食品中菌落总数的测定实验

食品中菌落总数的测定实验

一、实验目的：

了解稀释平板计数的原理，掌握涂抹平板培养法和混合平板培养法，认识细菌、放射菌、霉菌、的菌落特征。

二、原理

平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony-forming units，cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

该计数法的缺点是操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是这种计数方法最大的优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验，以及食品、饮料和水等含菌指数或污染度的检测

三、试剂和材料

1.仪器

恒温培养箱：（36 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。）

均质器或振荡器

无菌吸管：1 ml（0.01 ml 刻度）、10 ml（0.1 ml 刻度）或微量

移液器及吸头

无菌锥形瓶：容量250 ml、500 ml、

无菌培养皿：直径90 mm

菌落计数器

2.样品

1）平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基：蛋白胨

5.0 g 、酵母浸膏2.5 g 、葡萄糖1.0 g 、琼脂15.0 g、蒸馏水1

000 ml、pH 7.0±0.2。

将所有成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121 ℃高压灭菌15 min。

注：用平板计数琼脂，称取23.5 g于1 000 ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121 ℃高

压灭菌20min，冷却至45~47℃左右备用。

2）无菌生理盐水：氯化钠（NaCl）5.875g 蒸馏水(纯净水) 500ml 称取5.875ｇNaCl溶于500ml蒸馏水中，121 ℃高压灭菌20min。

3.器材

100ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、天平、称样瓶、

记号笔、酒精灯等。

四、操作及实验步骤

1.样品的稀释：25 g(ml)样品+225 ml 稀释液，均质。

10倍系列稀释。每递增稀释一次，换用 1 次1 ml 无菌吸管或吸头。

（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面）选择2个～3个适宜稀释度

的样品匀液，各取1 ml分别加入无菌培养皿内。吸取 1 ml 空白稀释

液作空白对照。每皿中加入15 ml～20 ml 平板计数琼脂培养基，并

转动平皿使其混合均匀。

2.培养：待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ±1 ℃培养48 h±2 h。水产品 30 ±1 ℃培养 72 h±3 h。（如果有弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约 4 ml），凝固后翻转平板。）

3.菌落计数：记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。

五、计算公式:

式中：N——样品中菌落数；

∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

六、实验数据：

10-1 3 10-2 1 空白0

NaCl水

10-10 10-2 1 琼脂0