一种乳酸菌的检测鉴定方法
微生物的常规检验技术--乳酸菌的检验
四、乳酸菌的检验
４ 检验程序
四、乳酸菌的检验
５ 操作步骤--样品制备 ➢ 样品制备无菌操作程序： ➢ 第一步：冷冻样品 可先使其在2~5℃条件下解冻，时间不超过18h,也可在温度不超 过45℃的条件下解冻，解冻时间不超过15min； ➢ 第二步：固体和半固体食品 以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的 无菌均质杯内，8000 ~ 10 000 r/min均质1 ~ 2min，制成1:10样品匀液； ➢ 第三步：液体样品 应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生 理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇,制成1:10的样 品匀液； ➢ 第四步：用1mL无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水 的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹 打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液； ➢ 第五步：另取1mL无菌吸管，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液,每递增稀释一次， 即换用1次1mL灭菌吸管。
➢ 双歧杆菌培养:根据待检样品双歧杆菌含量的估计，选择2~3个连续的适宜稀释度，每个稀
释度吸取0.1mL样品匀液于莫匹罗星锂盐改良 MRS琼脂平板，表面涂布，每稀释度做
两个平板。36℃±1℃，厌氧培养48h ±2h后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释
到平板涂布要求在15min内完成；
➢ 嗜热链球菌培养:根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2~3个连续的适宜稀释度,每
培养皿1 培养皿2 平均数
乳酸菌菌株鉴定
分子生物学实验作业——用分子生物学方法鉴定菌株专业：生物化工姓名：王晓娜学号：1043111039鉴定一株乳酸菌菌株一、实验目的和方法采用RAPD指纹图谱方法鉴定一株乳酸菌菌株二、实验材料2.1 菌株实验给定的菌株2.2 试剂Taq DNA聚合酶、DNA电泳buffer、引物、dNTP、模板DNA2.3 仪器台式离心机，PCR仪，稳压稳流电泳仪，紫外检测仪，凝胶成像系统三、实验步骤3.1 制备细菌DNA样品收集菌悬液于1.5mlepp管中，5 000r/min离心5min。
去上清，在沉淀中加入567微升 TE缓冲液、30微升10％的SDS、5微升10mg/ml 的溶菌酶后，37℃水浴3h。
再加入3微升20mg/ml的蛋白酶K，37℃水浴lh。
加入100微升5mol/l NaCl，80微升CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10min。
加入等体积的氯仿／异戊醇，12 000r/min离心5min。
取上清，加入等体积酚／氯仿／异戊醇，12 000r／min离心5min。
取上清，加入2倍体积的冰乙醇，12 000r/min离心10rnin，沉降DNA。
去上清，将沉淀吹干，用100微升TE缓冲液(pH8．0)溶解。
取l微升 DNA样品，稀释200倍后，紫外测定0D260和0D280。
选取浓度1．8≤0D26l／0D280≤2．0的样品。
然后，将DNA浓度稀释至48ng/µl作为模板备用。
3.2 PCR反应扩增体积为25µl (含TapDNA聚合酶2u，10×PCR reaction buffer 2µl，dNTP 2µl，引物lµl，模板DNA 1µl)。
扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，38℃复性lmin，72℃延伸2min，进行40个循环后72℃延伸10min。
取12µl扩增产物进行电泳，电压为100V，琼脂糖凝胶为l％(0．5×TBE)电泳30—40min，用凝胶成像系统观察电泳结果并拍照。
乳酸菌鉴定方法
乳酸菌鉴定方法嘿，你问乳酸菌的鉴定方法哈。
那我们得先从形态学方面入手。
把含有乳酸菌的样本放在显微镜下观察。
乳酸菌的形状有点特别，大多数是杆状或者球状的。
就像一个个小卫士，在微观世界里排着队。
你可以看看它们的大小，一般都比较小，得仔细观察才能看清它们的模样。
有的乳酸菌还会连在一起，像一串串小珠子似的。
再说说菌落特征。
把乳酸菌接种到固体培养基上，让它们生长繁殖。
过一段时间后，你会看到培养基上长出了一个个小菌落。
乳酸菌的菌落通常比较小，而且表面光滑、湿润。
有点像小小的露珠落在培养基上。
颜色一般是白色或者乳白色的，看起来很干净。
接着讲讲生化反应鉴定。
乳酸菌能发酵一些糖类，比如葡萄糖、乳糖等。
我们可以通过检测它们发酵糖类产生的产物来鉴定。
比如检测有没有产生乳酸，因为乳酸菌的名字可不是白叫的，它们可是产乳酸的能手。
可以用一些化学试剂来检测，要是试剂变色了，那就说明产生了乳酸。
还有一个方法是通过分子生物学技术来鉴定。
这就有点像用高科技手段来识别乳酸菌。
提取乳酸菌的DNA，然后用特定的引物进行PCR 扩增。
就像给乳酸菌的DNA 做个标记，这样就能准确地知道是不是乳酸菌了。
我给你讲个事儿哈。
在一家做酸奶的工厂里，他们很关心酸奶里的乳酸菌。
有一次，他们怀疑酸奶里的乳酸菌有点问题，就开始进行鉴定。
先把酸奶样品放在显微镜下看，发现有很多球状的小东西，看着像是乳酸菌。
然后把样品接种到培养基上，长出了好多小菌落，菌落的特征和乳酸菌的很像。
接着他们又做了生化反应测试，发现这些菌确实能发酵乳糖产生乳酸。
最后还不放心，又用分子生物学技术验证了一下，确定就是乳酸菌。
这样他们就放心了，知道自己的酸奶里有足够的、正宗的乳酸菌。
在鉴定乳酸菌的时候，每一个方法都很重要。
就像我们认识一个人，要从不同的方面去了解。
不能只看外表，还得看看他的行为、习惯等。
鉴定乳酸菌也是一样，综合运用这些方法，才能准确地鉴定出乳酸菌。
而且操作过程要仔细，不能马虎，不然就可能得出错误的结论。
乳酸菌菌种的分离筛选原理
乳酸菌菌种的分离筛选原理乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的益生菌，广泛应用于食品、饲料、医药等领域。
乳酸菌菌种的分离筛选是乳酸菌应用研究中的重要一环，其目的是从大量的混合菌群中筛选出具有优良特性的菌株。
乳酸菌菌种的分离筛选原理主要包括以下几个方面：1. 选择合适的培养基：乳酸菌菌种对营养要求较高，因此选择适宜的培养基是分离筛选的首要步骤。
