及诱导表达
1.表达宿主菌的选择
大肠杆菌常用的表达宿主菌有E.Coli BL21(DE3), E.Coli Rossatta(DE3), E.Coli BL21(DE3)Condon Plus。
针对特殊的目标蛋白其所需要的宿主菌也不相同，每种宿主菌的基本特征可在本网站查询，福因德生物可提供表中所列菌种的感受态细胞，如需更多信息可联系福因德技术部门。
2．优化表达条件
表达条件(包括IPTG浓度、诱导温度和和诱导时间等)的优化（可参照以下的正交图设计实验），主要是为了提高蛋白产量/提高可溶性蛋白表达比例；选用不同诱导时长主要是为了选择最佳收获时间（时间短了，蛋白产量不够；时间长了，大量蛋白降解）；温度诱导主要是为了得到可溶性表达的蛋白，很多的蛋白即使低温诱导也不能实现可溶性表达，一定要实现可溶性表达尽可能选择促溶标签/调整IPTG浓度，使翻译速度放缓有充分时间折叠。
福因德生物技术团队研发的自诱导培养基（Frdbio T7表达自诱导培养基即用型，PER0011）就是充分利用此原理，对表达在包涵体状态的蛋白优化为上清可溶表达状态的成功率高达60%。
可溶性表达的策略在“蛋白可溶性表达的解决方案”中有详细的阐述。
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程通常包括以下步骤：
1. 克隆：首先需要将目标基因克隆到适当的表达载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，然后将其与表达载体连接，形成重组质粒。
2. 转化：将重组质粒转化到大肠杆菌细胞中。
可以使用化学方法（如热冲击法）或电穿孔法将质粒导入细胞。
3. 选择：转化后，将细胞分散在含有适当抗生素的琼脂平板上培养。
只有带有重组质粒的细胞能够存活并形成菌落。
4. 培养：将含有重组细胞的培养液转移到适当的培养基中，并在适当的条件下培养。
这可能包括调节温度、pH值和搅拌速度等。
5. 表达：在培养期间，目标基因会被大肠杆菌细胞转录和翻译为蛋白质。
使用适当的启动子和调控序列，可实现目标蛋白的高效表达。
6. 细胞破碎：一旦细胞达到最佳表达水平，就需要破碎细胞以释放目标蛋白。
这可以通过多种方法实现，如超声波、高压破碎或化学方法。
7. 纯化：通过使用各种分离和纯化技术（如亲和层析、凝胶过滤、离子交换层析等），从细胞裂解液中纯化目标蛋白。
以上是在大肠杆菌中表达重组蛋白的一般流程。
具体的步骤和条件可能因实验设计和目标蛋白的特性而有所不同。
重组人胰岛素在大肠杆菌中表达及分离纯化
重组人胰岛素在大肠杆菌中表达及分离纯化一、本文概述本文旨在探讨重组人胰岛素在大肠杆菌中的表达及其后续的分离纯化过程。
胰岛素作为一种关键的激素，在调节血糖水平中发挥着至关重要的作用。
然而，天然胰岛素的来源有限，且提取成本高昂，因此，通过基因工程技术在大肠杆菌中生产重组人胰岛素成为了一种可行且经济的替代方案。
本文首先介绍了重组人胰岛素的基因克隆和在大肠杆菌中的表达策略，然后详细阐述了胰岛素的分离纯化过程，包括细胞的破碎、蛋白质的提取、层析分离以及胰岛素的纯化等步骤。
本文还讨论了影响胰岛素表达及纯化的关键因素，并提出了优化表达及纯化条件的策略，以期提高重组人胰岛素的产量和纯度，为糖尿病治疗提供更为可靠和经济的药物来源。
二、重组人胰岛素的基因克隆与表达重组人胰岛素在大肠杆菌中的表达首先依赖于对胰岛素基因的克隆。
基因克隆是生物技术中一项重要的技术，它涉及到从基因组DNA或cDNA中分离出特定的基因，然后将其插入到适当的载体中，以便在大肠杆菌等宿主细胞中进行复制和表达。
目的基因的获取：需要从人源的cDNA文库或基因组DNA中扩增出胰岛素的编码序列。
这通常通过PCR技术实现，需要设计一对特定的引物，它们能够与人胰岛素基因的两端互补结合。
载体的选择：为了在大肠杆菌中表达人胰岛素，需要选择一个合适的表达载体。
常用的载体包括质粒和噬菌体。
这些载体通常含有启动子、终止子、复制原点和选择标记等元件，以确保目的基因在宿主细胞中的高效表达。
基因的克隆：将目的基因与载体连接后，通过转化技术将重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞中。
在适当的选择压力下，例如抗生素抗性，只有成功导入重组质粒的细胞才能生长，从而实现了对胰岛素基因的克隆。
表达条件的优化：在大肠杆菌中表达人胰岛素时，需要优化表达条件以获得最高的表达量。
这包括选择合适的培养基、调整培养温度、pH值以及诱导剂的浓度等。
表达产物的分析：通过SDS-PAGE、Western Blot等技术，可以对表达产物进行定性和定量分析，以确认胰岛素基因在大肠杆菌中的成功表达。
大肠杆菌表达方法
大肠杆菌表达方法一．表达鉴定1、将鉴定好的质粒转化DE3(BL21),涂卡那板。
1、挑取含重组质粒的菌体单斑3-5个克隆至2ml LB（含kana50μg/ml）中37℃过夜培养，保存甘油菌。
500ul菌加500ul 40%甘油。
2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将100ul菌加入到含5mlLB（含kana50μg/ml）培养基的培养管中，37℃震荡培养至OD600 ≌0.6-0.8（大约需3hr）。
3、取1ml液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养5hr。
