离子迁移谱技术及其在生命分析化学中应用

离子迁移谱技术及其在生命分析化学中应用*李刚陈强赵建龙(中国科学院上海微系统与信息技术研究所生物芯片实验室上海200050)摘要离子迁移谱技术是一种气相环境下的电泳检测技术,具有快速、灵敏、运行成本低等特点。

作为一种重要的痕量化学物质检测技术,现已广泛应用于化学毒剂探测和机场、海关的毒品与爆炸物检测。

近年来,离子迁移谱技术与电喷雾和基质辅助解吸附等离子化技术的结合,以及与质谱技术的联用,使得该技术的应用迅速拓展到生物医学领域。

本文介绍离子迁移谱技术的主要原理并综述离子迁移谱技术在蛋白质化学、临床化学和药物化学等方面的应用。

关键词离子迁移谱生命分析化学蛋白质化学临床化学药物化学引言离子迁移谱(ion mobility spectrometry,I MS),又称等离子色谱,是一种气相环境下电泳技术,它是根据分析物分子质量、电荷和碰撞截面(即大小和形状)来分离和辨别分析物。

由于基于该技术构建的仪器具有简单、轻便的特性和突出的灵敏度,早在20世纪70年代I MS技术曾在分析检测领域引起广泛兴趣。

最初I MS技术的研究和开发应用主要在环境监测领域和作为气相色谱检测器方面。

但是,由于I MS理论不能很好地利用类似气相色谱或质谱的理论加以解释,因此经过一个短暂的繁荣期以后,从1974年至1979年有关IMS的文章明显减少,该阶段I MS技术也基本处于停滞状态。

在20世纪80年代中期,由于恐怖活动和毒品走私活动的日益猖獗,迫切需要发展快速灵敏的检测系统用于爆炸物和毒品的现场检测,因此I MS仪器和应用方面的研究又重新活跃起来,在过去的20多年里I MS技术有长足的发展,并已经逐步成为目前最受分析界宠爱的一种技术手段112,主要应用于挥发性有机化合物的分析,并且已经在军事和民用方面发挥重要作用12~42,在机场和车站用于爆炸物和走私毒品的检测;进行化学毒剂的监测。

最近,各种离子化技术的进步,又为I MS技术拓展其应用领域铺平道路。

该技术通过与电喷雾离子化技术(electrospray ionization,ESI)和基质辅助激光解吸附离子化技术(matrix-assisted laser-desorption ionization,MALDI)偶联开始在生物大分子分析15~72、细菌病毒检测分类18~102、药物有效成分分析111~132、生物体代谢产物检测114,152等方面显露出很好的应用前景。

1IM S技术工作原理目前IMS仪主要分为两种:一种是传统的I MS 仪,另一种是强场模式IMS仪。

111传统的IMS仪此仪器工作原理主要是基于产物离子(样品分子经离子化形成的产物)在大气压条件下弱电场中迁移率差异来实现分离鉴别,它通常包括离子化区、离子门、漂移区和探测器4个主要组成部分(见图1)。

其基本工作流程和具体操作可参见C reaser等人的综述1162。

图1离子迁移谱仪基本结构示意图112强场模式IMS仪强场模式I MS仪是利用离子迁移率在强场和弱场下的差异来分离和鉴别离子的,又称为强场非对称波形离子迁移谱(high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry,FAI MS)或差分离子迁移谱(dif-ferential ion mobility spectrometry,DMS)。

其基本结构和组成(见图2)。

强场模式I MS仪利用在漂移管横向施加一个非对称电场和一个线性变化的低压补偿直流电压,从而产生一个离子迁移率针对扫描电压的离子迁移图谱,实现样品的分析鉴定。

基本的工31作原理和流程可参见Guevremont 的综述1172。

基于强场的IMS 技术相对于传统的IMS 技术具有无需离子门、间隔排列的漂移环和孔径栅格等结构特点,可以简化漂移管的设计,从而可降低成本和减小仪器体积。

图2 强场非对称IMS 漂移管结构示意图2 IM S 技术在生命分析化学研究方面应用211 蛋白质化学近年来,蛋白质组学已成为生命科学研究热点,但目前瓶颈问题仍然是技术和方法问题。

随着IMS 技术的出现和发展,以及能较好地与成熟的质谱(mass spectrometry,MS)分析手段联用,从而扩展MS 方法分析化合物范围,为蛋白质组学研究提供一种新的解决方案。

首先ESI 和MALDI 等离子化技术的发展促进I MS 技术在液相生物样品方面应用。

众所周知,氨基酸分析对于我们理解蛋白质化学和确定蛋白质一级结构具有重要作用。

但是通常采用的氨基酸分析方法,如离子交换色谱、高效液相色谱或气相-质谱联用技术,需要复杂的衍生化预处理,或者分析过程耗时长。

最近有人尝试利用I MS 技术偶联ESI 离子化技术来进行氨基酸的快速分离分析1182,研究发现20种常见氨基酸在漂移管里都具有不同的漂移时间,且检测限可以低至pmol 和fmol 级,分析时间不到1s,因此该技术在蛋白质一级结构的快速高通量解析方面展示很好应用前景。

另外,IMS 技术结合ESI 离子化技术在分离多肽和蛋白质分子方面也有不俗表现,比如,W u 等人利用I MS 技术结合ESI 成功分离无法用MS 分离多肽同分异构体1192;McLean 等人发明一种基于I MS 技术生物大分子分离纯化装置,该装置采用MALDI 离子化技术,可以实现生物样品高选择性快速分离,特别是适用于蛋白组学研究。