常用的培养基有MRS培养基、DC培养基等，它们含有适宜乳酸菌生长的营养成分，能提供所需能量和营养物质。
2. 适宜的培养条件：乳酸菌对培养环境的温度、pH、氧气和二氧化碳等条件有一定要求。
通常情况下，乳酸菌分离筛选需要在适宜的温度（一般为30-40）下进行，pH值保持在4.5-7.0之间，氧气和二氧化碳含量适中。
3. 分离方法：乳酸菌菌种的分离常采用传统的分离培养技术，如层析法、稀释平板法、摇瓶培养法等。
其中，层析法是一种常用的快速分离方法，通过将混合菌群在筛选培养基上涂抹或刺激，使不同菌株在筛选培养基上形成分离的菌落。
4. 鉴定鉴别：乳酸菌菌种的筛选与鉴定是不可分割的一步，只有确定菌株的种属和特性才能真正确认其乳酸菌的菌种类型。
目前，常用的鉴定方法包括形态学观察、生理和生化特性检测、分子生物学方法（如PCR技术、16S rDNA序列分析）等。
在乳酸菌菌种的分离筛选过程中，还需要注意以下几个问题：1. 选择样品：样品的选择对于乳酸菌菌种的分离筛选至关重要。
通常情况下，从乳制品、肠道、土壤等环境中寻找潜在的乳酸菌菌种，可以提高分离到优良菌株的几率。
2. 优化培养条件：对于特殊的乳酸菌菌种，可能需要优化培养条件，如调整温度、添加特定的营养成分等，以促进其生长和繁殖。
3. 评价筛选结果：乳酸菌菌种的分离筛选结果需要综合考虑其特性和应用价值。
如菌株的酸奶生产能力、耐酸碱能力、抗菌能力、抗氧化能力等。
总结起来，乳酸菌菌种的分离筛选原理主要包括选择合适的培养基和培养条件、采用适当的分离方法和鉴定鉴别技术。
乳酸菌的分离与筛选具体实验流程
乳酸菌的分离与筛选具体实验流程1. 引言1.1 背景介绍乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的细菌，它们能够以乳酸为代谢产物进行无氧发酵，并且在食品工业、农业和医学领域具有重要的应用价值。
乳酸菌不仅能够促进食品品质的改善和保鲜，还对人体健康具有积极影响。
然而，目前市面上存在许多商业化的乳酸菌制剂，其有效成分及效果并不尽相同。
因此，研究和筛选出优质活性的乳酸菌种类，具有重要意义和广阔前景。
1.2 研究意义本研究旨在通过分离与筛选方法得到高活性的乳酸菌。
通过该研究可以加深我们对乳酸菌及其作用机制的理解，并为特定领域如食品工业、农业等提供先进的技术支持和解决方案。
此外，筛选出具有优良特性的乳酸菌株也将为开发新型功能性食品、生物农药等领域的产品提供重要支持。
因此，本研究对于推动食品工业、农业发展具有积极意义。
1.3 实验目的本实验主要目的如下：- 收集和处理样品：收集富含乳酸菌的样品，并经过适当处理以提高分离效果。
- 选择与制备分离培养基：根据乳酸菌的特性选择适合的培养基并进行制备。
- 设定分离培养条件：通过调控温度、pH值等参数，确定适宜的乳酸菌分离培养条件。
- 鉴定活性乳酸菌指标：确定评价乳酸菌活性和质量的指标，并进行相关试验和检测。
- 设计与实施筛选试验：根据所选指标设计筛选试验，并在实验中采用相应方法进行实施。
- 可行性评估与结果分析：对筛选试验结果进行评估和分析，并总结可行性及相关优化建议。
通过以上实验流程，我们旨在深入了解乳酸菌的特点及其在不同领域中应用潜力，并为进一步研究和开发具有市场竞争力的乳酸菌产品提供理论和实践基础。
2. 乳酸菌的分离方法2.1 样品收集与处理在乳酸菌的分离研究中，样品的选择和处理十分重要。
我们可以选择不同来源的样品，如发酵食品、生态环境等。
收集样品后，需要进行适当的处理以消除非目标微生物对于乳酸菌生长和筛选的干扰。
常见的样品处理方法包括冷藏、过滤、稀释等。
2.2 分离培养基选择与制备为了促进乳酸菌的分离和生长，在实验中需要选择适宜的分离培养基。
乳酸菌的检测实训报告
一、实训目的本次实训旨在通过实验操作，掌握乳酸菌的检测方法，了解乳酸菌的基本特性，提高对微生物检测技术的实际操作能力，并加深对乳酸菌在食品、医药等领域的应用认识。
二、实训时间2023年10月25日至2023年11月5日三、实训地点生物实验室四、实训内容1. 乳酸菌样品的采集与处理2. 乳酸菌的分离纯化3. 乳酸菌的形态观察4. 乳酸菌的生理生化特性鉴定5. 乳酸菌产酸能力的测定五、实训方法1. 乳酸菌样品的采集与处理（1）采集：从市场上购买含有乳酸菌的酸奶、酸奶饮料等样品。
（2）处理：将样品用无菌生理盐水进行梯度稀释，制成系列稀释液。
2. 乳酸菌的分离纯化（1）平板划线法：将稀释后的样品涂布在MRS平板上，用无菌接种针进行划线。
（2）培养：将平板置于37℃恒温培养箱中培养24小时。
（3）挑取单菌落：根据菌落的特征，挑取疑似乳酸菌的单菌落。
3. 乳酸菌的形态观察（1）制作临时玻片：将挑取的单菌落涂布在载玻片上，用无菌盖玻片覆盖。
（2）显微镜观察：在显微镜下观察乳酸菌的形态、大小、排列等特征。
4. 乳酸菌的生理生化特性鉴定（1）革兰氏染色：将挑取的单菌落涂布在载玻片上，进行革兰氏染色。
（2）生化反应：进行糖发酵试验、氧化酶试验、V-P试验等。
5. 乳酸菌产酸能力的测定（1）制作MRS培养基：按照实验要求配制MRS培养基。
（2）接种：将挑取的单菌落接种于MRS培养基中。
（3）培养：将培养皿置于37℃恒温培养箱中培养24小时。
（4）测定pH值：使用pH计测定培养基的pH值，计算产酸能力。
六、实训结果与分析1. 乳酸菌样品的采集与处理采集了5个样品，均成功制成系列稀释液。
2. 乳酸菌的分离纯化共分离纯化出10个疑似乳酸菌的单菌落。
3. 乳酸菌的形态观察在显微镜下观察到乳酸菌为杆状，大小约为0.5～1.0μm，排列呈链状。
4. 乳酸菌的生理生化特性鉴定10个疑似乳酸菌均呈革兰氏阳性，能发酵乳糖，不产生硫化氢，氧化酶试验阴性。
食品中乳酸菌的筛选与活性鉴定
食品中乳酸菌的筛选与活性鉴定乳酸菌是一类对人体健康具有益处的细菌，在许多食物中都可以找到它们的踪迹。
从酸奶到发酵食品，乳酸菌都发挥着重要的作用。
然而，如何筛选出具有较高活性的乳酸菌，并对其进行鉴定，这是一个令人感兴趣的话题。
首先，我们需要选择适当的食品样本进行筛选。
常见的食品包括酸奶、奶酪、纳豆等发酵产品。
这些食品中含有大量的乳酸菌，因此是我们进行筛选的理想选择。
此外，还可以考虑其他一些食物，如蔬菜和肉类，它们也可能含有乳酸菌。
接下来，我们需要从样本中分离出乳酸菌。
这可以通过培养基选用和分离培养来实现。
培养基的选用非常重要，它应提供乳酸菌所需要的营养物质。
我们可以选择常用的乳酸菌培养基，如MRS培养基。
通过将样品接种于MRS培养基中，我们可以让乳酸菌生长并形成可见的菌落。
然后，通过将这些菌落转移至其他培养基中，可以进行单菌落分离，确保我们获得的是纯种的乳酸菌菌株。
鉴定乳酸菌的活性也是我们的重点之一。
活性乳酸菌可以产生乳酸、酶和抗菌物质，这些物质对人体健康有益。
因此，我们想要筛选出活性较高的乳酸菌菌株。