4、取菌体，离心12000g×2min收获沉淀，加100ul Bugbuster protein extraction reagent 重悬后在振荡器上振荡20min。
5、4度12000rpm 离心20min，弃上清，沉淀加100ul 1×SDS-Loading buffer，电泳鉴定。
二．小规模蛋白表达、纯化、复性1、取鉴定好的甘油菌10ul接种至2ml LB（含kana50μg/ml）中37℃过夜培养2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将2ml菌加入到含200ml LB（含kana50μg/ml）培养基的培养管中，37℃震荡培养至OD600 ≌0.6-0.8（大约需3hr）。
3、取1ml液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养5hr。
4、取菌体，离心12000g×2min收获沉淀，加5ml Bugbuster protein extraction reagent 重悬后在振荡器上振荡20min。
5、4度12000rpm 离心20min，弃上清，沉淀加10ml 包涵体洗涤液(10×：200 mM Tris-HCl, pH7.5, 100 mM EDTA, 10% Triton X-100)，涡旋1min 充分重悬，12000rpm 离心15min，弃上清。
重组融合蛋白MBP-BSH在大肠杆菌中的表达及其纯化、功能鉴定
注：Apr. 具有氨苄青霉素抗性；Kanr. 具有卡那霉素抗性；m-MBP. 具有 MBP 双突变 A317V/I322V。
来源
实验室筛选保藏 实验室保藏 实验室保藏
日本 TaKaRa 公司 尚广东博士馈赠 尚广东博士馈赠 尚广东博士馈赠 尚广东博士馈赠 尚广东博士馈赠 尚广东博士馈赠 尚广东博士馈赠
purification efficiency for MBP-BSH protein than Amylose resin. In addition, His-Tag linked at the C-terminal was favorable
for the binding of nickel ions and as a result, MBP-BSH containing less impurities was obtained in a higher yield. The enzymatic
限制性内切酶 BamHⅠ和 XhoⅠ、250bp DNA Ladder Marker、λ/HindIII DNA Marker、pMD18-TTA 克 隆试剂盒、质粒提取试剂盒和 DNA 凝胶回收纯化试剂 盒 宝生物工程(大连)有限公司；Protein Marker Mid Range、氨苄青霉素、卡那霉素 上海生工生物工程技 术有限公司；酵母粉、胰蛋白胨 英国 Oxoid 公司； T4 DNA 连接酶 美国 New England Biolabs 公司；Amylose Resin、Ni-NTA Resin 德国 Novagen 公司。 1.3 bsh 基因的克隆及测序
分子生物学实验技术-3-外源基因在大肠杆菌中的表达
分子生物学实验技术三、外源基因在大肠杆菌中的表达（一）含有表达质粒的重组细菌的诱导表达实验安排：每组做一份（5人/组）。
操作步骤：1、将重组质粒和对照载体分别转化BL21（DE3）感受态细胞，待长出菌落后在转化的平皿中各挑取一个单菌落接种于3 mL含Amp的LB液体培养基中，37℃培养过夜。
2、将培养的细菌按1∶50比例加入到5 mL含Amp的新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3 h）。
3、取1ml菌液作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度为0.5 mM作为实验组，两组继续37℃振荡培养3 h。
4、分别取菌液1 mL于1.5 mL Ep管中，12000⨯g离心30 s，收获菌体。
5、用100 μL无菌去离子水将菌体吹散混匀，然后加100 µL 2⨯SDS凝胶加样缓冲液，混匀后沸水浴5 min。
6、通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况。
注意事项：1、IPTG的最佳诱导浓度的确定：将IPTG以不同浓度（0.2-2.0 mM）加入菌液中进行诱导，通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况，选择外源蛋白表达量最高时的IPTG浓度作为其最佳诱导浓度。
2、最佳诱导时间的选择：在菌液中加入最佳浓度的IPTG诱导6 h，其间每隔1 h（在第1、2、3、4、5、6 h）分别取菌液1 mL，通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况，选择外源蛋白表达量最高时的诱导时间作为其最佳诱导时间。
（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）实验安排：示范性操作。
实验原理：细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT）并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
实验五__质粒在大肠杆菌中的转化和鉴定
