蛋白质分离与纯化教学设计
高二生物选修一第六课时 蛋白质的分离和纯化.导学案doc
第六课时蛋白质的分离和纯化【课标要求】：本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。
【学习目标】：知识：尝识从血液中提取和分离血红蛋白，了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理能力：体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤学习蛋白质提取和分离的一些基本技术情感：初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神【学习重点】：凝胶色谱法的原理和方法【学习难点】：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填【课前导学】一、制备蛋白质的粗制品组织破碎_______________细胞破碎_______________酸性蛋白质：_______________蛋白质抽提水溶性蛋白质：_______________脂溶性蛋白质：_______________去除固体杂质______________蛋白质粗制品:可能是多种蛋白质的混合物，其中还可能混有许多小分子化合物二、蛋白质的分离与纯化1、原理：根据不同的物质其分子的大小、溶解度的大小、所带电荷的多少，吸附性质等方面存在差异进行的。
2、方法：⑴透析法：其原理是___________不能透过半透膜，而其他小分子化合物可以透过_____________。
⑵离心沉降法：通过控制_________，使得___________________不同的蛋白质发生沉降分层，从而达到分离出不同种类蛋白质的目的。
⑶电泳法①概念：带电颗粒在电场作用下向着与其____________________的现象②影响泳动速度的因素：____________________，（一般来说，分子直径_________，越接近于____形，所带净电荷_______，泳动速度越快，反之，则越慢。
）③常用的方法：______________电泳。
蛋白质工程第四讲分离纯化与分析优秀课件
T1→T11
图4 TLC色素指纹图谱的图像灰度分析曲线 Fig. 4 Intensity curve of pigment fingerprintings on TLC
➢ 重复展层法：展层剂1为石油醚、正己烷、异丙醇、丙酮和甲醇比例=8-10：0.75-0.95： 0.2-0.30：0.8-1.0：0.25-0.35 ；展层剂2为石油醚：正己烷：异丙醇：丙酮，比例为10： 0.95：0.22-0.25：0.38-0.41 。
吸附剂的种类：羟基磷灰石、硅胶、氧化铝等 ➢ 柱层析：羟基磷灰石，[Ca3(PO4)3OH2]，HA，酸性蛋白质、酶、核酸、
病毒等生命大分子。硅胶：含硅醇基团（-Si-OH），氨基酸、甾体激素、 皂苷类、类脂和色素等等。 ➢ 薄层层析：例如，硅胶薄层层析和聚酰胺薄膜薄层层析 硅胶薄层层析：硅胶板，硅胶H（纯硅胶），能用腐蚀性强的显色剂； 硅胶G（10%-15%煅石膏和5%淀粉的硅胶）；硅胶CMC（含羧甲基纤 维素）；硅胶HF254(含荧光剂的硅胶H)， 硅胶板的制备：玻璃板，硅胶制备（加溶剂碾磨），铺板，活化，活化 测定（约1mg苏丹黄、苏丹红和靛酚蓝混合物乙酸乙酯溶液点样，苯做 展层剂，Rf大小苏丹黄>苏丹红.靛酚蓝，苏丹黄Rf）0.5，苏丹红和靛酚 蓝Rf之差在0.1—0.2)。 分析程序：点样，展层，显色。
2、基本程序：样品处理、粗分和精分（例如：蛋白质的分离纯化）
3、分类：
初级分离：沉淀法、膜分离、萃取法、离心法等 精制纯化：
吸附层析、凝胶过滤、离子交换、疏水性相互作用色谱、反向色谱、亲和层析
二、初级分离（要求：灵活运用） 目的——分离对象（物质）初步分离、浓缩、富集的过程。 方法及原理：
➢ 为了保证分析的准确度，避免检测体系中某些物质的干扰，往往对样 品进行处理。
《蛋白质的提取和分离》 说课稿
《蛋白质的提取和分离》说课稿尊敬的各位评委老师：大家好！今天我说课的题目是《蛋白质的提取和分离》。
下面我将从教材分析、学情分析、教学目标、教学重难点、教学方法、教学过程以及教学反思这几个方面来展开我的说课。
一、教材分析“蛋白质的提取和分离”是高中生物选修模块《生物技术实践》中的重要内容。
这部分知识在生物技术领域具有重要的应用价值，对于学生理解生物技术的原理和方法，培养实践能力和创新思维具有重要意义。
本节课的内容主要包括蛋白质提取和分离的基本原理、方法和步骤。
通过学习，学生将了解到如何从复杂的生物样品中提取出特定的蛋白质，并将其分离和纯化，为后续的蛋白质分析和应用奠定基础。
二、学情分析学生在之前的学习中已经掌握了细胞的结构和功能、蛋白质的性质等相关知识，具备了一定的生物学基础。
但是，对于蛋白质提取和分离这样较为复杂的实验技术，学生可能缺乏直观的认识和实践经验。
因此，在教学过程中需要通过多种教学方法和手段，帮助学生理解和掌握相关知识和技能。
三、教学目标1、知识目标（1）理解蛋白质提取和分离的基本原理，包括蛋白质的溶解性、电荷特性等。
（2）掌握蛋白质提取和分离的常用方法，如凝胶色谱法、电泳法等。
（3）了解蛋白质提取和分离的实验步骤和操作要点。
2、能力目标（1）通过实验设计和操作，培养学生的动手能力和实验探究能力。
（2）通过对实验数据的分析和处理，提高学生的科学思维和数据分析能力。
3、情感态度与价值观目标（1）培养学生严谨的科学态度和团队合作精神。