常见的活性鉴定方法包括测定乳酸产量、酶活性和抗菌活性。
乳酸产量是乳酸菌活性的重要指标之一。
我们可以通过高效液相色谱法（HPLC）来测定乳酸的含量。
通过将培养基或发酵物转移到HPLC系统中，我们可以分析出乳酸的浓度。
通过与不同菌株之间的比较，我们可以确定哪些菌株产乳酸的能力更强。
酶活性是另一个衡量乳酸菌活性的重要指标。
乳酸菌常常能够产生多种酶，如蛋白酶和纤维素酶。
我们可以使用相应的酶活性试剂盒来检测其酶活性。
高酶活性的乳酸菌意味着它们能够更好地消化蛋白质和纤维素，从而提高食物的可消化性和营养吸收能力。
除了乳酸和酶活性外，抗菌活性也是评估乳酸菌活性的重要指标之一。
乳酸菌可以产生抗菌物质，对抗病原菌的侵袭。
我们可以通过抗菌活性试验来评估乳酸菌的抗菌能力。
将不同乳酸菌菌株与病原菌一起接种在琼脂平板上，观察是否形成抑制区域。
乳酸细菌分类鉴定及实验方法
乳酸细菌分类鉴定及实验方法乳酸细菌是一类可以发酵果糖或蔗糖产生乳酸的革兰氏阳性细菌。
它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、动物肠道、植物表面等环境中，并且在食品加工、乳制品、膳食补充剂等领域具有重要的应用价值。
分类鉴定乳酸细菌的方法主要包括传统分离鉴定和分子生物学方法，而实验方法主要包括培养、生理生化鉴定和分子鉴定等。
1.传统分离鉴定传统分离鉴定是通过培养、生理生化特性的观察和细菌形态学特征的分析来进行分类鉴定的方法。
一般的步骤包括：1.2分离：采用适当的培养基，如MRS培养基等，在适当条件下进行分离培养。
可以采用不同的稀释度和培养温度来增加分离率和适应性。
1.3纯化：从培养出的菌落中选择纯净的菌落进行纯化。
1.4形态学观察：观察细菌的形态学特征，如菌落形态、细胞形态、孢子形态等。
1.5生理生化特性鉴定：通过生理生化实验，如氧需氧性、产气、产酸、碱性产蛋白酶等特性的鉴定来进一步确定细菌的分类。
1.6比较分析：将鉴定结果与已知的乳酸菌进行比较分析，以确定菌株的分类。
2.分子生物学方法分子生物学方法是一种快速、准确的分类鉴定方法，可以通过检测细菌的DNA序列来进行鉴定。
常用的分子生物学方法包括PCR、16SrRNA测序和随机扩增多态性DNA(RAPD)等。
2.1PCR：PCR是通过扩增细菌DNA的特定区域来进行鉴定的方法。
首先，从培养的细菌中提取DNA。
然后，使用特定引物扩增目标区域的DNA，并通过凝胶电泳分析PCR产物的大小。
比较PCR产物的片段大小和带型模式，可以确定乳酸菌的分类。
2.216SrRNA测序：细菌的16SrRNA序列是一个高度保守的基因序列，可以用来进行细菌分类鉴定。
通过提取DNA，扩增16SrRNA基因片段，并进行测序，然后将测序结果与已知的乳酸菌序列比对，可以确定细菌的分类。
2.3RAPD：RAPD是一种无须事先了解目标序列的技术，它利用随机引物扩增细菌DNA的多态位点，通过凝胶电泳分析不同样品间的DNA带型模式，来进行菌株分类。
乳酸片球菌检测标准
乳酸片球菌检测标准
乳酸片球菌的检测标准包括以下几个方面：
1. 菌落形态：菌落直径～，呈乳白蓝色、圆形隆起、边缘整齐、有光泽、无透明圈。
2. 菌体形态：菌体呈球杆、成对、四联状、成片排列，大小为～μm。
3. 革兰氏染色：G+。
4. H2O2酶试验：阴性。
5. 运动性试验：不运动。
6. 硝酸盐试验：阴性。
7. 生长温度：在350℃、400℃、500℃均生长。
8. 生长pH值：在、生长，不生长。
9. 耐盐性：在%NaCl、%NaCl生长，18%NaCl不生长。
10. 发酵糖类：发酵阿拉伯糖、核糖和木糖产酸，不发酵鼠李糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、糊精、淀粉、甘油、甘露醇等。
11. 毒素检测：乳酸片球菌中的乳酸片球菌素是该菌唯一的毒力因子，也是其主要的抑菌物质，通过检测乳酸片球菌素可以确定乳酸片球菌的存在。
12. 其他指标：乳酸片球菌的乳酸片球菌素产生不受培养基成分和pH值的影响，但其产生受温度和培养时间的影响。
在30℃以下培养时乳酸片球菌
素产生量较少，在37℃左右培养时产生量最大，温度高于40℃时则不再产生乳酸片球菌素。
培养时间越长，产生的乳酸片球菌素越多。
以上是乳酸片球菌的检测标准，根据这些标准可以对乳酸片球菌进行准确、全面的检测和评估，以保证产品的安全性和有效性。
乳酸菌的鉴定
乳酸菌的鉴定吲哚试验1）.试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管2支，分别标记乳酸菌和空白对照。
2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37摄氏度恒温箱中培养24~48小时。
3）.观察记录：在培养基中加入乙醚1~2 ml ,经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。
糖发酵试验1）.试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。
2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。
将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37摄氏度恒温培养箱中培养24小时，观察结果。
3）.观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。
培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应。
1.2.3 乳酸的检测选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发酵液的上清液约10 ml于试管中，加入10%硫酸1 ml ,再加2%高锰酸钾 1 ml ,此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中，微火加热试管至沸，观察滤纸变化。
1.结果和分析2.1 乳酸菌的分离提纯在平板上出现了圆形稍扁平的黄色菌落，周围培养基变为黄色，初步定为乳酸菌⑴，取出少量在显微镜下观察到了链球状和杆状两种形状（如图一2.2乳酸菌的鉴定该菌种的菌落为圆形稍扁平的黄色菌落，有杆状和链球状两种形状。
在吲哚试验中，加入菌种的试管无任何变化，证明为阴性反应（如图二）。
说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。
也说明此菌种不是大肠杆菌，因为大肠杆菌的吲哚试验证明为阳性。
在糖发酵试验中，在加入葡萄糖的发酵培养液中加入菌种后，培养液变为黄色，反应结果为阳性，且杜氏小管内无气泡（如图三）；加入蔗糖的发酵培养液中加入菌种后的反应结果也为阳性且杜氏小管内无气泡（如图四）。