原则上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷 的菌株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互 补原则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法：
１．抗生素筛选法
菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带 有该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉 霉素等）这样只有转化子才能在含该抗 生素的培养基上长出。
２互补法
现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个
大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷 酸基因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏 码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。 受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。 当外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳 糖苷酶表达， 在生色底物５－溴－４－氯－３－吲 哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色 菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入 失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过 颜色不同而区分重组子和非重组子。
4、向管中加入0.4ml LB液体培养 基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养 45分钟,使细菌恢复正常生长状态,并表 达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。 5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂 布于含Amp的筛选平板上,正面向上放 置半小时,待菌液完全被培养基吸收后 倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
思考题： 1.在热激以后进行活化培养，这时的培养基中为 什么不加入抗生素？ 2.什么是质粒？根据在细菌中的复制，质粒有几 种类型？用于基因重组的主要用到哪种质粒？
实验五
质粒在大肠杆菌中 的转化和鉴定
一、质粒转化的功用
1. 为实验室获得大量进行基因克隆的质 粒。 2. 使携带有目的基因的重组质粒在大肠 杆菌中进行表达。
Байду номын сангаас 二、原理
质粒在大肠杆菌中表达步骤
当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。
随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。
转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。
实验准备一．器材可调移液器P1000、P200、P20及其经消毒的盒装蓝、黄吸头经消毒的1.5ml Eppendorf管、试管架及其水浴用试管架42℃恒温水浴恒温培养摇床（调至37℃，225rpm）37℃培养箱玻璃涂棒（普通玻璃吸管，细头部在煤气灯上烧成“L”形）消毒过的洁净培养皿（直径10cm）二．试剂LB培养基细菌培养用胰化蛋白胨10g细菌培养用酵母提取物5gNaCl 5g加800ml水，放入磁力搅拌棒，在磁力搅拌器上搅拌至彻底溶解，用5M NaOH（约0.2 ml）调节pH值至7.0，加水定容至1000 ml。
高压15 lbf/in2（1.034×105pa）消毒30分钟，冷却后可加入氨苄青霉素（50mg/ml）500ul，视载体特性而定，混匀，在以上1000ml培养基中加入15g细菌培养用琼脂, 即为含有琼脂的培养基抗生素琼脂平板：待含有琼脂的培养基冷却后，加入抗生素，倾入培养皿，约30~50 ml，用煤气灯火焰掠过培养基表面，以消除气泡。
冷却后，标记，封于塑料袋中，倒置，于4℃冰箱内避光保存pH试纸（或pH计）IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，-20 ℃保存。
l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )，50 mmol / L DTT，2 % SDS (电泳级)，0.1 % 溴酚蓝，10 % 甘油大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 )酶溶法(1)裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )，1 mmol / L EDTA，100 mmol / L NaCI(2)50 mmol / L 苯甲基磺酰氟(PMSF )(3)10 mg / mL 溶菌酶(4)脱氧胆酸(5)1 mg / mL DNase I2 )超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )，100 mmol / L DTT，4 % SDS，0.2 % 溴酚蓝，20 % 甘油三．实验材料重组质粒感受态大肠杆菌实验步骤自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约15分钟，轻轻混匀。
