生防解淀粉芽孢杆菌Bs-18 TnYLB-1突变体文库的构建
生防菌解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的研究进展
生防菌解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的研究进展出晓铭1，2，林毅雄1，2，张珅1，2，严芬1，3，林河通1，2（1．福建农林大学食品科学学院，福州350002；2．福建农林大学农产品产后技术研究所，福州350002；3．福州大学生物科学与工程学院，福州350108）摘要：生防解淀粉芽孢杆菌具有强烈抑制真菌和细菌的能力，在果蔬采后病害防治方面具有巨大的应用潜力。
该文对解淀粉芽孢杆菌产生的抗菌蛋白、蛋白的分离纯化、抑菌机理和生防应用等方面进行了综述，并对其在果蔬采后病害防治应用前景进行了展望。
关键词：解淀粉芽孢杆菌；抗菌蛋白；采后病害；生物防治中图分类号：S476；TS255．3文献标志码：A 文章编号：1005－1295（2014）06－0049－06doi ：10．3969/j．issn．1005－1295．2014．06．013Ｒesearch Advances of Antifungal Proteins Produced by Biocontrol Bacterium ，Bacillus amyloliquefaciensCHU Xiao-ming1，2，LIN Yi-xiong 1，2，ZHANG Shen1，2，YAN Fen1，3，LIN He-tong 1，2（1．College of Food Science ，Fujian Agriculture and Forestry University ，Fuzhou 350002，China ；2．Institute of Postharvest Technology of Agricultural Products ，Fujian Agriculture and Forestry University ，Fuzhou 350002，China ；3．College of Biological Science and Engineering ，Fuzhou University ，Fuzhou 350108，China ）Abstract ：Bacillus amyloliquefaciens is a kind of biocontrol bacterium which has great ability against fungi and bacteria ，thereby it has high research values and potential for development in biological control of posthar-vest diseases of fruits and vegetables．The separation and purification of antifungal proteins produced by Bacil-lus amyloliquefaciens ，the disease resistant mechanisms and the application of biocontrol of antifungal proteins were summarized．The future potential application in biocontrol of postharvest diseases of fruits and vegetables was also discussed．Key words ：Bacillus amyloliquefaciens ；antifungal proteins ；postharvest diseases ；biological control 收稿日期：2014－06－23；修稿日期：2014－07－16基金项目：国家科技支撑计划专项（2007BAD07B06）；福建省高等学校新世纪优秀人才支持计划（闽教科〔2007〕20号）资助作者简介：出晓铭（1990－），男，硕士，研究方向为食品科学。
《解淀粉芽孢杆菌TJ抑菌物质的研究》
《解淀粉芽孢杆菌TJ抑菌物质的研究》一、引言解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一种广泛存在于土壤中的细菌，近年来引起了人们的关注，特别是其在植物生物防治中的应用潜力。
而本研究将专注于探讨一种来自解淀粉芽孢杆菌TJ（Bacillus amyloliquefaciens TJ）的抑菌物质，通过对其特性的研究，旨在了解其抑菌机制及其在农业上的应用价值。
