免疫组化试剂的正确使用

免疫组化试剂的选择

一抗的正确选择与使用

1. 首选单克隆抗体：单克隆抗体具有高特异性、高亲和力、交叉反应少等特点，避免与细胞或组织蛋白的非特异性结合，减少染色背景。

2. 多克隆抗体：最好是经样本来源种属正常血清吸附过，尽可能的减少非特异性着色背景。加一抗前，用封闭液（可以是BSA或二抗来源的正常动物血清）充分封闭，以阻断非特异性结合位点。

3. 跨膜分子的抗体选择：要注意免疫原是整个蛋白分子或是胞外区、胞内区。对于胞内区抗体，染色时需要使用穿孔剂，而胞外区抗体不必使用。

4. 正确使用：一般供应商都会提供稀释范围和使用方法。但由于供应商质捡所用组织不同，实验条件和操作人为误差，常常需要客户自己再重新选择比例。一般从供应商提供稀释比例的1/10稀释度始，作倍比稀释。

5. 保存：一抗体一般为液体

二抗的正确选择与使用

1. 种属来源要匹配：根据所用一抗选定二抗。一般来说，如果一抗是小鼠原性，二抗应选择兔/山羊或其它种属抗小鼠的抗体。目前，美国Vector公司和Zymed公司都有开发的用小鼠抗体检测小鼠组织的试剂盒，即一抗来源于小鼠，该试剂盒采用了通用非特异性封闭液和专利封闭内源性小鼠Ig的封闭液，可以得到清晰的染色背景。

2. 注意抗体同种型和亚型：确定一抗同种型和亚型后，可以选择抗一抗来源种属广谱Ig或针对一抗亚型的二抗。如一抗是小鼠IgG1, 可以选用山羊抗小鼠的Ig或IgG1的二抗。

3. 正确使用：也需要重新选择稀释比例。一般从供应商提供稀释比例的1/10稀释度始，作5倍比稀释。检测系统的正确选择

检测系统一般有酶法、荧光法和亲和放大系统：亲和素－生物素放大系统很常用，但由于内源性亲和素和生物素广泛存在，经典的SP、SRABC和LSAB法等常出现背景着色，尤其是内源性生物素丰富的肝、肾染色时很难避免。Zymed公司研发的非生物素放大试剂盒NAB和 Picture Plus试剂盒，采用多聚氨基酸支架偶联多个抗体和酶、荧光素等信号检测分子起到良好的放大效果，具有高敏、背景清晰等优点。

对于啮齿动物组织的免疫化学检测：由于啮齿动物非特异性结合强，最好选用美国Vector公司和Zymed公司都有开发的用小鼠抗体检测小鼠组织的试剂盒。

设立阳性对照和阴性对照

实验设立对照是证明实验系统正确性的标尺，为查找实验原因提供重要线索。

1. 阳性对照的选择：阳性对照是证明整个实验体系正确的重要依据，主要涉及所用缓冲液、稀释液、二抗和检测系统等因素。尤其在结果出现无信号时，为查找原因的提供重要线索。具体选择方法请参阅抗原修复有关章节。

2. 阴性对照的选择：有两种：一种是自身对照，指测试组织本身非抗原表达部位。一种是外部对照，指已证实不表达检测抗原的组织。设置阴性对照表明检测抗原特异性和非抗原表达部位的非特异性结合。一般自身对照比较常用，在同一张测试片上作，减少了操作误差，对照更可靠。

试剂保存

抗体试剂保存：抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。抗体浓度越高（浓度大于10mg/ml），越稳定，易保存；浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白蛋白作保护剂；必要时需要加0.01-0.15％NaN3防腐剂以延长保存时间。酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用NaN3，否则会抑制酶的活性。-抗体浓缩液应在-20℃保存，可以长达两年；用时取出，室温融解，如一次或短时间用不完，应进行小量分装，－20℃保存，避免反复冻融；融解后抗体于2－8℃可以保存一个月。（请参阅免疫组化基础知识有关章节。）

试剂盒保存：完整试剂盒未打开前于2－8℃可以保存一年，打开后，应根据说明书要求对具体试剂进行适当存放。一般标准品应放置－20℃，用不完的抗体试剂应小量分装－20℃保存。

免疫组化常见问题分析及处理方法详见第十二章。