实验一乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物检验
引言概述：乳酸菌饮料是一种富含乳酸菌的食品，乳酸菌在食品工业中广泛应用于酸奶、乳饮料等产品中。
本文将详细介绍乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物检验方法。
正文内容：一、样品采集和制备1.确定样品采集时机：乳酸菌饮料中的乳酸菌数量会随着储存时间的增加而增加或减少，因此需要在存储时间稳定的情况下进行采集。
2.采集样品方法：使用无菌技术采集样品，避免外部微生物的污染。
3.样品制备：将采集到的样品进行均匀搅拌，以保证样品的均匀性。
二、总菌数检验方法1.琼脂平板法：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，在琼脂平板上涂布，经过一定孵育时间后，根据菌落的数量计算总菌数。
2.膜过滤法：将样品通过膜过滤器过滤，将过滤后的膜放置在琼脂平板上孵育，根据菌落的数量计算总菌数。
三、乳酸菌检验方法1.培养基选择：根据乳酸菌的生长特性选择适合的培养基，常见的培养基有MRS培养基、LBS培养基等。
2.乳酸菌的分离：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，均匀涂布在选定的培养基上。
经过一定孵育时间后，可以观察到乳酸菌形成的菌落。
3.鉴定乳酸菌：使用形态学观察、生理生化试验和分子生物学方法等进行乳酸菌的鉴定。
四、活菌数检验方法1.孵育培养基法：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，均匀涂布在含有乳酸菌生长所需营养物质的培养基上。
经过一定孵育时间后，观察活菌的生长情况，计算活菌数。
2.阻碍培养基法：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，与含有抑制剂的培养基混合。
通过观察生长情况，计算活菌数。
五、质量指标评价方法1.pH值测定：使用pH计或试纸对乳酸菌饮料中的pH值进行测定，根据标准范围评价产品的质量。
2.乳酸浓度测定：使用乳酸测定仪器或化学试剂对乳酸菌饮料中的乳酸浓度进行测定，根据标准范围评价产品的质量。
3.品尝评价：通过专业的品尝人员进行品尝评价，评估乳酸菌饮料的口感和风味。
总结：乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物检验方法包括样品采集和制备、总菌数检验、乳酸菌检验、活菌数检验和质量指标评价方法。
乳酸杆菌实验报告
一、实验目的1. 掌握乳酸杆菌的分离与纯化方法。
2. 了解乳酸杆菌的形态特征和生理特性。
3. 鉴定乳酸杆菌的种类。
二、实验原理乳酸杆菌是一种革兰氏阳性菌，属于乳酸菌，广泛存在于自然界中，如土壤、水体、植物和动物体内。
在人体肠道中，乳酸杆菌具有重要的生理功能，如调节肠道菌群平衡、增强机体免疫力、降低胆固醇、促进消化等。
本实验通过分离纯化乳酸杆菌，观察其形态特征和生理特性，并对其进行鉴定。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 土壤样品- MRS培养基- 琼脂糖- 酵母提取物- 葡萄糖- 乳糖- 麦芽糖- 蛋白胨- 氯化钠- 酚红指示剂- pH试纸- 显微镜- 高压蒸汽灭菌器- 灭菌平板计数器2. 实验仪器：- 灭菌锅- 灭菌培养箱- 灭菌移液器- 灭菌镊子- 灭菌培养皿- 灭菌试管- 灭菌剪刀- 灭菌烧杯四、实验方法1. 土壤样品的处理- 取一定量的土壤样品，加入适量的无菌水，充分振荡后静置。
- 取上层悬液作为实验样品。
2. 乳酸杆菌的分离与纯化- 将MRS培养基在高压蒸汽灭菌器中灭菌后，倒入培养皿中制成平板。
- 将处理好的土壤样品悬液用无菌移液器取适量，涂布在MRS平板上。
- 将培养皿放入培养箱中，在适宜的温度下培养。
3. 乳酸杆菌的形态特征观察- 取分离得到的单菌落，在显微镜下观察其形态。
4. 乳酸杆菌的生理特性检测- 将分离得到的单菌落接种到含有不同糖类的培养基中，观察其在不同糖类上的生长情况。
- 用pH试纸检测培养基的酸碱度变化。
5. 乳酸杆菌的鉴定- 根据乳酸杆菌的形态特征、生理特性和生化反应，将其与已知菌种进行比对，确定其种类。
五、实验结果与分析1. 乳酸杆菌的分离与纯化- 成功分离得到多个单菌落，表明土壤样品中存在乳酸杆菌。
2. 乳酸杆菌的形态特征观察- 分离得到的乳酸杆菌为杆状，大小约为0.5～1.0μm×1.0～2.0μm。
3. 乳酸杆菌的生理特性检测- 分离得到的乳酸杆菌在葡萄糖、乳糖、麦芽糖培养基上均能生长，表明其可以利用这些糖类作为碳源。
乳酸菌检验方法
乳酸菌检验方法乳酸菌是指一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。
这类细菌在自然界分布广泛，可栖居在人和各种动物的口腔、肠道等器官内，在土壤、食品、饲料、水及一些临床标本中都有乳酸菌的存在。
乳酸菌在工业、农业和医药等与人类生活密切相关的领域应用价值很高，相当多的乳酸菌对人、畜的健康起着有益的作用，但个别菌种能对人畜致病，乳酸菌主要包括23个属的细菌。
二样本采集检样主要为含乳酸菌活菌的饮料和微生态制剂，样本应放入冰箱保存，心快检验。
三检验方法（中华人民共和国国家标准乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验GB／T 16347-1996）乳酸菌菌总数的测定：乳酸菌菌落总数是指标样在一定条件下培养后，所得1ml检样中所含乳酸菌菌落的总数。
（一）检验程序乳酸菌菌落总数检验程序如下：（二）培养基和试剂改良TJA培养基（改良番茄汁琼脂培养基）；改良MC培养基（modified Chalmers培养基）；0.1％亚甲蓝牛乳培养基；6.5％氯化钠肉汤参照；pH9.6葡萄糖肉汤；40％胆汁肉汤；淀粉水解培养基；精氨酸水解培养基；乳酸杆菌糖发酵管；七叶苷培养基；革兰氏染色液；3％过氧化氢溶液；蛋白胨水、靛基质试剂；明胶培养基；硝酸盐培养基、硝酸盐试剂；生理盐水：定量分装于三角瓶和试管内灭菌。
（三）操作步骤1．以无菌操作将经过充分摇匀的检样25ml（或25g）放入含有225ml灭菌生理盐水的来菌广口瓶内做成1：10的均匀稀释液。
2．用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1m，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。
3．另取1ml灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1ml灭菌吸管。