（2）激发学生对生物技术的兴趣，增强学生的创新意识和应用意识。
四、教学重难点1、教学重点（1）蛋白质提取和分离的基本原理和常用方法。
（2）凝胶色谱法和电泳法的原理和操作步骤。
2、教学难点（1）蛋白质提取和分离实验方案的设计和优化。
（2）对实验结果的分析和解释。
五、教学方法1、讲授法通过讲解，让学生了解蛋白质提取和分离的基本原理和方法。
2、实验法组织学生进行实验操作，亲身体验蛋白质提取和分离的过程，提高实践能力。
蛋白质分离纯化设计
蛋白质分离纯化设计蛋白质分离纯化是生物技术和生物制药领域中非常重要的步骤。
这个过程可以将混合物中的目标蛋白质分离出来，并纯化到足够纯度以满足进一步研究或生产的要求。
在设计蛋白质分离纯化过程时，需要考虑到多个因素，包括目标蛋白质的特性、混合物的复杂性以及经济效益。
首先，在蛋白质分离纯化设计中，需要确定合适的分离技术。
常见的分离技术包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤、透析和电泳等。
选择适当的分离技术要考虑目标蛋白质的特性，如分子量、电荷、亲和性等。
同时，还需要考虑操作的便捷性、分离效果和经济成本等因素。
其次，在蛋白质分离纯化过程中，通常会采用多步骤的分离策略，以逐步提高纯度。
比如，可以先使用亲和层析方法，利用目标蛋白质与特定配体的亲和性进行分离；然后再使用离子交换层析来进一步去除杂质；最后使用凝胶过滤或透析来将蛋白质溶液从缓冲液中换成目标溶液。
此外，还可以结合其他技术来提高分离纯化效果。
例如，可以使用聚合物钙盐沉淀、有机溶剂沉淀、溶剂萃取等方法来去除大量的杂质。
也可以利用电泳技术进行蛋白质的分离和纯化，如SDS-PAGE和等电聚焦等。
最后，在蛋白质分离纯化设计中，要考虑到经济效益。
分离纯化过程中耗费的时间和成本应该尽可能地减少，同时要保证分离纯化的效果。
可以通过优化分离纯化步骤的顺序和条件，选择合适的材料和设备，以及利用自动化技术来提高工作效率和降低成本。
总之，蛋白质分离纯化设计是一个复杂的过程，需要综合考虑蛋白质特性、混合物的复杂性、分离技术的选择以及经济效益等因素。
通过科学合理的设计和优化，可以获得高纯度的目标蛋白质，为后续的研究和生产提供可靠的基础。
蛋白质分离纯化设计
蛋白质分离纯化设计1. 简介蛋白质分离纯化是一项重要的实验技术，在生物医药、食品科学、农业等领域有着广泛的应用。
通过对蛋白质进行分离纯化，可以获得单一纯度的蛋白质用于后续研究及应用。
本文将详细介绍蛋白质分离纯化的设计方法和常用技术，包括样品准备、分离方法选择、纯化步骤设计等。
同时，我们还将讨论常见的挑战和解决方案，以及如何评估分离纯化效果。
2. 样品准备在进行蛋白质分离纯化前，首先需要准备好样品。
样品的选择和准备对于后续分离纯化过程非常重要。
2.1 选择合适的样品样品可以来自细胞、组织、体液、培养基等。
在选择样品时，需要考虑到蛋白质的种类、表达水平、目标纯化程度以及后续实验需要。
2.2 样品预处理样品在分离纯化前需要进行预处理，以去除可能干扰纯化过程的杂质。
常用的预处理方法包括细胞破碎、离心、除去非蛋白质成分等。
预处理方法的选择应根据样品类型和后续纯化方法进行优化。
3. 分离方法选择根据蛋白质分离的原理和样品特性，我们可以选择合适的分离方法。
常见的分离方法包括离子交换层析、凝胶过滤、透析、亲和层析等。
3.1 离子交换层析离子交换层析是一种基于蛋白质带电性质的分离方法。
可以根据蛋白质的以阴离子或阳离子带电来选择合适的离子交换树脂，实现不同蛋白质的分离纯化。
3.2 凝胶过滤凝胶过滤是一种基于蛋白质大小的分离方法。
通过选择适当的孔径大小的凝胶，可以分离不同分子大小的蛋白质。
3.3 透析透析是一种基于蛋白质分子量和溶液成分的分离方法。
通过选择适当的膜材料和透析缓冲溶液，可以实现蛋白质与小分子化合物的分离。
3.4 亲和层析亲和层析是一种基于蛋白质与配体之间的特异性结合来分离纯化的方法。
选择合适的亲和配体，可以选择性地结合目标蛋白质，从而实现其分离纯化。
4. 纯化步骤设计在选择合适的分离方法后，需要设计纯化步骤来实现目标蛋白质的分离和纯化。
纯化步骤的设计应根据分离方法的特点和目标蛋白质的性质进行优化。
4.1 样品加载将预处理的样品通过适当的装载方式加载到分离纯化柱中，如使用注射器将样品缓慢注入。
蛋白质的提取与分离纯化——生化实验设计讲解课件讲解学习
值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白 质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析 以除去小分子的配基。
凝胶层析法属最常用的蛋白质分离方法。系混合
物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时， 混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。 在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶 网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子 量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速 缓慢，致使最后流出柱外。
