黄酮类化合物

黄酮测定的研究进展

简要：黄酮类化合物（Flavonoids），又称生物黄酮（Bioflavon-oids）或植物黄酮，是植物在长期自然选择过程中产生的一些次级代谢产物，黄酮类化合物有着广泛的生物活性和多种药理活性，比如抗氧化、抗炎、抗诱变、抗肿瘤形成与生长等，特别是近年来关于黄酮在心血管、脑血管、肿瘤等方面的研究已经比较深入，此外黄酮类物质还有低毒性的特点，因此长期以来一直是天然药物和功能性食品研究开发的热点[1]。

关键词：黄铜，含量，测定方法，研究进展

前言：黄酮类物质是植物光合作用产生的一种天然有机物。植物界中分布广泛，主要分布于芸香料、唇形科、豆科、伞形科、银杏科、菊科等。根据化学方法定义黄酮类物质为含一个共同的苯基苯并二氢吡喃环结构，有一个或多个羟基取代基，包括其衍生物。在食物中，黄酮类物质一般以酯类、醚类或配糖类衍生物及混合物的形式存在，共有5000 多种化合物。对于哺乳动物，只能通过饮食获取黄酮物质，这些食物包括水果、蔬菜、谷物、坚果、茶及红酒。在日常膳食中，黄酮类物质通常表现为具有抗氧化性的羟基衍生物形态，显示出多种生物活性，对于一些疾病，例如癌症和心血管疾病，胃和十二指肠的病理性失调，以及病毒和细菌感染的预防和治疗。此外，类黄酮还被发现有广泛的药物特性，包括抗氧化性、抗过敏、抗病毒及预防糖尿病，对肝和胃的保护，抗病原体及抗瘤活性。除在医药工业上已广泛应用其生理活性外，目前也将黄酮类物质作为功能食品的添加剂[2] 。

（一）测定黄铜的几种方法

1 紫外分光光度法

紫外分光光度法具有重复性好、准确、简便、易掌握、不需要复杂的仪器设备, 加之所需试剂便宜易得, 因此该方法应用于测定植物中黄酮含量最为广泛[ 3]。

1.1 直接测定法

大多数黄酮类化合物分子中存在桂皮酰基和苯甲酰基组成的交叉共轭体系, 其MeOH 谱200 nm～400 nm的区域内存在两个主要的紫外吸收带, 峰带I(300 nm～400nm)和峰带Ⅱ( 220 nm～280 nm)[ 4]。

1.2 比色法

向供试样品中加入显色剂后测定吸光度以测定其含量, 这种方法称为比色法。黄酮类化合物分子中若具有3- 羟基、5- 羟基或邻二酚羟基, 易于与金属盐类如铝盐、锆盐、锶盐、镁盐等反应, 生成有色金属络合物。常用于黄酮类化合物含量测定的金属盐试剂有Al(NO3)3、A1Cl3等,这些络合物作用在光

谱上能产生明显的变化, 吸收峰红移, 同时生成的各种Al3+络合物的稳定性不同。稳定性规律为: 黄酮醇3-羟基>黄酮5-羟基>二氢黄酮5- 羟基>邻二酚羟基>二氢黄酮醇3- 羟基。其中从邻二酚羟基以后与Al3+形成的络合物不稳定, 加入少量酸水(如HCl)可分解, 使相应光谱紫移, 而前三种络合物稳定, 不能被分解,故加入HCl 后仍表现为相应峰带红移, 可用于定量法测定黄酮含量[ 5]。

1.3 差示分光光度法

差示分光光度法简称ΔA法, 使用稍高于样品或稍低于样品的标准作参比, 测量样品和参比间的相对吸光度。而此相对吸光度又与样品和参比间的浓度差成比例关系, 借差示工作曲线而求出样品的含量[6]。在黄酮类化合物测定中, 由于叶类植物中含有大量的叶绿素干扰测定, 虽然用石油醚处理样品可除去大量叶绿素, 但由于植物成分的复杂性, 在黄酮类成分主要吸收范围内仍可能有其它成分产生吸收而干扰测定。差示分光光度法利用样品溶液中黄酮类成分与A1Cl3络合后, 在特征吸收波长处吸光度值发生显著变化, 所测得的络合前后的吸光度差值与样品中黄酮类成分在一定浓度范围内呈线性关系, 而样品中共存的其它组分(如叶绿素)由于在此波长下不发生吸收性质改变, 因而对测定无影响, 可较好解决背景吸收的问题。而且实验表明, 采用差示分光光度法测定, 当叶绿素含量较低时, 甚至可省略除叶绿素这一步骤, 因而使测定方法更加简便[7]。

1.4 双波长和导数分光光度法

双波长法是分光光度法新发展的一种方法。它可用于测定吸收光谱曲线重达的混合物的含量而不须用解联调研综述92008年第 3 期总第134 期J IANG SU SHI PIN YU FA J IAO立方程, 还可分析高浓度及混浊样品, 其灵敏度和准确度比普通分光光度法好。在选择波长时, 原则上除了要干扰物有相等吸光度外, 还要求两波长比较接近, 被测组分在该两波长处的摩尔吸收系数相差大些, 这样方法的灵敏度会更高。如果将上述双波长分光光度计上两个波长尽可能指近, 使只相差1～ 2 nm, 并且同时进行扫瞄, 能得到试样一阶导数吸收光谱-吸光度对波长的变化率曲线, 即导数分光光度法。

2 薄层扫描法

薄层扫描法(TLC- Scanning method)亦称薄层光密度法(TLC- Densitometry),是薄层色谱技术与光密度计和微型电子计算机结合起来的一种新型仪器分析方法。薄层扫描法是将样品先经薄层分离后, 然后用一束长宽可以调节的一定波长、一定强度的光照射到薄层斑点上进行整个斑点的扫描, 用仪器测量通过斑点或被斑点反射的光束强度的变化达到定量的目的。应用薄层扫描仪可同时对各种复杂的样品进行分离和测定, 简便快速、灵敏准确、专属性好。近年来利用薄层扫描法定量测定植物中黄酮成分的研究很多[8]。

3 高效液相色谱法

高效液相色谱法是在液相色谱的基础上引入气相色谱的理论和技术, 并加以改进而发展起来的一种重要的分离分析方法, 具有分离效能高, 分析速度快, 灵敏度高等特点。高效液相色谱法在使用中, 以C18柱与C柱最为常用, 柱内填充粒径以10、 5 um用的最多。由于黄酮类化合物常带有酚羟基, 在水中会部分解离, 而未解离的羟基与固定相作用较强, 从而导致拖尾, 所以黄酮类的反相高效液相色谱( RP- HPLC)中需要加入酸来调节pH 值以抑制解离、克服拖尾现象[9]。自高效液相色谱法应用于黄酮类的分析以来, RP- HPLC一直扮演着中心角色, 流动相以甲醇-水、乙腈-水体系应用最为广泛。

4 荧光光度法