二、材料与方法（一）材料1. 菌种：解淀粉芽孢杆菌TJ、测试的病原菌（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等）。
2. 培养基：营养肉汤培养基、LB培养基等。
（二）方法1. 抑菌物质的提取与纯化：通过发酵、离心、浓缩、纯化等步骤提取解淀粉芽孢杆菌TJ的抑菌物质。
2. 抑菌活性检测：采用琼脂扩散法、微量稀释法等方法检测抑菌物质的活性。
3. 成分分析：利用生物化学、分子生物学等技术分析抑菌物质的化学成分和结构。
4. 抑菌机制研究：通过电子显微镜观察、基因敲除等方法研究抑菌物质的抑菌机制。
三、实验结果（一）抑菌物质的提取与纯化经过一系列的发酵、离心、浓缩和纯化步骤，成功从解淀粉芽孢杆菌TJ中提取出具有较强抑菌活性的物质。
（二）抑菌活性检测实验结果表明，该抑菌物质对多种病原菌（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等）均具有较强的抑制作用。
此外，该物质对植物病原真菌也具有一定的抑制作用。
（三）成分分析经过生物化学和分子生物学分析，发现该抑菌物质主要由多种肽类化合物组成，具有较高的生物活性。
其中，某些肽类化合物可能具有特定的作用机制，如干扰病原菌的细胞膜结构等。
（四）抑菌机制研究研究发现，该抑菌物质主要通过破坏病原菌的细胞膜结构，干扰其代谢过程，从而达到抑制其生长的作用。
此外，该物质还可能通过其他机制（如诱导病原菌产生抗性等）发挥其抑菌作用。
四、讨论本研究成功从解淀粉芽孢杆菌TJ中提取出一种具有较强抑菌活性的物质，并对其化学成分和抑菌机制进行了初步研究。
一株用于防控黄曲霉毒素B1污染的解淀粉芽孢杆菌及其应用[发明专利]
![一株用于防控黄曲霉毒素B1污染的解淀粉芽孢杆菌及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/59030e42dcccda38376baf1ffc4ffe473368fd13.png)
专利名称：一株用于防控黄曲霉毒素B1污染的解淀粉芽孢杆菌及其应用
专利类型：发明专利
发明人：王洁,陈国浚,房倩安,方祥,廖振林,钟青萍,王丽,徐纯伟,梁智博
申请号：CN202210148253.8
申请日：20220217
公开号：CN114644995A
公开日：
20220621
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一株用于防控黄曲霉毒素B1污染的解淀粉芽孢杆菌及其应用。
本发明提供的芽孢杆菌WF2020，已于2022年1月5日保藏于广东省微生物保藏中心，保藏号GDMCCNO:62190。
本发明研究表明，WF2020菌株能大幅度抑制黄曲霉的生长，使其干重减少52.59％；同时，WF2020菌株可完全抑制黄曲霉毒素B1的合成；另外，WF2020菌株可高效的将黄曲霉毒素B1降解成无毒的物质，降解率高达95.47％，且该菌株的发酵液或胞内物也能降解黄曲霉毒素B1，同时发酵液还具有高温耐受性。
并且，WF2020菌株在使用过程中无污染、无公害，作为理想的防控农产品黄曲霉毒素B1污染的微生物。
申请人：华南农业大学
地址：510642 广东省广州市天河区五山路483号
国籍：CN
代理机构：广州粤高专利商标代理有限公司
代理人：赵崇杨
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一株解淀粉芽孢杆菌生防蛋白的鉴定及分析
一株解淀粉芽孢杆菌生防蛋白的鉴定及分析郭继平;马光;王志杰;齐善厚;王宝梅;苏长青【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2018(034)001【摘要】旨在鉴定一株拮抗葡萄霜霉病的解淀粉芽孢杆菌在NA液体培养基中的分泌蛋白中与生物防治相关的蛋白组分.采用蛋白质谱的方法对前期筛选到的一株拮抗葡萄霜霉病的解淀粉芽孢杆菌生防菌的在NA液体培养基中的分泌蛋白进行了鉴定.对鉴定到的蛋白采用基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)的方法进行蛋白质组学分析,筛选与生物防治相关的蛋白.结果表明,从分泌蛋白中鉴定到了确定的53种蛋白质,其相对分子量大部分集中到0-100之间(占79.24％);涉及碳水化合物代谢、能量代谢、脂类代谢、氨基酸代谢和生物防御等过程,以及作为细胞组分参与结构组成.发现了6种参与植物与病原菌互作的蛋白,2种属于氨基肽酶家族,4种参与几丁质的生物降解过程.