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当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁 移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，
式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常 数若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质 在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即 可在标准曲线上求得分子量。
玻璃匀浆机
b、细胞器的分离
细胞器的分离一般采用差速离心法。细 胞经过破碎后，在适当介质中进行差速 离心。
三、蛋白质粗提取
从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的， 需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质 分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条 件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是 有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质 （如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后 操作。常用有机溶剂提取除去。
二、a 细胞的破碎
⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破 坏。常用器械有： ①玻璃匀浆器（用两个磨砂面相 互摩擦，将细胞磨碎） ②高速组织捣碎机（转速可 达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于 动物内脏组织的破碎 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织 细胞破碎的方法。 Ⅰ反复冻融法 Ⅱ冷热变替法 Ⅲ超 声波法 ⑶化学及生物化学方法
蛋白质的分离纯化及实验技术学习教案
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第六页，编辑于星期三：点 四十五分。
4. 等电点
等电点（pI）是蛋白质上净电荷为零时的pH 值，由蛋白质上带正、负电荷的氨基酸残基 数目和滴定曲线所决定。
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5. 电荷分布 电荷的氨基酸可均匀地分布于蛋白质的 表面，亦可成簇地分布，使某一区域带 强的正电荷而另一区域带强负电荷。这 种非随机的电荷分布可用来通过离子交 换层析来分离蛋白质。
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第二节 蛋白质分离纯化的
一般步骤
（一）前处理
பைடு நூலகம்
（二）粗分级 （三）细分级
动物材料应先剔除结缔组织和 脂肪组织； 种子材料应先去壳甚至去种 皮以免受单宁等物质的污染 ，油料种子最好先用低沸点 的有机溶剂如乙醚等脱脂。
然后根据不同的情况，选择 适当的方法，将组织和细胞 破碎。动物组织和细胞可用
胶体颗粒通过密度梯度超离心示意图
以Au 纳米颗粒的分离的效果
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3.凝胶层析
又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间
网状结构的物质，有天然的，
也可人工合成。根据网孔不同
可制成不同规格。
具备条件：1惰性，2水不溶性， 3能高度水化。
常用分子筛：
gradien滴t加样）品
离 心 管
蔗糖浓度
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蔗糖密度梯度
第二十四页，编辑于星期三：点 四十五分。
密度梯度离心
滴加样品
塑料离心管
分
4%
子 量
8%
由 小
蛋白质的提取、分离纯化及定量
实验一氨基酸的别离鉴定——纸层析法实验目的1.学习氨基酸纸层析的根本原理。
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。
实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。
将样品点在滤纸上〔原点〕，进展展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进展分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA别离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用比移〔rate of flow ,Rf〕来表示Rf= 原点到层析点中心的距离〔*〕/原点到溶剂前沿的距离(Y)只要条件〔如温度、展层剂的组成〕不变，*种物质的Rf值是常数。
可根据R f 作为定性依据。
Rf值的大小与物质的构造、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
样品中如有多种AA，其中有些AA的Rf值一样或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而到达别离的目的，这种方法叫双向层析。