4．选择2～3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。
乳酸菌检测思考题与讨论
乳酸菌检测思考题与讨论乳酸菌检测思考题与讨论引言：乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，具有重要的生物学功能和应用价值。
乳酸菌不仅可以产生乳酸，还能够抑制有害菌的生长，增强人体免疫力，并对人体健康具有多种益处。
乳酸菌的检测对于食品、医药、农业等领域具有重要意义。
一、乳酸菌检测方法1. 培养基法：这是最常用的乳酸菌检测方法之一。
通过将样品接种到含有特定培养基的琼脂平板上，利用乳酸菌对特定营养物质的需求进行筛选和培养。
通过观察琼脂平板上是否出现特定形态和颜色的细菌落，可以初步判断样品中是否存在乳酸菌。
2. PCR法：PCR（聚合酶链式反应）是一种分子生物学技术，可以在短时间内扩增目标DNA片段。
通过设计特异性引物，可以选择性地扩增与乳酸菌相关的基因序列。
通过检测PCR反应产物的存在与否，可以判断样品中是否存在乳酸菌。
3. 酶法：乳酸菌在代谢过程中会产生一些特定的酶，如乳酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等。
利用这些特定的酶可以进行乳酸菌的检测。
常用的方法有色谱法、比色法等。
二、乳酸菌检测的应用领域1. 食品行业：乳制品是乳酸菌最常见的应用领域之一。
通过对食品中乳酸菌含量的检测，可以评估产品质量和卫生安全，并指导生产工艺和储存条件的控制。
还可以通过检测食品中潜在致病菌和有害物质的含量来保障消费者健康。
2. 医药领域：乳酸菌具有调节肠道微生态平衡、增强免疫力等作用，在医药领域有广泛应用。
通过对患者粪便或血液样本中乳酸菌含量的检测，可以评估肠道健康状况，并指导医生制定个体化的治疗方案。
3. 农业领域：乳酸菌在农业领域中也有一定的应用价值。
通过检测土壤或植物体内乳酸菌的含量，可以评估土壤质量和植物健康状况，并指导农民合理施肥和防治病虫害。
三、乳酸菌检测中存在的问题与挑战1. 检测方法选择：不同的乳酸菌检测方法具有不同的灵敏度、特异性和操作难度。
在实际应用中，需要根据具体需求选择合适的检测方法。
同时，还需要考虑成本、时间等因素。
乳酸菌的培养检测方案
品质管理检测项目细菌形态学分类一乳酸杆菌乳酸杆菌的基本属性：乳酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，并生成大量乳酸的一类细菌的总称。
利用发酵技术保藏食品，最典型的是通过乳酸菌的发酵。
这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。
利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，已经生产出多种不同类型的发酵乳。
因而分离和鉴定乳酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。
无芽孢，革兰氏染色呈阳性。
微好氧，厌氧发酵，最适温度30~40摄氏度，最适PH值为5.5~6.2，在微酸环境下可以生长，中性或者偏碱性环境中则生长速率下降。
在固体培养基上培养时，通常厌氧条件或者减少氧气压力和充有体积分数为5%~10%的CO2可以增加其表面生长物，有些菌株在分离时就是厌氧的。
（一）实验仪器和试剂：实验仪器：现有的仪器：欠缺的仪器：培养基和试剂：①培养基：BCP培养基、MRS培养基和SL培养基BCP培养基：酵母膏2 5g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，溴甲酚紫0.04g，琼脂15g，蒸馏水lO00ml，pH7 0；MRS培养基（可以培养包括双岐乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌）：重量(g) 牛肉蛋白粉10 ，鱼肉汁10 ，酵母浸出汁粉5 ，葡萄糖20 ，醋酸钠5 ，柠檬酸二铵 2 ，吐温80 0.1 ，硫酸镁0.58 ，硫酸锰0.28 ，蒸溜水1 000ml ，备注：用高压锅在121℃灭菌15min，调节pH6.2～6.4 。
乳酸杆菌选择性琼脂SL：酪蛋白水解物10g；酵母提取物5g；柠檬酸二铵2g；乙酸钠（CH3COONa？3H2O）25g；MgSO4？7H2O 0.58g；琼脂15g；葡萄糖20g；吐温80 1.0ml；磷酸氢二钾6g；FeSO4？7H2O 0.03g；MnSO4？4H2O 0.15g。
以上用量为1000ml培养基的用量。
溶解琼脂在500ml的沸水中，溶解其他组分在500ml的水中，用冰醋酸调pH=5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。
GB4789. 35乳酸菌检验
食品安全国家标准
食品微生物学检验 食品中乳酸菌检验
GB 4789.35－2010
定义
GB/T 4789.35－2007: 检验方法有三部分： 第1部分：分离与计数方法； 第2部分：PetrifilmTM测试片法； 第3部分：乳杆菌的PCR法
SN标准
GB/T 4789.35－2008 乳酸菌饮料中乳酸菌检验修订
本标准与GB/T 4789.35－2003相比主要修 改如下： ——将选择性分离培养基由改良TJA 培养基 （改良番茄汁琼脂培养基）改为MRS培养基； ——增加API 50CH 诊断试剂条； ——乳酸菌计数由倾注法改为涂布法。
乳酸菌计数
乳杆菌计数 乳酸菌总数结果减去 双歧杆菌与 嗜热链球 菌计数结果之和即得乳杆菌计数。
报告（GB/T4789.35-2008）
根据菌落计数结果出具检测报告。最终确定 的乳酸菌菌落在30～300之间的平板计数， 再乘以相应的稀释倍数，修约保留两位有效 数字，之后的数字，采用10的指数表示。参 照GB/T 4789.2规定。每克（或毫升）食品 中所含有的乳酸菌数以CFU/g（mL）表示。
结果的表述
7.4.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在 适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平 均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为 每g（mL）中菌落总数结果。 7.4.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在 适宜计数范围内时，按公式（1）计算：