质粒重组实验报告
质粒重组实验报告质粒重组实验报告引言：质粒重组是一种重要的实验技术，可以将外源基因导入到宿主细胞中，用于研究基因功能、蛋白质表达等方面。
本实验旨在通过质粒重组技术，将外源基因成功导入到大肠杆菌中，并通过酶切、连接、转化等步骤验证重组质粒的构建。
材料与方法：1. 外源基因：选择了编码了绿色荧光蛋白（GFP）的质粒pGFP。
2. 宿主细胞：采用大肠杆菌作为宿主细胞。
3. 酶切酶：使用限制酶EcoRI和BamHI进行酶切反应。
4. 连接酶：使用T4 DNA连接酶进行连接反应。
5. 培养基：含有抗生素的LB培养基。
实验步骤：1. 酶切反应：将pGFP质粒和EcoRI、BamHI酶切酶按照指定条件进行酶切反应，以得到线性化的质粒和目标基因片段。
2. 连接反应：将线性化的质粒和目标基因片段加入连接酶缓冲液中，按照指定条件进行连接反应，形成重组质粒。
3. 转化：将重组质粒加入含有大肠杆菌的培养基中，通过热激转化法使质粒进入细胞。
4. 筛选：将转化后的细胞均匀涂布在含有抗生素的LB平板上，筛选出含有重组质粒的菌落。
5. 验证：通过PCR、酶切等方法对筛选出的菌落进行验证，确认质粒重组成功。
结果与讨论：经过酶切、连接、转化等步骤，成功构建了质粒重组实验系统。
在LB平板上筛选出了多个抗生素耐受的菌落，表明转化成功。
通过PCR验证，检测到了目标基因片段的特异扩增带，证明重组质粒中成功导入了外源基因。
进一步进行酶切验证，发现重组质粒经过连接反应后，酶切位点发生改变，与未连接的质粒有明显差异。
这些结果表明，质粒重组实验成功构建了重组质粒，并将外源基因导入到大肠杆菌中。
质粒重组实验的成功对于基因功能研究和蛋白质表达具有重要意义。
通过重组质粒，可以将外源基因导入到宿主细胞中，进而研究其在生物体内的功能和表达情况。
例如，可以通过重组质粒实现基因敲除、基因表达调控等功能，从而深入了解基因在生物体内的作用机制。
同时，重组质粒还可以用于蛋白质表达，通过外源基因的转录和翻译，使宿主细胞产生目标蛋白质，用于研究其结构、功能等方面。
pet经典质粒pet系统是有史以来在大肠杆菌中表达重组蛋白
pET经典质粒pET系统是有史以来在大肠杆菌中表达重组蛋白的功能最强大的系统，也是现今原核表达方面使用最广泛的系统。
该系统中，目的基因被克隆到pET质粒载体上，受强噬菌体T7转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。
T7 RNA聚合酶机制十分有效：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。
尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过改变诱导物的浓度来降低表达水平。
降低表达水平常用以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。
该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。
用不含有T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可解决免因目的蛋白表达对宿主细胞的毒性造成的质粒不稳定难题。
两种T7启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白都能得以最优化表达。
可选质粒最经典的pET-28a, pET-30a和pET-32a质粒，应用最广，参考文献最多。
下表列出三个经典系列载体主要特性。
其中命名后带有(+)的载体含有f1复制区，可以制备单链DNA，适合突变及测序等应用。
pET-28a: T7lac启动子，高效及严谨型控制表达水平；N端His.Tag/T7.Tag融合标签，可利用His.Tag进行金属离子螯合层析纯化表达蛋白，也可利用T7.T ag融合标签进行基于抗体结合的亲和纯化；含凝血酶（Thrombin）蛋白酶切位点；pET-30a：T7lac启动子；N端His.Tag/S.Tag融合标签，可利用His.Tag进行金属离子螯合层析纯化表达蛋白，也可利用S.Tag融合标签进行亲和纯化及高灵敏度定量检测；含凝血酶（Thrombin）及肠激酶（Enterokinase）蛋白酶切位点；pET-32a：T7lac启动子；Trx融合蛋白表达载体，帮助表达蛋白形成二硫键，增加蛋白溶解性及活性；His.Tag/S.Tag融合标签。
将重组质粒导入大肠杆菌的方法
将重组质粒导入大肠杆菌的方法
将重组质粒导入大肠杆菌有多种方法，其中包括化学转化、电转化和共转化等。
1. 化学转化：通过将重组质粒与大肠杆菌细胞一起暴露在一种化学溶液中，使细胞发生渗透增强，从而使质粒能够进入细胞。
常用的化学转化方法有钙离子诱导法、聚乙二醇法等。
2. 电转化：通过利用强电场作用，使质粒能够通过细胞膜进入细胞。
将含有重组质粒的细胞与电极片一起置于电场中，施加脉冲电压，使细胞膜发生破裂，从而实现质粒的导入。