仪器、试剂1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进展混合得混合液。
将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。
取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
2、氨基酸溶液⑴.单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。
3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
4、层析缸、滤纸〔14*17〕、喷雾器、电吹风实验步骤1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。
2.准备滤纸：取层析滤纸〔长17㎝、宽14㎝〕一*。
在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。
高二生物选修一 《4.1蛋白质的分离与纯化方法》教案
高二年级第二学期生物学科总第课时教案课题一蛋白质的分离与纯化方法使用时间：____________ 主备人：_设计定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
2.实验原理:醋酸纤维薄膜电泳(CAME)是以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种区带电泳技术，将血清样品点样于醋纤膜上，在pH 为8. 6的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。
由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。
电泳后，CAM 经染色和漂洗，可清晰呈现清蛋白、一球蛋白、一球蛋白、8球蛋白、丫一球蛋白5条区带，比色即可计算出血清各蛋白组分的相对百分数。
布置学生课堂检测，并重点提示。
学生完成课堂检测课后: 学生完成课外作业及下一节布置课外作业及下一节预习提纲。
(见导学案)生物成分的分离与测定技术蛋白质的分离常用的细胞破碎的方法:预习。
抽提方法: 纯化主要是根据: 常用的方法:三、其他补充教学资料（各位教师根据各班教学特点选择补充资料，可另附纸）高二生物生物成分的分离与测定技术导学案使用时间： _______ 编制人：_一、学习目标：知道蛋白质的分离常用的细胞破碎的方法，蛋白质抽提方法，掌握蛋白质的分离与纯化方法。
二、知识构成：1.________________________________________________________________________ 蛋白质的分离常用的细胞破碎的方法有：__________________________________________________________ 根据蛋白质的不同特性，分别可选择哪些抽提方法？________________________________________________ 、蛋白质的纯化主要是根据____________________________ 之间以及__________________________ 之间在 ______________ 、_____________ 、_________ 、___________ 等方面存在的差异进行的。
11第十一讲蛋白质的分离与纯化(二)课件
类脂和色素等等。（分离并洗脱）
薄层层析：（只分离不洗脱），例如：硅胶薄层层析和聚酰胺薄膜薄层层析
硅胶薄层层析：
•
硅胶板分类（4类），硅胶H（纯硅胶），能用腐蚀性强的显色剂；硅胶
G（10%-15%煅石膏和 5%淀粉的硅胶）；硅胶CMC （含羧甲基纤维素）； 硅胶HF254(含荧光剂的硅胶H)。 硅胶板的制备：玻璃板，硅胶制备（加溶剂碾磨），铺板，活化和 合格检查：约1mg苏丹黄、苏丹红和靛酚蓝混合物乙酸乙酯溶液点样，苯：
二、常见色谱介绍
1、吸附分离色谱？
（1）概念：
利用固相吸附剂对不同物质的吸附力不同，进行物质分离的液相色谱技术。
（2）原理：
通过范德华力，流动相中的分子与固定相（吸附剂）吸附、再解吸附进 入流动相（洗脱剂）。
不同物质在固相和液相之间分配系数或解离平衡不同。 通过连续的吸附—解吸附—再吸附过程将物质分离。
– –
亲水性离子交换剂（亲水性较大的合成物质，纤维素、葡聚糖、交联琼脂糖等）
阳离子交换剂 阴离子交换剂
常用固定相介质
– DEAE（二乙基胺基乙基）— Cellulose DE-32 – DEAE—Cellulose DE-52 – DEAE- Sephadex A-50（25） – DEAE-Sepharos CL-6b
2、液相色谱的发展
• 在色谱技术中，液相色谱（Liquid chromatography）是最早（1903年）发 明的，但其初期发展比较慢。 • • 液相色谱普及之前，纸色谱、气相色谱和薄层色谱是色谱分析的主流。 20th60S’，将较为成熟的气相色谱 理论与技术应用于液相色谱，使液相色谱 迅速发展。 • 特别是填料（色谱柱）制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使 液相色谱分析实现了高效化和高速化。 • 1969年，液相色谱仪商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色 谱被称为高效液相色谱法（HPLC） • • 更加 微量、快速、高效、广泛。 新进展：微柱—HPLC、无孔色谱短柱—HPLC、毛细管—HPLC