7.4.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平 板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以 最高稀释倍数计算。 7.4.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释 倍数计算。 7.4.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平 板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍 数计算。 7.4.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
乳酸菌菌种的分离筛选方法
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。
为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。
营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。
在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。
通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。
乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。
当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。
对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。
M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。
嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。
其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。
粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。
乳酸片球菌细胞呈球状，直径~μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。
革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。
在MRS 培养基上菌落小，呈白色。
沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。
乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。
分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。
培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。
乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。
分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。
也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。
一.筛选方法：1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。
其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。
筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。
乳酸菌生化鉴定条
乳酸菌生化鉴定条一、糖发酵实验糖发酵实验是鉴定乳酸菌的重要生化反应之一。
不同的乳酸菌对糖的发酵能力不同，通过观察糖发酵过程中的产酸和产气情况，可以鉴别乳酸菌的种类。
常用的糖类包括葡萄糖、乳糖、果糖等。
二、氧化发酵实验氧化发酵实验是鉴定乳酸菌的另一种生化反应。
在缺氧条件下，乳酸菌能够利用丙酮酸氧化产能，生成乳酸和其他代谢产物。
通过观察氧化发酵过程中的产酸和产气情况，可以鉴别乳酸菌的种类。
三、乙酰甲基甲醇实验乙酰甲基甲醇实验是鉴定乳酸菌的一种特殊生化反应。
在酸性条件下，某些乳酸菌能够将乙酰甲基甲醇氧化成乙酸，同时产生氢气。
通过观察反应过程中的颜色变化和气泡产生情况，可以鉴别乳酸菌的种类。
四、丙二酸实验丙二酸实验是鉴定乳酸菌的另一种特殊生化反应。
某些乳酸菌能够利用丙二酸作为碳源进行生长，同时产生二氧化碳。
通过观察反应过程中的二氧化碳产生情况，可以鉴别乳酸菌的种类。
五、产氨实验产氨实验是鉴定乳酸菌的一种生化反应。
某些乳酸菌能够利用氨基酸产生氨，通过观察反应过程中的颜色变化和气味变化，可以鉴别乳酸菌的种类。
六、磷酸酯酶实验磷酸酯酶实验是鉴定乳酸菌的一种生化反应。
某些乳酸菌能够产生磷酸酯酶，分解磷酸酯类物质，产生磷酸盐和有机酸。
通过观察反应过程中的颜色变化和沉淀产生情况，可以鉴别乳酸菌的种类。
七、吲哚实验吲哚实验是鉴定乳酸菌的一种生化反应。
某些乳酸菌能够产生吲哚酶，分解吲哚类物质，产生靛蓝色素。
通过观察反应过程中的颜色变化，可以鉴别乳酸菌的种类。
八、甲基红实验甲基红实验是鉴定乳酸菌的一种生化反应。
某些乳酸菌能够将葡萄糖转化为乳酸，在酸性条件下，葡萄糖分解成乙醇和二氧化碳。
通过观察反应过程中的颜色变化和气泡产生情况，可以鉴别乳酸菌的种类。
九、伏-普实验伏-普实验是鉴定乳酸菌的一种特殊生化反应。
在葡萄糖和乳糖的存在下，某些乳酸菌能够将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖，通过观察反应过程中的颜色变化和沉淀产生情况，可以鉴别乳酸菌的种类。
乳酸菌的分离、纯化与鉴定
乳酸菌的分离、纯化与鉴定第一部分：乳酸菌的分离、纯化一、实验器材:1.实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g；2.仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml 锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。
二、实验步骤：1.培养基配制（BCG牛乳培养基）：（A）溶液：取脱脂乳粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml，混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min；（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）（B）溶液：酵母膏10g，水500ml，CaCO3 10g，琼脂20g，加热溶解，用精密pH试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。