3. 共转化：将含有重组质粒的细胞与另一种质粒（例如载带质粒）一起转化，使质粒通过共转化机制进入细胞。
在共转化过程中，载带质粒的存在可以提高重组质粒的转化效率。
以上是常用的将重组质粒导入大肠杆菌的几种方法，具体使用哪种方法取决于实验需求和条件。
构建重组表达质粒pBV220／mhNT-4及mhNT-4在大肠杆菌中的表达
构建重组表达质粒pBV220／mhNT-4及mhNT-4在大肠杆菌中的表达张华1 赵家良1胡海涛2（1.中国医学科学院北京协和医院眼科，北京1007302.西安交通大学医学院神经生物学中心，西安 710061）中文摘要：利用基因重组技术将mhNT-4亚克隆到表达载体pBV220，构建重组表达质粒pBV220／mhNT-4，诱导表达mhNT-4成熟蛋白，鉴定mhNT-4的生物活性。
将经鉴定的pGEM-T Easy /mhNT-4克隆用限制性内切酶EcoR I,BamH I消化，琼脂糖凝胶电泳回收片断。
酶切原核高表达载体pBV220，用限制性内切酶EcoR I,BamH I消化，琼脂糖凝胶电泳回收线性化载体。
用T4 DNA连接酶连结两个回收片断，构建重组质粒pBV220／mhNT-4。
限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒。
经鉴定的重组质粒pBV220／mhNT-4转染大肠杆菌DH5α，温度诱导表达mhNT-4蛋白。
SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳技术分离表达的mhNT-4蛋白。
制备8~9d鸡胚，分离并培养背根神经节(DRG)细胞。
分别加入回收的表达蛋白和牛血清白蛋白，培养鸡胚背根神经节DRG细胞，检测mhNT-4生物活性。
重组表达质粒pBV220／mhNT-4构建正确，表达框架未发生改变。
成功诱导表达、分离了mhNT-4成熟蛋白。
表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织快周缘向四周呈放射状长出，对照组未见神经突起长出。
mhNT-4成熟蛋白具有良好的生物活性。
本研究为进一步开展mhNT-4基因治疗青光眼提供了资料。
关键词：人神经营养素-4成熟蛋白基因（mhNT-4）；基因重组；表达载体；生物活性青光眼是一种严重的致盲性眼病，是一组与视野缺损有关的具有特征性视神经病变的眼部疾病，以高眼压为危险因素之一。
青光眼的视神经病变和视野缺损，与视网膜神经节细胞及其轴突在视网膜和视神经缺损相关，阐明视网膜神经节细胞死亡过程中的细胞分子变化是目前一个活跃的研究领域，正被广泛应用于视网膜神经节细胞衰亡的机制研究中，并将为青光眼治疗带来新方法。
重组质粒热激法转化大肠杆菌方法
一、概述重组质粒热激法转化大肠杆菌作为一种重要的基因工程技术，在生物科学领域得到了广泛的应用。
通过该方法，可以将外源基因插入到大肠杆菌的质粒中，实现外源蛋白的大规模表达和纯化。
本文将介绍重组质粒热激法转化大肠杆菌的方法及其应用。
二、材料与仪器1. 大肠杆菌DH5α菌种2. 含有目的基因的重组质粒3. LB琼脂培养基4. 磷酸盐缓冲液（10mmol/L）5. 等温恒温水浴6. 离心管7. 紫外线杀菌灯8. PCR仪三、方法1. 制备大肠杆菌DH5α感受态菌种（1）在LB琼脂培养基中接种DH5α菌种，37℃孵育过夜。
（2）取一部分感受态菌种加入到10mmol/L磷酸盐缓冲液中制备预培养液。
2. 制备含有目的基因的重组质粒（1）从真核细胞中提取目的基因的DNA。
（2）将目的基因的DNA插入到质粒载体中，得到含有目的基因的重组质粒。
3. 热激法转化大肠杆菌（1）取一支含有预培养液的离心管，加入制备好的含有目的基因的重组质粒。
（2）将离心管放入等温恒温水浴中，以42℃恒温1.5分钟。
（3）将热激法转化后的菌液接种在LB琼脂培养基上，37℃孵育过夜。
四、结果与讨论通过重组质粒热激法转化大肠杆菌的方法，成功地将目的基因插入到大肠杆菌的质粒中，实现了外源基因的表达。
该方法简单、高效，适用于大规模的基因工程研究。
重组质粒热激法转化大肠杆菌在制备重组蛋白、研究基因功能等方面具有重要的应用价值。
五、结论重组质粒热激法转化大肠杆菌是一种常用的基因工程技术，可以有效地实现外源基因在大肠杆菌中的表达。
该方法具有操作简单、效率高的特点，适合进行大规模的基因工程研究。
相信在今后的生物科学研究中，重组质粒热激法转化大肠杆菌将继续发挥重要的作用。
六、优化条件尽管重组质粒热激法转化大肠杆菌方法具有高效、简单的优点，但在实际操作中仍然需要根据具体情况进行优化。
下面将介绍一些常见的优化条件。
1. 热激条件的优化在热激法转化过程中，温度、时间和离心速度等因素对转化效率有重要影响。
大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用
大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是常用的表达宿主。
利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而产生大量目标蛋白。
本文将介绍大肠杆菌表达载体的构建方法及其应用。
一、大肠杆菌表达载体的构建方法1. 选择适合的表达载体：常见的大肠杆菌表达载体包括pET系列、pBAD系列和pGEX系列等。
选择适合的表达载体主要考虑载体的复制起源、选择标记、表达调控元件和蛋白纯化标记等因素。
