细胞染色方法总结 (1)

Hoechst染色:hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合(主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色. Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果.hoechst 有hoechest33342和hoechst33258两种hoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！

染色步骤

PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测.碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）。但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI单一染色也可以。但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够！

annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用PE标记就发红色荧光。

JC-1染色JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光(-590nm)为主。线粒体本身存在一定的极性(polarization)，其外膜为负极，内膜为正极。电位差由Ca2+、Na+和H+流调控。当线粒体状态良好时对JC-l摄取量少，因而在线粒体内主要以单体的形式存在绿光强度/红光强度的比值较高。在线粒体发生去极化(depolarization)时，线粒内JC-l的浓度较高，多以多聚体的形式存在，绿光强度/红光强度的比值降低。JC-1染色的绿光强度/红光强度仅取决于线粒体的膜电势(membrane potential)，而与线粒体的形态、体积和密度都无关，因而能更好地反映线粒体的功能状态。由于凋亡发生的早期存在线粒体的去极性，因此，JC-1染色被用于检测凋亡的早期发生。其实验方法如下。

JC-l染色非常简单。首先可将成品JC-1以DMSO配成储存液(1～5mg/ml)，储存于-20℃，用时以培养液稀释至10ug/ml终浓度。对贴壁细胞可以直接弃去培养液，漂洗细胞后直接加入染色液，10-30min后在荧光显微镜下或者激光共聚焦下观察。线粒体状态好时细胞以绿色为主，当红光信号增强时，红绿相叠，以橙色为主。该染色运用于悬浮细胞时还可以通过流式细胞仪进行检测，收集红/绿信号强度，计算其强度比。

钙黄绿素-AM(Calcein-AM):Calcein -AM本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein -AM能脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光（激发：490 nm，发射：515 nm）。因此Calcein -AM仅对活细胞染色

细胞活力鉴定——台盼蓝染色法

原理：

细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。

用品：

1. 4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至%。

2. 吸管、血细胞计数板、显微镜

步骤：

1、制备单细胞悬液。并作适当稀释（106细胞/ml）

2、染色：细胞悬液与%台盼蓝溶液以9:1混合混匀。

3、计数：在三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞

结果统计：

镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。

根据下式求细胞活力：

活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100

注意事项：台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。

台盼蓝染色原理

通常认为细胞膜丧失完整性，细胞即可被认为已经死亡。台盼蓝(Trypan Blue)是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。依据此原理，细胞经台盼蓝染色后，可通过显微镜，直接镜下计数或拍照后计数，实现对细胞存活率比较精确的定量分析。

试述台盼蓝染发鉴别死活细胞的原理，试分析染色时间过长本来是活细胞也被染色的原因

死细胞的细胞膜无屏障作用，台盼蓝马上进入细胞而显蓝色。活细胞细胞膜有选择透性，对台盼蓝的透性小，进入细胞慢。若染色时间过长，台盼蓝可能通过胞吞或胞饮作用进入细胞。