以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。
2.药品配制2.1 结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1%草酸氨水溶液80ml。
将两液混匀，放置24小时后过滤即可。
2.2 卢哥氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。
先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。
2.3 蕃红溶液：番红2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。
用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。
2.4 0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g，95%乙醇300ml；B液：0.01% KOH 100ml。
酸奶发酵过程中乳酸菌菌株的筛选与鉴定
酸奶发酵过程中乳酸菌菌株的筛选与鉴定酸奶是一种由牛奶或者其他乳制品通过乳酸菌的发酵而制成的食品。
乳酸菌是酸奶发酵的关键因素，具有良好的保健效果和口感。
在酸奶制作过程中，乳酸菌菌株的筛选与鉴定是非常重要的步骤。
本文将介绍酸奶发酵过程中乳酸菌菌株的筛选与鉴定的方法和意义。
首先，乳酸菌菌株的筛选是为了选择出适合酸奶发酵的优质菌株。
在酸奶制作中，菌株的特性包括产酸能力、耐受性、生长速度和抗菌特性等多方面。
通过筛选过程，可以找到产酸量高、生长快速、对不良菌有抑制作用的优质菌株。
这些菌株可以在酸奶制作中快速发酵，产生出优质的酸奶。
乳酸菌菌株的筛选方法有很多种，常见的包括传统筛选法、分子筛选法和生理筛选法等。
传统筛选法是指利用一系列的生理、生化和形态特性对菌株进行初步筛选。
通过这种方法，可以初步判断菌株是否具有发酵酸奶的潜力。
分子筛选法则是通过利用分子生物学技术对乳酸菌菌株进行检测，例如PCR扩增、16S rRNA测序等。
这些方法可以对菌株的遗传信息进行分析，从而确定其种属和亲缘关系。
生理筛选法则是根据菌株在不同环境条件下的生长情况，筛选出适应性强、产酸能力高的菌株。
乳酸菌菌株的鉴定是为了确保酸奶发酵过程中使用的菌株的纯度和品质。
鉴定的目的是确定菌株的种属和亚种，以及其在酸奶制作中的适用性。
鉴定的方法多样化，常用的有生化鉴定法、微生物学鉴定法和分子生物学鉴定法等。
生化鉴定法是利用菌株在特定培养基和条件下的代谢特征进行分析，通过菌株对不同物质的反应情况来确定其种属。
微生物学鉴定法则是通过观察菌株的细胞形态、培养特性等进行判断。
分子生物学鉴定法则是通过测序菌株的特定基因序列，例如16S rRNA，来确定菌株的种属和亲缘关系。
乳酸菌菌株的筛选与鉴定在酸奶发酵过程中具有重要的意义。
通过合适的筛选和鉴定方法，可以保证酸奶发酵的质量和稳定性。
优质的菌株不仅可以提高酸奶的口感和品质，还具有益生菌的功能，对消化系统和免疫系统有益。
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93°C for 1 min, annealing at 54°C for 1.5 min, and elongation at 72°C for 2.5 min. To allow the identification of small amounts of bacteria, a method was developed to isolate DNA from a single colony grown on an agar plate (7). After the colony (+1.5-mm diameter) was suspended in 50 ,lI of 10 mM Tris HCl buffer (pH 8.0) containing 400 ,ug of lysozyme and incubation at 37°C, the cells were lysed by adding 50 ,ul of 10% sodium dodecyl sulfate and 250 pul of buffer. The DNA was precipitated by adding 60 plI of 3 M sodium acetate and 1 ml of 96% ethanol (stored at -20°C). After centrifugation, the DNA pellet was dissolved in 10 mM Tris HCl buffer (pH 8.0) and precipitated a second time by adding 1 ml of isopropanol. The DNA pellet was washed with 70% ethanol and finally dissolved in 50 ,ul of TE buffer (10 mM Tris HCl [pH 8.0], 1
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Nov. 1991, p. 3390-3393 0099-2240/91/113390-04$02.00/0 Copyright C) 1991, American Society for Microbiology
Vol. 57, No. 11
VOL. 57,
1991
TABLE 1. List of primers used
NOTES
3391
Use
Primer or probea
Target DNA (region)
Sequence (5' to 3')
PCR
P1(S) P2 (A) P3 (S) P4 (A)
41-60 (Vj)b 111-130 (Vj)b 361-380 (V3)b
GCGGCGTGCCTAATACATGC TTCCCCACGCGTTACTCACC GGAATCTTCCACAATGGGCG
ATCTACGCATTTCACCGCTAC
685-705 (V3)b
L. lactis subsp. lactis Vl L. lactis subsp. lactis and L. lactis subsp. hordniae Vl L. lactis subsp. cremoris Vl L. plantarum Vl L. garvieae Vl L. raffinolactis Vl Leuconostoc spp. Vl Leuconostoc lactis V3 Leuconostoc mesenteroides V3