%It is aimed at the identification of protein composition with biocontrol function in the secretory protein while a strain of being antagonistic grape downy mildew,Bacillus amyloliquefaciens,was cultured in NA liquid medium,which was carried out by protein profile. The proteomics of the identified proteins was analyzed by gene ontology and KEGG pathway for screening the proteins related to biocontrol. The results showed that 53 proteins were identified from the secreted proteins. Their relative molecular weights were mostly(79.24％)in 0-100. The proteins involved in the processes of carbohydrate metabolism,energy metabolism,lipid metabolism,amino acidmetabolism,bio-defense,etc. They also were the cellular components in structural composition. Six proteins involved in the interaction of plant and pathogen were discovered,and among them,two belonged to the aminopeptidase family,and four were involved in the biodegradation of chitin.【总页数】6页(P202-207)【作者】郭继平;马光;王志杰;齐善厚;王宝梅;苏长青【作者单位】衡水学院生命科学系,衡水 053000;衡水学院生命科学系,衡水053000;衡水学院生命科学系,衡水 053000;衡水学院生命科学系,衡水 053000;宝鸡市农业科学院,宝鸡 722400;衡水学院生命科学系,衡水 053000;中国农业科学院植物保护研究所,北京 100193【正文语种】中文【相关文献】1.一株香蕉枯萎病生防解淀粉芽胞杆菌的分离、鉴定及其拮抗物质研究 [J], 陈燕红;陈远凤;黎永坚;喻国辉2.一株产淀粉酶、蛋白酶益生芽孢杆菌的分离与鉴定 [J], 张国庆;董晓芳;佟建明;王志红;张琪3.解淀粉芽孢杆菌Bs-18生防功能相关基因的初步鉴定 [J], 孙淑琴;杨秀荣;孙冰冰;张惟4.一株具有广谱抗真菌活性的解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定 [J], 刘小玉;付登强;刘立云;黄丽云;齐兰5.一株具有产IAA能力的解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及功能评价 [J], 陈迪;芮凯;曾涛;田威;马瑞;谢圣华;罗诗彤因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
解淀粉芽孢杆菌β-1
０８ｂ ９ ｌ３ ， 葡聚糖 酶基 因（ｇ ， ．ｋ 的 一 ， ｌ４一 ｂｌ 构建 了重 组表达质 粒 ｐ ６ ， Ａ） Ｑ一 ｇ 通过 电转 化的方法将 其转化入解 淀粉芽孢 杆 菌
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解 淀 粉 芽孢 杆 菌 ｐ一１３—１４一葡 聚 糖酶 的高效 表 达 ， ，
陈 玉娟 ， 微 ， 沈 陈献 忠 ， 正祥 ‘ 王
（ 江南大学 生物 工程 学院生物能源与生物资源研究 中心 ， 江苏 无锡 ２４ ２ ） １ １２
摘要 ： 目的 ： 克隆解淀粉芽孢杆菌 Ｂ １３ ， 葡 聚糖 酶基 因（ｇ 使其在解 淀粉芽孢杆 菌 ＣＣＭ Ｂ０ １ 一 ，一ｌ ４一 ） ＩＩ ４８ 中高效表达 ， 并
（ ｅｔ ｒＢｏｅｏｒｅａｄＢｏｎｒｙ Ｓ ｈｏ ｏ ｉｅｈ ｏ ｇ ， ｉｎｎｎＵ ｉ ｒｔ，Ｗｕ ｉ １ １２ Ｃ ｉａ Ｃ ｎｅ ｆ ｉｒｓｕｅ ｎ ｉ ｅｇ ， ｃｏｌ ｆＢｏ ｃ ｎｌ ｙ Ｊ ｇ ａ ｎｖ ｓｙ ｒｏ ｅ ｔ ｏ ａ ｅｉ ｘ ２ ４ ２ ， ｈｎ ）