I MS 技术很容易和已发展成熟的MS 技术集成,增加现有分析系统分离维度,提高信噪比,加快分析速度,并可以获取更全面信息。

目前将IMS 技术与ESI 和MALDI 等离子化技术偶联,并与MS 技术联用,已经在蛋白质和多肽分析研究方面取得相当大成功,成为蛋白质组学研究最强有力工具,特别是在大分子结构及构象分析方面显示非常突出优势。

Hudgins 等人利用高分辨率的I MS 技术成功地对含有甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸的多肽分子气相构象进行分析1202,获得一系列有意义的结果,比如缬氨酸在液相环境中并不倾向于形成螺旋结构,但是研究发现在气相环境下却容易形成螺旋结构;离子迁移率测量还显示,质子化的低聚甘氨酸比盐化的甘氨酸更紧凑,呈球形,具有更小的横截面。

说明在气相条件下,盐化的低聚甘氨酸并没有形成盐桥。

说明I MS 技术使我们能够很方便地研究气相条件下的生物分子的二级结构(如螺旋、B 折叠和无规卷曲等),优点在于气相条件下生物分子的偏好构象不会因为溶剂效应而受到影响,对于分析生物分子的构象,理解其结构与功能的关系非常有价值。

另外,利用I MS 技术对细胞色素c 的气相构象研究结果显示1212,在气相非溶剂环境下,细胞色素c 重构形成的构象与其在溶液条件下的结构一样紧凑,其他几种蛋白分子的高效I MS 测试均显示液相构象与气相构象的相关性,说明IMS 技术可以作为一种快速灵敏的方法用于探测蛋白质分子液相构象。

翻译后修饰(如磷酸化、糖基化等)是蛋白质调控其活性/功能的重要方式,也是蛋白质组学研究的重要内容,因此分离筛选磷酸化、糖基化的多肽和蛋白质具有重要意义。

但是利用常规方法分离筛选翻译后修饰的蛋白质,往往非常困难,比如磷酸化的信号蛋白丰度相对于细胞的其它组分非常低,通常需要在大量非磷酸化的多肽背景下进行,需要非常复杂繁琐且耗时的分离过程。

Ruotolo 等人利用I MS/MS 技术对磷酸化和非磷酸化的多肽进行一系列分离分析研究,结果显示I MS 结合MS 技术可以实现磷酸化多肽快速高通量分离筛选分析1222。

212 临床化学对食品、环境、病人体内的病原菌进行检测和鉴定是临床化学的重要内容,目前常用的检测方法包括免疫学方法或基于聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增方法,免疫学方法往往需要预富集和培养过程(可能耗时数天),而PC R 方法需要提取样品中无污染的核酸序列,且整个过程也需要耗时数小时。

由32于IMS技术无需特定试剂盒、成本低、速度快,最近美国Ohio大学的Ochoa等人尝试利用I MS技术对完整的细菌进行快速检测鉴定1102,他们采用热解吸附对样品进行处理,并结合化学统计学建模方法对完整的细菌进行快速(2min/样品)检测鉴定,准确率达到96%,灵敏度可达到4@106个/样品。

还有其它几个研究小组研究结果表明通过I MS技术检测特定分子成分可以确定特定细菌类型存在182,比如通过检测吡啶二羧酸可以判定某些革兰氏阳性菌(如炭疽孢子)存在。

这些研究表明IMS技术在检测细菌特定组分和分辨细菌系及种类方面具有很大潜力。

另外IMS技术还可用于对完整的病毒颗粒进行分离检测,最近有人利用I MS技术结合ESI离子化技术对鼻病毒、腺病毒进行检测192。

I MS技术还可通过检测体液成分中某些指标,直接为临床医生提供诊断信息。

利用I MS技术对血液中脂蛋白进行检测分析,为临床的心脏病诊断提供信息。

还有通过I MS技术检测阴道粘液中的生物胺,来对细菌性阴道炎和其他阴道感染疾病进行诊断1232。

从人口腔呼出的气体实际上是人体代谢的产物,其中包含着许多反映人体健康状况重要信息。

在人体呼出气体中大约包含近200种不同化合物成分,有些与各种疾病,如胃病、心脏病和肺癌等紧密相关。

由于I MS技术在检测挥发性化合物方面突出优势,因此该技术非常适用于检测口腔中呼出的气体代谢产物。

Ruzsanyi等人利用IMS技术偶联多毛细管柱分别对健康人呼出的气体和肺病患者呼出的气体进行分析检测,两者的I MS谱图清楚地显示两者代谢产物的差异,比如患者呼出气体的I MS谱图中包含一些额外的谱峰,它们与抗生素、细菌代谢产物等相关1142。

这些研究表明通过IMS技术检测呼出气体代谢产物,为医生提供一种新的、非侵入式的临床快速诊断方法。

213药物化学痕量检测和分析在药物研究和开发的许多方面都有非常重要的作用,I MS技术作为一种快速、灵敏的痕量检测技术,最近在药物活性成分的快速筛查、中药研究和药物的体内分析方面开始受到重视和应用。

Cui等人利用FAI MS技术结合ESI和MS技术对常用的癌症化疗药物顺铂及其水化产物进行分离分析1242,FAIMS技术超强的过滤能力使得系统检测信号的背景大大降低,信噪比提高约30倍。

该方法无需衍生化和预先的色谱分离,且检测限比传统的ESI-MS方法至少降低2个数量级,显示很好的应用优势。

利用I MS技术进行药物临床试验盲测1252,通过测定药物中活性成分来进行判定。

他们对20个样品进行盲测,结果准确率为100%。

Weston等人利用I MS技术结合解吸附ESI技术和MS技术对几种非处方药和处方药1132,包括组胺H2受体的拮抗剂、止痛剂、安眠药、芳香族酶抑制剂抗癌药等,进行检测,成功地确定出这些药物配方。

还有人将I MS技术用于药物生产中质控,如监测药物配方中防腐剂1122。