《蛋白质分离、纯化》PPT课件
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带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
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凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
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蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
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• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
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一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
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凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
蛋白质的分离纯化实验报告
蛋白质的分离纯化实验报告一、实验目的1、掌握蛋白质分离纯化的基本原理和方法。
2、学会运用不同的技术手段对蛋白质进行提取、分离和纯化。
3、熟悉蛋白质纯度鉴定的常用方法。
二、实验原理蛋白质是生物体中重要的大分子化合物，其分离纯化是研究蛋白质结构和功能的重要前提。
蛋白质的分离纯化主要依据其物理化学性质的差异，如分子大小、电荷、溶解度、亲和力等。
常见的分离纯化方法包括：1、盐析法：通过向蛋白质溶液中加入中性盐，如硫酸铵，使蛋白质溶解度降低而沉淀析出。
2、凝胶过滤层析：利用凝胶颗粒的多孔网状结构，根据蛋白质分子大小进行分离。
3、离子交换层析：基于蛋白质所带电荷的不同，在离子交换树脂上进行吸附和解吸。
4、亲和层析：利用蛋白质与特定配体之间的特异性亲和力进行分离。
三、实验材料与设备1、材料新鲜的动物组织（如肝脏）各种试剂，包括硫酸铵、磷酸盐缓冲液、离子交换树脂、亲和配体等。
2、设备离心机层析柱紫外分光光度计电泳仪四、实验步骤1、蛋白质的提取将新鲜的动物组织剪碎，加入适量的磷酸盐缓冲液，在冰浴中匀浆。
低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集上清液，即为粗提的蛋白质溶液。
2、盐析沉淀在上清液中缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，使其饱和度逐渐增加到 50%。
搅拌 30 min 后，低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集沉淀。
3、凝胶过滤层析装柱：将凝胶颗粒填充到层析柱中，用缓冲液平衡柱子。
上样：将盐析沉淀溶解后，缓慢上样到层析柱中。
洗脱：用缓冲液进行洗脱，收集不同洗脱峰的流出液。
4、离子交换层析装柱：将离子交换树脂填充到层析柱中，用起始缓冲液平衡柱子。
上样：将凝胶过滤层析收集的样品上样到离子交换层析柱中。
洗脱：采用梯度洗脱的方法，逐渐改变缓冲液的离子强度，收集洗脱峰。
5、亲和层析装柱：将亲和配体偶联到层析介质上，填充到层析柱中，用平衡缓冲液平衡柱子。
上样：将离子交换层析收集的样品上样到亲和层析柱中。
《蛋白质分离纯化》PPT课件
当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋 白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱 上，而其它蛋白质那么流出柱外。被特异性结合 在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液 洗脱。
发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用 (Precipitation)。
的 纯 化
因为蛋白质分子量大小不同、外表所代 电荷不同、外表的亲水和疏水区域不同，
方 所以可以通过可逆沉淀法将蛋白质别离
法 出来。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
沉淀法具有局部纯化、浓缩特点。
盐析
蛋 白
蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水 化层被破坏和外表电荷被中和，容易发生
五、 蛋白质含量的测定
定氮法：灵敏度较低 双羧脲法：样品量0.2-1.7mg/L Folin-Lowry法：在碱性条件下磷钼酸、磷
钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反响，生成 蓝色化合物，将其与双羧脲法结合起来，蛋白 质形成两种颜色的混合物老绿色，在650nm 具有特定的吸收。灵敏度较高25g250g/ml.