2. 克隆目标基因：将目标基因通过PCR扩增得到目标基因片段，然后利用限制性内切酶切割载体和目标基因片段，将目标基因片段插入载体中。
3. 进行质粒转化：将构建好的重组质粒导入大肠杆菌中。
可以通过化学法、电穿孔法或热冲击法等方法将质粒导入大肠杆菌中。
4. 筛选与鉴定：经过转化后，利用选择性培养基筛选出含有目标基因的重组大肠杆菌。
通过PCR、限制性酶切和测序等方法对重组菌株进行鉴定，确认目标基因已经成功插入载体。
二、大肠杆菌表达载体的应用1. 蛋白表达：利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而大量产生目标蛋白。
这对于研究蛋白的结构、功能及其在生物学过程中的作用具有重要意义。
2. 蛋白纯化：大肠杆菌表达载体常含有蛋白纯化标记，如His标签、GST标签等。
通过这些标记，可以方便地对目标蛋白进行纯化和检测，为后续研究提供了便利。
3. 蛋白互作研究：大肠杆菌表达载体可以用于蛋白互作研究。
通过将目标蛋白与其他蛋白共同表达，可以研究它们之间的相互作用关系，揭示生物学过程中的分子机制。
4. 疫苗研究：大肠杆菌表达载体可以用于疫苗研究。
将目标抗原基因导入大肠杆菌中进行表达，可以获得大量的抗原蛋白，从而用于疫苗的开发和研究。
5. 酶工程：大肠杆菌表达载体可以用于酶工程研究。
通过将目标酶基因导入大肠杆菌中表达，可以进行酶的产量优化、酶的工艺改造等研究，提高酶的生产效率和稳定性。
绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达分子实验设计
绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达张历涵2013141241098彭千2013141241068一、质粒转化入感受态细胞并培养1、原理实验室提供的质粒首先要转入大肠杆菌进行培养与增殖，制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。
所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
2、实验步骤2.1 DH-5α和BL-21感受态细胞的制备（1）将0~4 ℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 ℃下250 r/min过夜培养16 h 。
（2）将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 ℃活化培养2～3 h至OD=0.3～0.5 。
（3）取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 ℃下5000 r/min 离心5 min。
弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌。
冰上放置15-30 min后，4 ℃下5000 r/min离心10 min。
（4）弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20 ℃冰箱内保存。
2.2 感受态细胞的转化（1）取制备好的感受态细胞100 μl，冰上解冻，均匀悬浮。
（2）加入2 μl酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。
（3）42 ℃水浴中热击70 sec后，冰上放置2 min。
（4）加入200 μl LB液体培养基，37 ℃，50-100 rpm振荡培养1 h。
外源基因在大肠杆菌中诱导表达与检测
外源基因在大肠杆菌中诱导表达与检测原理目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶诱导。
T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。
在培养体系中加入IPTG 诱导T7 RNA 聚合酶生产，继而质粒上的目的DNA 开始转录。
本实验采用已经构建好的表达载体pET，该载体带有来源于古细菌的单链结合蛋白质（SSB）的序列，经IPTG的诱导，实现外源基因的表达，并通过SDS-PAGE对表达产物进行检测。
一、主要仪器、材料、和试剂1. 仪器恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，垂直板蛋白质电泳装置，生化培养箱，电泳仪，超净工作台，移液器。
2. 材料含有表达载体pET-28的BL21菌株。
3. 试剂IPTG 储液(200mg/ml)：在800μl 蒸馏水中溶解200mg IPTG 后，用蒸馏水定容至1ml，用0.22μm 滤膜过滤除菌，分装于离心管并储于-2 0℃。
二、操作步骤1．重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达将已经验证的带有SSB－pET28重组质粒的大肠杆菌BL21在含有卡那霉素LB的平板上划线培养。
挑取长出的单菌落接入液体LB试管中，加入卡那霉素至终浓度为50ug/mL，37℃摇床过夜。
按1％接种量接入100mL LB培养基，加入卡那霉素至终浓度为50ug/mL，37℃摇床培养至菌浓OD 600达到0.6左右，加入IPTG至终浓度为1mM，37℃摇床继续培养4h，诱导SSB蛋白表达。
每隔两个小时取样进行实验。