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《2024年生防萎缩芽孢杆菌β-l,3-葡聚糖酶拮抗功能的研究》范文
《生防萎缩芽孢杆菌β-l,3-葡聚糖酶拮抗功能的研究》篇一摘要本文旨在探讨生防萎缩芽孢杆菌所产β-l,3-葡聚糖酶的拮抗功能。
通过实验室研究，分析该酶的生物活性、作用机制及其在农业生物防治中的应用潜力。
研究结果表明，该酶具有显著的拮抗病原菌的能力，对农业病害的控制具有重要意义。
一、引言随着现代农业的快速发展，植物病害成为制约农业生产的重要因素之一。
生物防治作为一种环保、可持续的病虫害防治方法，日益受到科研工作者的关注。
生防萎缩芽孢杆菌作为一种重要的生防微生物，其产生的酶类物质在植物病害的生物防治中发挥着重要作用。
其中，β-l,3-葡聚糖酶作为一种重要的水解酶，在植物细胞壁的降解及病原菌的抑制中具有关键作用。
因此，研究该酶的拮抗功能对于推动生物防治技术的发展具有重要意义。
二、材料与方法1. 材料本研究所用生防萎缩芽孢杆菌菌株来自本实验室保存，β-l,3-葡聚糖酶的提取参照已有文献方法。
病原菌采用常见植物病原菌，如真菌和细菌。
2. 方法（1）酶的提取与纯化：采用合适的方法从生防萎缩芽孢杆菌中提取β-l,3-葡聚糖酶，并进行纯化。
（2）酶活性测定：通过酶活性测定方法，测定β-l,3-葡聚糖酶的活性。
（3）拮抗功能研究：将β-l,3-葡聚糖酶与病原菌共同培养，观察其对病原菌生长的影响，并分析其作用机制。
（4）田间试验：在田间条件下，评价β-l,3-葡聚糖酶对植物病害的控制效果。
三、结果与分析1. 酶的提取与纯化通过适当的提取与纯化方法，成功从生防萎缩芽孢杆菌中获得了纯度较高的β-l,3-葡聚糖酶。
2. 酶活性测定测定结果显示，该酶具有较高的活性，能够在适宜条件下有效水解葡聚糖。
3. 拮抗功能研究（1）体外实验：在体外条件下，β-l,3-葡聚糖酶对常见植物病原菌具有显著的拮抗作用，能够抑制病原菌的生长。
（2）作用机制：该酶通过水解病原菌细胞壁的主要成分葡聚糖，破坏其结构，进而抑制病原菌的生长与繁殖。
同时，该酶还能诱导植物产生抗病性，提高植物的抗病能力。
解淀粉芽孢杆菌YN-1抑制植物病原真菌活性物质鉴定
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肽抗生素为活性粗提物 中的主要成分。该研究结果为利用 Ｙ 一 Ｎ １菌株开发成微生物 杀菌剂奠定 了基础。 关键词 ：解淀粉芽孢杆菌 ； 脂肽抗生素 ； 鉴定
Ｉ ｅ ｔ ｉａ ｉ ｆｔ ｅ ａ ｔｆ ｎ ａ ｓ ｂ ｔ ｎ ｅ ｒ ｍ Ｂ ｃｌ ｓ ａ ｙｏ ｉ ｕ ｆ ｃ ｅ ｓ ｓ ｒ ｉ ｄ ｎ ｉｃ ｔ ｆ ｏｎ ｏ ｈ ｎ ｉ ｇ ｌ ｕ ｓ ａ ｃ ｓ ｆＯ ｕ ａ ｉ ｕ ｍ ｌ ｌ ｅ ａ ｉ ｎ ｔａ ｎ ｌ ｑ ＹＮ一 Ｄ ＮＧ Ｊ ｎ１ ｎ ，ＬＵ Ｈ ｎ —ａ Ｉ ｕｘａ ，Ｌ Ｕ Ｘ ｎｔ １ Ｅ ｉ ．ａ ｇ＇ ａ ｉ Ｉ ｏ ｇｙ ｎ ，Ｌ Ｕ Ｙ ．ｉ Ｉ ｉ． ｏ ，ＮＩ ｕ ．ｉ ， Ｇ Ｏ Ｓ ｉ ， ａ ｎｘａ Ｙ Ａ ｕｘａ
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一种重组解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用[发明专利]
![一种重组解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/c175a37ee418964bcf84b9d528ea81c758f52e9a.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810537614.1(22)申请日 2018.05.30(71)申请人 南京工业大学地址 210000 江苏省南京市浦口区浦珠南路30号(72)发明人 徐虹 沙媛媛 李莎 许宗奇 冯小海 邱益彬 张亚涛 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204代理人 肖明芳(51)Int.Cl.C12N 1/21(2006.01)C12N 15/55(2006.01)C12N 15/75(2006.01)C12N 15/65(2006.01)C12N 15/66(2006.01)C12P 13/02(2006.01)C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称一种重组解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种重组解淀粉芽孢杆菌的构建方法，以消除内源质粒的解淀粉芽孢杆菌为宿主菌，将聚谷氨酸降解酶基因pgdS插入pNX01载体的Spe I和Not I酶切位点之间得到重组质粒，再将重组质粒导入宿主菌中，即得。