6000转/分 2-3万转/分 3万转/分
2．沉降系数〔S〕概念
沉降系数〔S〕
生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉 降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从 静止状态到达极限速度所需要的时间。其单位用 Svedberg，即S表示，S=1×10-13秒。
沉降系数〔S〕与分子量〔M〕的关系 Svederg方程: M = RTS D(1-)
中移动的速度〔v〕取决于电场强度(E)，所带
的净电荷(q)以及与介质的摩擦系数(f)。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
蛋白质分离纯化技术实验讲义
实验一蛋白质含量分析（Bradford检测法）一、实验目的1、制作蛋白质浓度标准曲线；2、测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白质的浓度。
二、实验原理Bradford法（考马斯亮蓝法）测定蛋白质浓度是1976年由Bradford建立的，是最常用的蛋白质快速定量方法。
该方法根据蛋白质与染料相结合的原理设计，考马斯亮蓝G-250（CBB G-250）在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它在酸性溶液中与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-染料结合物在595nm波长下有最大光吸收，且光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。
Bradford法的突出优点是：灵敏度高；测定快速、简便，只需加一种试剂；干扰物质少。
此法的缺点是：仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物有去污剂、Triton X-100、SDS和0.1N的NaOH。
三、试剂与器材1、试剂：1mg/ml 牛血清蛋白（BSA）母液；考马斯亮蓝G-250；无水乙醇；85%磷酸；MiliQ水。
2、器材：滤纸；烧杯；漏斗；可见分光光度计；试管。
四、实验方法1、考马斯亮蓝G-250染料的配置称100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于47.5 ml 无水乙醇后，再加入100 ml 85%的磷酸，加MiliQ水定容至1 L，过滤备用。
2、标准蛋白溶液的稀释取10支试管，按表中顺序排列，分别加入考马斯亮蓝溶液、水和样品。
每加完一管，立即振荡混匀（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。
未知样品的编号为8、9、10号管。
3、加完试剂2-5min后，即可用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸光值OD595。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇冲洗，塑料比色皿不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
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蛋白质分离与纯化教学设计一、教学背景分析【教材分析】“蛋白质的分离与纯化”实验是《高中生物》选修1生物技术实践 5.3血红蛋白的提取与分离中的内容。
本节课的主要内容包括蛋白质的提取、分离纯化等基本知识，主要要求学生掌握凝胶电泳的实验原理以及操作方法。
“血红蛋白分离与纯化”实验不仅是学习血红蛋白的提取、分离纯化方法，而且也是进一步掌握蛋白质的组成、结构和功能的基础。
【学情分析】到目前为止，学生已经学习了蛋白质的相关知识，对蛋白质有了一定的了解，“蛋白质的分离与纯化”实验目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取和纯化生物大分子的基本原理、过程和方法，虽然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，学习兴趣很高。
学生有必修“生命活动的主要承担者——蛋白质”的基础，在一定程度上掌握了蛋白质的组成、结构和功能等基础知识，学生在进行实验前还是能大概了解影响蛋白质分离纯化的因素的，再者经过老师的指导，实验能取得良好的结果的。
二、教学目标【知识目标】1.了解从血液中提取蛋白质的原理与方法。
2.说出凝胶电泳的基本原理与方法。
【能力目标】运用凝胶电泳对蛋白质进行分离纯化。
【情感态度与价值观目标】1.培养学生科学实验的观点。