2. 蛋白质SDS—PAGE在蛋白溶液中加入样品缓冲液，100 oC处理5min，离心取上清5－15mL 点样。
于75V～100V电泳约2h，凝胶在考马斯亮兰G250染液中染色1h，在脱色液中脱色。
实验三 重组质粒DNA转化大肠杆菌
实验目的
学习将重组质粒DNA导入大肠杆菌的方法 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法 为下一步重组体筛选做准备
实验原理
遗传学中转化的基本含义是使细胞获得一新的可遗传的 表型性状。分子克隆中用人工的方法将重组质粒DNA导入大 肠杆菌细胞，使携带有重组质粒的大肠杆菌获得在抗生素平 板上生长的能力，从而与不携带重组质粒的的细菌区分开来 ，这个过程就是转化。
3. 复苏：向每管中加入800μl LB液体培养基(注：不含
Amp),混匀后在37℃150rpm轻摇培养1小时，使细菌恢
复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因
(Ampr )。
思考：热击后的细胞已吸入外源质粒，如本实验中的 pET32a，该质粒可赋予宿主氨苄青霉素抗性。但是为 什么复苏时用的LB培养液不加Amp？
按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂 ，待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至 7.0。121℃湿热高压灭菌20分钟，待冷却至60℃左右,在超净工作
台中加入一定量பைடு நூலகம்Amp储存液,使终浓度为100μg/ml,摇匀后用培养
皿铺板。
2、Amp母液：
实验报告
思考题
(1). 根据本实验你认为影响转化率的因素有哪些？ (2). 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落 ，你将如何解释这种现象？
实验中要考虑的重要因素
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：
1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次继代或储于４℃的培 养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制 备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为 好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为 0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同), 这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
蛋白的原核表达
蛋白的原核表达一、重组质粒在大肠杆菌中的表达1、将重组质粒和空载体质粒分别转化感受态大肠杆菌DE3。
转化步骤：1.1 从-70℃冰箱取出感受态细菌悬液，冰上解冻；1.2 加入质粒DNA溶液（不超过总体积10%）,轻轻摇匀，冰上放置30min;1.3 42℃水浴中热击60s,迅速置于冰上冷却10min；1.4 像管中加入1ml SOC,混匀后37℃振荡1h(使细菌恢复生长状态，并表达质粒编码的抗性基因）1.5 弃大部分上清，轻轻吹匀剩下的，涂布于含AMPr的LB筛选平皿上，待干后倒置，37℃培养16-24h。
2、挑取转化后的单个菌落，接种5ml含氨苄、氯霉素的LB培养基，37℃振荡培养。
3、当菌液OD600为0.6时（重组菌培养至对数期），加入IPTG终浓度至0.2 、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L,37℃诱导培养3h,以确定IPTG 对表达量的影响；在1.0mmol/LIPTG浓度下诱导培养2、3、4、5h，确定诱导时间对表达的影响；在1.0mmol/LIPTG浓度下，分别在30℃、25℃、20℃诱导培养3h,分析温度对可溶性蛋白的影响。
4、表达后取1ml菌液离心收集菌体，SDS-PAGE电泳。
5、电泳后转印到硝酸纤维素膜上，以2%BSA封闭2h，以标签蛋白/疟原虫单抗为一抗，HPR标记的羊抗鼠IgG 1:2000稀释为二抗，37℃各反应1h,洗涤后以DAB显色。
二、重组蛋白的纯化与复性1、离心收集经诱导表达重组200ml，重悬于PBS(含1mg/ml溶酶菌)中，冰浴30min.2、超声波破碎菌体，12000r/min,离心10min收集沉淀。
3、将沉淀用包涵体洗涤液（50mmol/L Tris-HCl PH8.0 ,1mmol/L EDTA,0.2%TritonX-100,2mol/L尿素），匀浆洗涤3次，12000r/min,离心10min收集沉淀。
4、用5ml包涵体变性液（50mmol/L Tris-HCl PH8.0 ，2mmol/L 2-ME,8mol/L 尿素）溶解沉淀，12000r/min,离心10min收集上清。
重组质粒在大肠杆菌中的表达
重组质粒在大肠杆菌中的表达1. 仪器耗材紫外分光光度计（配石英比色杯）、振荡摇床、超净台、细菌培养皿、20ml试管、250ml 三角烧瓶、移液枪、枪头。
2. 试剂及配制（1）LB培养基（100ml）：胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，定容至100ml，高压灭菌，4℃保存备用。