本发明还公开了所述构建方法构建得到的重组解淀粉芽孢杆菌及其在发酵产γ-聚谷氨酸中的应用。
本发明将发酵生产γ-PGA和聚谷氨酸降解酶过程相偶联，实现一步发酵直接获取低分子量γ-PGA和聚谷氨酸降解酶两种产物，在产高分子γ-PGA的过程中，γ-PGA被同时分泌到胞外的聚谷氨酸降解酶水解，避免了外源添加降解酶的繁琐，简化了生产工艺，一步发酵合成低分子聚谷氨酸。
权利要求书2页 说明书13页序列表9页 附图3页CN 108624546 A 2018.10.09C N 108624546A1.一种重组解淀粉芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，以消除内源质粒的解淀粉芽孢杆菌为宿主菌，将聚谷氨酸降解酶基因pgdS插入pNX01载体的Spe I和Not I酶切位点之间得到重组质粒，再将重组质粒导入宿主菌中，即得。
一株解淀粉芽孢杆菌及其应用[发明专利]
![一株解淀粉芽孢杆菌及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/b5cacb9b7fd5360cbb1adb53.png)
专利名称：一株解淀粉芽孢杆菌及其应用专利类型：发明专利
发明人：刘洪亮,王慧,于琳
申请号：CN201510702202.5
申请日：20151026
公开号：CN105176889A
公开日：
20151223
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一株解淀粉芽孢杆菌及其应用，本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。
本发明的目的是要解决现有防治玉米大斑病中化学药剂对环境污染，病菌易产生抗药性，且对玉米增产效果不好的问题。
本发明的一株解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus？amyloliquefaciens)KB1-01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2014年09月12日，保藏编号为CGMCC？No.9649。
本发明的应用是指在抑制玉米大斑病菌的同时增加玉米产量上的应用。
本发明对玉米大斑病的防效为80.8％，玉米增产率为18.26％。
本发明应用于农业领域。
申请人：刘洪亮
地址：150038 黑龙江省哈尔滨市公滨路37号
国籍：CN
代理机构：哈尔滨市松花江专利商标事务所
代理人：侯静
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一株解淀粉芽胞杆菌生防功能基因序列及其应用[发明专利]
![一株解淀粉芽胞杆菌生防功能基因序列及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/796b98e6f12d2af90342e678.png)
专利名称：一株解淀粉芽胞杆菌生防功能基因序列及其应用专利类型：发明专利
发明人：孙淑琴,杨秀荣,孙冰冰,霍建飞,张惟
申请号：CN201910326009.4
申请日：20190423
公开号：CN109988776A
公开日：
20190709
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一株解淀粉芽胞杆菌Bs‑18的生防功能基因序列。
野生生防菌株解淀粉芽胞杆菌Bs‑18防治黄瓜白粉病菌大田防治效果达79.2%，通过构建Bs‑18的突变体文库，从突变体库中筛选到一株生防功能发生明显变化的突变体T4‑7，反向PCR方法获得其插入基因片段的序列。
为了验证此基因片段与生防作用相关，通过电击转化的方法获得了基因恢复株，大田防治试验结果表明基因恢复株的生防效果高于T4‑7菌株，但又略低于野生生防菌株Bs‑18。
由此说明此基因片段与生防菌株
Bs‑18的生防作用相关，可以达到防治黄瓜白粉病菌的目的。
申请人：天津市植物保护研究所
地址：300384 天津市西青区津静公路17公里
国籍：CN
代理机构：天津市杰盈专利代理有限公司
代理人：朱红星
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解淀粉芽孢杆菌Bs-18生防功能相关基因的初步鉴定