2.初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。
三、教学重难点【教学重点】从血液中提取蛋白质；凝胶电泳分离纯化蛋白质。
【教学难点】样品预处理，色谱柱的装柱，纯化分离操作。
四、实验实施准备【教师准备】1.分组。
学生按学科能力的强中弱平均分组，各组尽量平衡，各组自行分工，并由实验员统一安排实验过程。
2.实验材料：血液仪器：试管、胶头滴管、烧杯、玻璃棒、离心机、研磨器、透析袋、电泳仪等。
试剂：20mmol/L磷酸缓冲液（pH为8．6）、蒸馏水、聚丙烯酸铵、生理盐水、5％醋酸水溶液等。
【学生准备】1.预习实验“蛋白质分离纯化”，了解蛋白质的相关信息。
2.进行分组。
五、教学方法【教法】分析评价法、任务驱动法、直观演示法【学法】自主学习法、合作交流法六、教学媒体黑板、多媒体七、课时安排两个课时（80min）一个课时用来讲述理论部分知识：样品处理与色谱柱分离纯化蛋白质的原理与方法；另一课时用来进行实验。
九、教学设计反思本实验重在让学生了解生物科学在蛋白质领域的进展，说明分离、纯化高纯度的蛋白质的重要性和必要性，并学习一些蛋白质分离和纯化的基本技术。
可以发挥学生的主动性，让学生介绍当前有关蛋白质研究的新进展，激发学生的学习兴趣，让学生初步体会分离纯化蛋白质的过程和方法。
本节课的教学主要是教师讲授知识并演示实验操作过程，让学生更形象的了解蛋白质分离纯化实验的要点。
当然通过这节课的教学，我也收获了不少，让我对今后的实验课的教学有了更深刻的认识，更明确了上好一节科学课的基本模式，同时我也在思考一个问题：怎样在实验室上好科学课？我想这将是我们所有科学老师今后都要思考的问题，值得探究。
只有把这些问题解决了，才能在以后的教学中更上一层楼。
十、本实验近十年参考文献[1]《蛋白质纯化与鉴定实验指南》[J]．生物技术通讯，2004，(2)．[2]张轶华，杨更亮，张小乐，赵菊敏，蔡丽萍，陈义．阴离子交换整体柱对蛋白质的分离与纯化[J]．色谱，2005，（3）．[3]卜春苗，朱金霞,龚波林．强阳离子交换树脂在蛋白质分离纯化中的应用[J]．宁夏工程技术，2006，(1)．[4]刘兴华，赵浩如．天然糖蛋白的提取、分离与纯化[J].．药学进展，2006，(12)．[5]朱正威，孙万儒，赵占良．选修一生物技术实践．北京：人民教育出版社，2007,7:64-70．[6]王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学．北京：高等教育出版社，2005,4:298-312．十一、近十年相关考题（2008山东）34(8分) 科学家发现家蝇体内存在一种抗菌活性蛋白。
这种蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究者重视。
(1)分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子的__________、大小及形状不同，在电场中的___________不同而实现分离。
答案：所带电荷的性质，迁移速度【解析】（1）电泳法是常用的蛋白质的分离技术。
电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
因为多肽具有可解离的基团，在一定的pH下基团会带上电荷。
因此，在电场的作用下会向与所带电荷相反的电极移动。
因为待分离样品种各种分子的所带电荷的性质以及本身分子大小不同，使得带电分子产生不同的迁移速度，从而达到分离的目的。
（2009江苏） 23．下列关于DNA和蛋白质提取与分离实验的叙述，正确的有（）A．提取细胞中的DNA和蛋白质都需用蒸馏水胀破细胞B．用不同浓度NaCl溶液反复溶解与析出DNA可去除蛋白质C．蛋白质提取和分离过程中进行透析可去除溶液中的DNAD．蛋白质和DNA都可以用电泳的方法进行分离纯化答案BD【解析】A选项，在提取DNA时，如果是用动物的细胞需要用蒸馏水涨破，如果用植物细胞则不需要，而是用洗涤剂溶解细胞膜；B中，用2 mol／L的NaCl溶液溶解DNA，然后过滤出蛋白质，再降低NaCl溶液的浓度，析出DNA。
DNA和蛋白质样品都是带负电荷的，从负极向正极移动，移动的距离都和样品的分子量有关。
C中透析用以出去小分子物质，DNA是大分子物质。
D是常规方法，比如用十二烷基磺酸钠，可以根据其分子大小及所带电荷性质进行分离纯化。
（2009江苏） 30．回答下列与细胞有关的实验问题。
(1)下列4项实验中，需保持细胞生理活性的有_____(填序号)。
①观察叶绿体和原生质的流动②观察洋葱鳞片叶内表皮细胞中DNA的分布③探究酵母菌的呼吸方式④红细胞中血红蛋白的提取和分离【答案】⑴①③【解析】本题考查几个大纲实验的相关知识。
⑴①观察叶绿体和原生质的流动，③探究酵母菌的呼吸方式，都需保持生理活性；④提取红细胞中的血红蛋白需要破坏细胞结构，②观察细胞内的DNA分布需要杀死后染色，均会导致细胞活性丧失。