（2）LB平板（100ml，Kan+，50μg/ml）：胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，琼脂1.5 g，定容至100ml，高压灭菌，水浴调温至50-60℃，加入10mg/ml kan 500μl，旋转混匀，铺制平板（90mm直径的平皿约5个），4℃保存备用。
（3）10mg/ml kanamycin：称量0.5g kan，用蒸馏水溶解、定容至50ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装于高压灭菌的1.5 ml离心管中，每管1 ml，-20℃保存备用。
（4）1M IPTG：称量11.915g IPTG，用蒸馏水溶解、定容至50ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装于高压灭菌的1.5 ml离心管中，每管1 ml，-20℃保存备用。
3. 实验步骤（1）构建好的表达质粒转化表达菌株BL-21后，均匀涂布LB培养基平板（Kan+，50μg/ml），过夜培养（约12h）。
（2）挑取2-4个生长良好的单菌落，用20ml试管分别接种于3ml LB液体培养基（Kan+，50μg/ml）中，37℃、250rpm振荡过夜培养。
（3）把以上培养物接种新鲜的LB培养基（Kan+，50μg/ml），二者的体积比为1:100，并且总体积不能超过培养用三角瓶容积的1/5。
（4）37℃、250rpm振荡培养至对数生长中期（OD600约0.4～0.8），此细菌密度必须在1.5到3小时内达到。
（5）取出2ml培养物作为诱导前对照，在剩余培养物中加入IPTG，使终浓度为1mM（最佳用量需摸索），继续培养。
（6）诱导3小时后，取样1ml留存，之后每一小时取样1ml留存，直至8h诱导结束。
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重组质粒在大肠杆菌中的表达
1. 仪器耗材
紫外分光光度计（配石英比色杯）、振荡摇床、超净台、细菌培养皿、20ml试管、250ml 三角烧瓶、移液枪、枪头。
2. 试剂及配制
（1）LB培养基（100ml）：胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，定容至100ml，高压灭菌，4℃保存备用。
（2）LB平板（100ml，Kan+，50μg/ml）：胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，琼脂1.5 g，定容至100ml，高压灭菌，水浴调温至50-60℃，加入10mg/ml kan 500μl，旋转混匀，铺制平板（90mm直径的平皿约5个），4℃保存备用。
（3）10mg/ml kanamycin：称量0.5g kan，用蒸馏水溶解、定容至50ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装于高压灭菌的1.5 ml离心管中，每管1 ml，-20℃保存备用。
（4）1M IPTG：称量11.915g IPTG，用蒸馏水溶解、定容至50ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装于高压灭菌的1.5 ml离心管中，每管1 ml，-20℃保存备用。
3. 实验步骤
（1）构建好的表达质粒转化表达菌株BL-21后，均匀涂布LB培养基平板（Kan+，50μg/ml），过夜培养（约12h）。
（2）挑取2-4个生长良好的单菌落，用20ml试管分别接种于3ml LB液体培养基（Kan+，50μg/ml）中，37℃、250rpm振荡过夜培养。
（3）把以上培养物接种新鲜的LB培养基（Kan+，50μg/ml），二者的体积比为1:100，并且总体积不能超过培养用三角瓶容积的1/5。
（4）37℃、250rpm振荡培养至对数生长中期（OD600约0.4～0.8），此细菌密度必须在1.5到3小时内达到。
（5）取出2ml培养物作为诱导前对照，在剩余培养物中加入IPTG，使终浓度为1mM（最佳用量需摸索），继续培养。
（6）诱导3小时后，取样1ml留存，之后每一小时取样1ml留存，直至8h诱导结束。
（7）将不同诱导时间的菌样进行SDS-PAGE，分析蛋白的诱导表达情况。
（8）确定诱导表达条件后，进行大量培养。
4. 注意事项
（1）本实验步骤主要参考基于PET-28a构建的表达质粒。
（2）必须确保诱导前细菌在1.5～3h内达到对数生长中期，故需要原始培养物的稀释浓度为1:100或者1:50，这是非常关键的。
（3）诱导需要的温度、摇床转速、IPTG浓度，根据个人实验设计进行预试验确定最好的诱导条件，以达到最佳诱导表达效果。
（4）Kan的工作浓度一般为50-100μg/ml。
（5）配制含Kan的LB平板时，当培养基温度高于60℃时加入Kan，会导致Kan活性降低。
（6）配制抗生素长期保存应在-20℃，4℃可以保存数周。
（7）保存数周的平板上细菌活性会降低，需重新划板培养。
参考文献
1．J．萨姆布鲁克，D．W．拉塞尔著，黄培堂等译．分子克隆实验指南（第3版）[M]．北京：科学出版社，2002．1217-1232
2．J E．科林根等著，李慎涛等译．精编蛋白质科学实验指南[M]．北京：科学出版社，2007．90-96，587。