解淀粉芽孢杆菌Bs-18生防功能相关基因的初步鉴定孙淑琴;杨秀荣;孙冰冰;张惟【摘要】本研究利用平板筛选法,从转座子TnYLB-1转化的解淀粉芽孢杆菌Bs-18的突变体文库中筛选到生防作用发生明显变化的3株突变株.以这3株突变株为材料,通过反向PCR技术对突变体中转座子插入位点的侧翼序列进行BLAST比对分析,发现它们与野生芽孢杆菌的芽孢形成、细胞分离、细胞的一系列代谢活动等有关.【期刊名称】《山东农业科学》【年(卷),期】2019(051)003【总页数】4页(P13-15,23)【关键词】解淀粉芽孢杆菌;突变体文库;反向PCR【作者】孙淑琴;杨秀荣;孙冰冰;张惟【作者单位】天津市植物保护研究所,天津 300381;天津市植物保护研究所,天津300381;天津市植物保护研究所,天津 300381;天津市植物保护研究所,天津300381【正文语种】中文【中图分类】S476.1;Q781解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的革兰氏阳性细菌，它广泛分布在自然界中，易于分离培养；并且具有广谱的抗菌活性，对人畜无毒，不污染环境，抗逆能力强，稳定性好，所以很适合作为生防菌大量生产和应用[1]。
本实验室从黄瓜根际土壤中分离到1株对黄瓜白粉病具有较好防效的生防菌株Bs-18(大田防效达79.2%)，为从分子水平揭示此生防菌株的生防机制，更好地开发和应用该生防菌株，本实验室利用携带转座子TnYLB-1的质粒pMarA为插入质粒，构建了容量为2 000株的野生菌株Bs-18的转座插入突变体文库。
本试验通过室内平板抑菌法从突变体文库中筛选生防效果发生明显变化的突变株，并通过反向PCR技术[2]对突变体转座子插入位点的侧翼序列进行测序分析，获得可能与生防相关的功能基因，以期为生产上合理应用该生防菌株提供理论指导，并为野生型菌株的改造、与菌株定殖及促生相关新基因的发掘及研究基因的未知功能奠定基础。
生防菌解淀粉芽孢杆菌KL-1的生物安全性检测
生防菌解淀粉芽孢杆菌KL-1的生物安全性检测吴雨龙;贲爱玲;江海涛;杨齐;高晨阳【摘要】To detect the biological safety of Bacillus amyloliquefaciens KL-1 , acute oral toxicity-fixed dose proce-dure, chromosomal aberration, bone marrow cell micronucleus and phagocytic function of macrophage tests were carried out in mice. The results showed that there were no significant signs of toxicity and mortality in acute toxicity study in 14 days, and the oral lethal dose of Bacillus amyloliquefaciens KL-1 was more than 2000 mg/kg. The re-sults of chromosomal aberration test, bone marrow cell micronucleus test and macrophage phagocytic function test were all negative. Therefore, it is concluded that Bacillus amyloliquefaciens KL-1 has no toxic and side effects on mammals, and this provides the evidence for the safe use of this strain as a biological pesticide.%为了检测解淀粉芽孢杆菌KL-1菌株的生物安全性,以小鼠为对象,经口急性毒性试验固定剂量法、染色体畸变分析法、骨髓细胞微核分析法和巨噬细胞吞噬功能分析法评价解淀粉芽孢杆菌KL-1对哺乳动物的安全性.结果表明,14 d的观察中,急性毒性试验中各组小鼠未出现明显中毒症状和死亡情况,且解淀粉芽孢杆菌KL-1对小鼠的半数致死量( LD50)超过2000 mg/kg.染色体畸变分析、骨髓细胞微核分析和巨噬细胞吞噬功能分析结果均为阴性.由此可推断解淀粉芽孢杆菌KL-1菌株对哺乳动物安全无毒副作用,为该菌株作为生物农药的安全使用提供依据.