（2011广东）5．以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是( )A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比相对分子量较小的杂蛋白移动慢答案D 【解析】生理盐水和红细胞内的溶液为等渗溶液；各种细胞器和细胞核中都含有蛋白质，所以不含有细胞器和细胞核的红细胞内，蛋白质种类较少，提纯时杂蛋白较少；血红蛋白有颜色，所以在凝胶色谱法分离过程中易分辨，可用于监测；凝胶色谱法分离蛋白质，相对分子质量较小的易进入凝胶内部，移动速度比较慢，故血红蛋白比相对分子质量较小的杂蛋白移动快。
2011山东34．研究发现柚皮精油和乳酸菌素(小分子蛋白质)均有抑菌作用，两者的提取及应用如图所示（1）柚皮易焦糊，宜采用_________法提取柚皮精油，该过程得到的糊状液体可通过________除去其中的固体杂质。
(2)筛选乳酸菌A时可选用平板划线法或_______接种。
对新配制的培养基灭菌时所用的设备是______。
实验前需对超净工作台进行_________处理。
(3)培养基中的尿素可为乳酸菌A生长提供__________。
电泳法纯化乳酸菌素时，若分离带电荷相同的蛋白质，则其分子量越大，电泳速度___________。
(4)抑菌实验时，在长满致病菌的平板上，会出现以抑菌物质为中心的透明圈。
可通过测定透明圈的______________来比较柚皮精油和乳酸菌素的抑菌效果。
答案：(1)压榨过滤(2)稀释涂布平板法高压蒸汽灭菌锅紫外线消毒(3)碳源和氮源越慢(4)大小【解析】(1)植物芳香油的提取方法有蒸馏、压榨和萃取等。
具体采用哪种方法要根据植物原料的特点来决定。
柚皮易焦糊，宜采用压榨法提取柚皮精油。
压榨过程中得到的糊状液体需用过滤法除去其中固定杂质。
(2)筛选、纯化培养某一特定微生物时，常用平板划线法或稀释涂布平板法。
为防止杂菌的污染，需对器具培养基等进行消毒灭菌处理，培养基宜采用高压蒸汽灭菌锅进行高温灭菌处理，而超净工作台常使用紫外线或化学药物进行消毒处理。
(3)微生物培养过程中为微生物的生长提供氮源的有尿素、蛋白胨等含氮丰富的物质。
电泳法纯化特定生物成分，是利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，这些不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中不同分子的分离。
当待分离分子所带电荷相同时，分子量越大，电泳速度越慢。
(4)抑菌实验时，在长满致病菌的平板上，会出现以抑菌物质为中心的透明圈，透明圈越大，抑菌效果越好。
（2010•海南）13．某同学分离纯化了甲、乙两种噬菌体的蛋白质和DNA，重新组合为“杂合”噬菌体，然后分别感染大肠杆菌，并对子代噬菌体的表现型作出预测，见表。
其中预测正确的是A．1，4 B．1，3C．2，3 D．2，4【命题立意】本题通过表格的形式呈现了某同学重新组合的“杂合”噬菌体以及用该噬菌体侵染大肠杆菌后对于后代大肠杆菌的表现型的预测，要求学生能够根据DNA是遗传物质来推测正确的预测结果。
【思路点拨】因为DNA是遗传物质，所以判断子代噬菌体的表现型应该分析亲本“杂合”噬菌体的DNA来自哪种DNA。
【规范解答】选B。
DNA和蛋白质这两种物质中DNA是噬菌体的遗传物质。
所以组成成分为甲的DNA和乙的蛋白质的“杂合”噬菌体感染大肠杆菌后得到的子代噬菌体的表现型与甲种一致；组成成分为乙的DNA和甲的蛋白质的“杂合”噬菌体感染大肠杆菌后得到的子代噬菌体的表现型与乙种一致。
附蛋白质分离纯化的实验设计一、实验目的1.从鸡血中分离纯化出蛋白质。
2.掌握盐析沉淀法分离纯化蛋白质的原理与方法。
二、实验原理盐析沉淀法分离纯化蛋白质：利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在溶液中添加一定浓度的中性盐，使蛋白质从溶液中析出沉淀，从而使蛋白质分离出来。
三、实验材料新鲜鸡血液、硫酸铵溶液、生理盐水、蒸馏水、柠檬酸钠溶液、离心机、烧杯等。
四、方法步骤( 1) 收集并清洗鸡血用盛有柠檬酸钠溶液的烧杯装新鲜的鸡血( 防止鸡血凝固) ，然后将鸡血用生理盐水稀释，充分搅拌后转移到离心管中，进行离心分离。
( 2) 破碎鸡血细胞小心倒掉上清，下层细胞加入蒸馏水，剧烈震荡10min, 离心( V= 5000rpm) 10min。
取上清溶液, 用多层纱布过滤。
( 3) 盐析分离血红蛋白取上步滤液，在滤液中加入硫酸铵溶液，边加边搅拌，直到有沉淀析出，然后停止加入硫酸铵溶液，得到的沉淀就是蛋白质。
为得到纯度更高的蛋白质，可进行多次盐析沉淀。
( 4)表达与交流各小组根据自己的实验结果向全班同学讲述自己在实验过程中遇到的问题与对该实验改进的看法。