重组质粒在大肠杆菌中的表达

重组质粒在大肠杆菌中的表达

1. 仪器耗材

紫外分光光度计（配石英比色杯）、振荡摇床、超净台、细菌培养皿、20ml试管、250ml 三角烧瓶、移液枪、枪头。

2. 试剂及配制

（1）LB培养基（100ml）：胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，定容至100ml，高压灭菌，4℃保存备用。

（2）LB平板（100ml，Kan+，50μg/ml）：胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，琼脂1.5 g，定容至100ml，高压灭菌，水浴调温至50-60℃，加入10mg/ml kan 500μl，旋转混匀，铺制平板（90mm直径的平皿约5个），4℃保存备用。

（3）10mg/ml kanamycin：称量0.5g kan，用蒸馏水溶解、定容至50ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装于高压灭菌的1.5 ml离心管中，每管1 ml，-20℃保存备用。

（4）1M IPTG：称量11.915g IPTG，用蒸馏水溶解、定容至50ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装于高压灭菌的1.5 ml离心管中，每管1 ml，-20℃保存备用。

3. 实验步骤

（1）构建好的表达质粒转化表达菌株BL-21后，均匀涂布LB培养基平板（Kan+，50μg/ml），过夜培养（约12h）。

（2）挑取2-4个生长良好的单菌落，用20ml试管分别接种于3ml LB液体培养基（Kan+，50μg/ml）中，37℃、250rpm振荡过夜培养。

（3）把以上培养物接种新鲜的LB培养基（Kan+，50μg/ml），二者的体积比为1:100，并且总体积不能超过培养用三角瓶容积的1/5。

（4）37℃、250rpm振荡培养至对数生长中期（OD600约0.4～0.8），此细菌密度必须在1.5到3小时内达到。

（5）取出2ml培养物作为诱导前对照，在剩余培养物中加入IPTG，使终浓度为1mM（最佳用量需摸索），继续培养。

（6）诱导3小时后，取样1ml留存，之后每一小时取样1ml留存，直至8h诱导结束。（7）将不同诱导时间的菌样进行SDS-PAGE，分析蛋白的诱导表达情况。

（8）确定诱导表达条件后，进行大量培养。

4. 注意事项

（1）本实验步骤主要参考基于PET-28a构建的表达质粒。

（2）必须确保诱导前细菌在1.5～3h内达到对数生长中期，故需要原始培养物的稀释浓度为1:100或者1:50，这是非常关键的。

（3）诱导需要的温度、摇床转速、IPTG浓度，根据个人实验设计进行预试验确定最好的诱导条件，以达到最佳诱导表达效果。

（4）Kan的工作浓度一般为50-100μg/ml。

（5）配制含Kan的LB平板时，当培养基温度高于60℃时加入Kan，会导致Kan活性降低。

（6）配制抗生素长期保存应在-20℃，4℃可以保存数周。

（7）保存数周的平板上细菌活性会降低，需重新划板培养。

参考文献

1．J．萨姆布鲁克，D．W．拉塞尔著，黄培堂等译．分子克隆实验指南（第3版）[M]．北京：科学出版社，2002．1217-1232

2．J E．科林根等著，李慎涛等译．精编蛋白质科学实验指南[M]．北京：科学出版社，2007．90-96，587