【期刊名称】《南京晓庄学院学报》【年(卷),期】2016(000)006【总页数】7页(P79-85)【关键词】生防菌;解淀粉芽孢杆菌KL-1;安全性【作者】吴雨龙;贲爱玲;江海涛;杨齐;高晨阳【作者单位】南京晓庄学院食品科学学院，江苏南京211171;南京晓庄学院食品科学学院，江苏南京211171;南京晓庄学院食品科学学院，江苏南京211171;南京晓庄学院食品科学学院，江苏南京211171;南京晓庄学院食品科学学院，江苏南京211171【正文语种】中文【中图分类】S476芽胞杆菌(Bacillus)属于细菌科，能形成芽孢(内生孢子)的杆菌或球菌.大多数芽胞杆菌能产生多种高活性胞外产物，如挥发性抗菌物质、抗生素、细菌素以及多种酶类，具有抑菌[1]、杀虫[2]和抗肿瘤[3，4]等作用.目前，国内外研究较多的芽孢杆菌有解淀粉芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌等.解淀粉芽孢杆菌的基本菌落形态是白色，半透明，光滑、潮湿的菌落，略隆起，整齐圆形菌落.解淀粉芽孢杆菌在自然界中分布广泛，它可以抑制各种真菌与细菌，并且具有丰富的自身代谢产物.王英国等[5]研究发现解淀粉芽孢杆菌对于草莓蛇病菌、尖孢镰刀菌等植物病原真菌都具有很强的抑制作用；李潞滨等[6]研究表明解淀粉芽孢杆菌ZL725能对尖孢镰刀菌产生拮抗活性；此外，解淀粉芽孢杆菌对病原真菌(灰葡萄孢、链格孢、粉红单端孢等)具有显著且广谱的拮抗作用；还能抑制大肠杆菌的生长繁殖，还可以抑制菌丝进一步形成菌核[7-9].解淀粉芽孢杆菌可有效地降低叶和种子的病害.随着研究技术的不断提高，解淀粉芽孢杆菌的功能被更多地了解，其大规模应用也具备了客观条件，在不久的未来将会被广泛应用于生物农药[10].但是有关其安全性研究尚未见报道，本研究通过小鼠急性毒性试验、染色体畸变分析、骨髓细胞微核分析和巨噬细胞吞噬功能分析，对菌体的安全性进行了初步研究，为其临床应用提供参考.1.1 材料与试剂解淀粉芽孢杆菌KL-1菌株，由南京晓庄学院食品科学学院生物实验中心提供.ICR小鼠，动物合格证号：SCXK(苏)2012～0004，体质量18～25 g，扬州大学比较医学中心提供.LB 琼脂培养基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂粉15～20 g加蒸馏水定容至1000 mL，pH=7.0±0.2，分装若干，在121 ℃下高压灭菌30 min，取出备用.LB 液体培养基：不加琼脂，其余同LB 琼脂培养基.1.2 仪器与设备高速冷冻离心机 (美国热电公司)； NIKON 50i生物显微镜 (日本尼康公司)；全自动血液分析仪 (法国COMPACT公司)；全自动生化分析仪和AU5800全自动生化分析仪 (美国Beckman Coulter 公司).1.3 方法1.3.1 菌株的活化及菌液的制备将保藏的解淀粉芽孢杆菌KL-1通过无菌操作接种到LB固体培养基上培养，挑选生长旺盛的菌落接种到新无菌培养基上，重复2～3次，从而获得生长较好的纯菌株，将纯的菌株接种于无菌的LB液体培养基中，置摇床中170 r/min，28 ℃大量培养.将生长至对数生长期的解淀粉芽孢杆菌KL-1(18 h)离心(4000 r/min，4 ℃，10 min)，收集菌体，用无菌的PBS (pH 7.4)洗2次，最后重悬于无菌的PBS中，调节细菌的浓度为1×108 CFU/mL，4 ℃保存备用.1.3.2 经口的小鼠急性毒性试验预试验中灌胃不同剂量解淀粉芽孢杆菌KL-1未对小鼠产生明显的毒副作用，因此正式试验采用限度试验[11].取ICR小鼠20只，雌雄各半，体重22～25 g，在室温22 ℃±3 ℃，湿度30%～70%，自由摄食、饮水的饲养条件下，适应性饲养5 d 后，随机分成2组，每组10只，一组为空白对照组，另一组为试验组，正式给药前禁食3～4 h，自由饮水.试验组灌胃浓度为1×108 CFU/mL的解淀粉芽孢杆菌KL-1菌液0.4 mL(剂量相当于2 000 mg/kg)，空白对照组灌胃同体积无菌PBS液[12].染毒后前30 min观察一次，当天需进行多次密切观察(特别染毒后4h内)，以后每天注意观察，连续观察14 d，记录小鼠的进食、活动、大小便、精神等全身反应状况及死亡情况.分别在第1 d、7 d、14 d时称量各组小鼠体重.试验结束后，小鼠麻醉后取血，测定血液常规指标和血液生化指标，颈椎脱臼法快速处死小鼠后进行剖检，详细检查和记录各脏器的眼观变化，取心、肝、脾、肺、肾等脏器称重，并计算脏器指数[13].1.3.3 染色体畸变分析取ICR小鼠30只，随机分为5组，每组6只，雌雄各半，设阴性对照组、阳性对照组和解淀粉芽孢杆菌KL-1低、中、高3个试验组.