Received 29 April 1991/Accepted 23 August 1991
Specific DNA probes based on variable regions Vl and V3 of 16S rRNA of lactic acid bacteria were designed. These probes were used in hybridization experiments with variable regions amplified by using the polymerase chain reaction. In this way, a rapid and sensitive method was developed for the identification and classification of Lactococcus and Leuconostoc species.
Lactic acid bacteria (LAB) are of great economic importance for the dairy and other fermented food industries. For both basic research on LAB and their application in industrial food fermentations, reliable and simple methods for identification of such bacteria are required. Because many LAB have similar nutritional and growth requirements, it is very difficult to identify them by classical methods. Therefore, various approaches that use molecular probes have been described (2, 4, 11). Here we report on a combination of sensitive techniques for identification and detection of LAB that is based on polymerase chain reaction (PCR) (13) and specific DNA probing (9). In recent years, the use of rRNA sequences for identification and phylogenetic analysis has been generally accepted (1, 5). DNA probes based on highly variable rRNA regions have been applied successfully for the identification and detection of microorganisms in soil, intestinal tract, and clinical samples (6, 12, 16). By comparing the published 16S rRNA sequences of Lactococcus spp. (3, 14) and Leuconostoc spp. (8, 17), we identified the regions containing the highest variability. For the genus Lactococcus, described by Schleifer et al. (15), the Vl region (90 bp) contained sufficient sequence variation to enable the design of DNA probes allowing differentiation between the species Lactococcus lactis, L. garvieae, L. plantarum, and L. raffinolactis and L. lactis subsp. lactis and L. lactis subsp. cremoris. The sequences of the Vl region (90 bp) appeared to be identical in all species analyzed in the genus Leuconostoc, but those of the V3 region contained sufficient variation to design DNA probes specific for Leuconostoc species (Table 1). To increase the sensitivity of the procedure, we used PCR amplification of the variable regions with primers based on the conserved flanking sequences (Table 1 and Fig. 1). The PCR amplifications were performed by using a BioMed Thermocycler (BioMed, Amstelstad, Holland). The reactions were carried out in sterile Multimax seal tubes with cap locks (1.5 ml), which contained 50 RI of the following buffer: 10 mM Tris HCl (pH 8.8), 1.5 mM MgCl2, 50 mM NaCl, deoxynucleoside triphosphates at 2.5 mM, and 1 U of Taq polymerase. Template DNA (500 to 100 ng) was added after being heated to 95°C to eliminate all protease activity. The amplification was done in 30 cycles by melting the DNA at