其中试验组按106 CFU/mL、107 CFU/mL、108 CFU/mL每天分别灌胃小鼠解淀粉芽孢杆菌KL-1菌液0.4 mL，连续5 d.阴性对照组灌胃同体积无菌PBS液，连续5 d.阳性对照组腹腔注射30 mg/kg环磷酰胺1次.在处死动物前2～3 h，腹腔注射秋水仙素4 mg/kg.颈椎脱臼法处死小鼠，迅速取出双侧股骨，去肌肉，擦净血污，剪开两端关节面，用注射器吸PBS液5 mL冲出骨髓于离心管中，1 500 r/min，离心10 min，去上清.加入预热(37 ℃)的0.075 mol/L KCl约6 mL，混匀，37 ℃低渗15 min，再加固定液(甲醇∶冰醋酸=1∶3)2 mL，混匀，1 000 r/min离心10 min，去上清.再加入上述固定液4 mL混匀，室温放置15 min，然后1 000 r/min离心10 min，去上清.重复一次，去上清，留约0.5 mL.将细胞悬液滴于冰冻载玻片上，干燥，用10% Giemsa染液染色15 min，用蒸馏水冲洗，干燥备检.每只动物观察100个中期分裂相细胞，计算染色体畸变百分率.1.3.4 骨髓细胞微核分析取ICR小鼠30只，随机分为5组，每组6只，雌雄各半，设阴性对照组、阳性对照组和解淀粉芽孢杆菌KL-1低、中、高3个试验组.其中试验组按106 CFU/mL、107 CFU/mL、108 CFU/mL每天分别灌胃小鼠解淀粉芽孢杆菌KL-1菌液0.4 mL，连续2 d.阴性对照组灌胃同体积无菌PBS液，连续2 d.阳性对照组腹腔注射50 mg/kg环磷酰胺1次.第2次染毒后6 h，将小鼠颈椎脱臼处死，取胸骨，擦净血污，剔去肌肉，剪去骨骺，用小型弯止血钳将骨髓挤于有一滴小牛血清的载玻片上，混合均匀后推片，晾干后甲醇固定15 min，晾干后Giemsa染液染色10 min后，冲洗掉染液，晾干，显微镜下进行观察，计数1000个多染红细胞(PCE)中含微核的PCE数.1.3.5 巨噬细胞吞噬功能分析取ICR小鼠24只，随机分为4组，每组6只，雌雄各半，设阴性对照组和解淀粉芽孢杆菌KL-1低、中、高3个试验组.其中试验组按106 CFU/mL、107CFU/mL、108 CFU/mL每天分别腹腔注射解淀粉芽孢杆菌KL-1菌液0.4 mL于小鼠体内，连续3 d.阴性对照组腹腔注射同体积6%无菌淀粉肉汤，连续3 d.第4 d开始各组小鼠腹腔注射1%鸡红细胞悬液1 mL，轻揉小鼠腹部，30 min后各组小鼠腹腔注射生理盐水1 mL，轻揉小鼠腹部数次后用注射器吸出小鼠腹腔液，滴一滴在载玻片上，推片，晾干，甲醇固定4～5 min后，吉姆萨染色3 min，漂洗，晾干，显微镜下观察，计算吞噬率和吞噬指数.1.3.6 统计学分析所有试验数据以平均值±标准差±SD)表示，采用SPSS17.0软件进行分析.统计学分析采用单因素方差分析法及t检验法分析各组之间的差异，P<0.05为显著性标准.2.1 经口急性毒性试验结果2.1.1 小鼠一般情况的观察在灌服一定浓度解淀粉芽孢杆菌KL-1后，小鼠经短暂休息和调整，均能恢复正常活动，次日观察采食量和精神状态均正常.在观察期内，试验组小鼠被毛光滑有光泽，精神状态较好，呼吸顺畅，活动正常，未出现搔鼻、尖叫、出汗、流涎等症状，眼、耳、鼻、口、生殖道未见有血性分泌物，与空白组小鼠比较状态无明显差异，未出现明细中毒症状.在1～14 d内，试验组小鼠体重变化与空白对照组无明显差异(图1).对试验组与空白对照组存活小鼠进行病理剖检，主要脏器未观察到肉眼可见的病理变化.提示解淀粉芽孢杆菌KL-1未对小鼠造成急性毒性作用.2.1.2 解淀粉芽孢杆菌KL-1对小鼠血液常规指标的影响灌胃解淀粉芽孢杆菌KL-1后14 d，分别收集雌雄小鼠血液进行分析，数据显示，试验组与空白对照组相比在白细胞计数、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、红细胞计数、血小板计数等血液指标上无显著差异(表1).提示解淀粉芽孢杆菌KL-1对雌雄小鼠血液常规指标无不良影响.2.1.3 解淀粉芽孢杆菌KL-1对小鼠血液生化指标的影响灌胃解淀粉芽孢杆菌KL-1后14 d，分别收集雌雄小鼠血液经离心得血浆进行生化指标分析，由表2可知，试验组在谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总蛋白、白蛋白、球蛋白等血液生化指标上与空白对照组相比差异不显著.提示解淀粉芽孢杆菌KL-1对雌雄小鼠血液生化指标无不良影响.2.1.4 解淀粉芽孢杆菌KL-1对小鼠脏器指数的影响灌胃解淀粉芽孢杆菌KL-1后14 d，分别收集雌雄小鼠脏器进行称重，计算脏器指数，结果见表3.经统计分析，试验组与空白对照组比较，脏器指数无显著性差异.提示在本试验条件下，解淀粉芽孢杆菌KL-1未对大鼠的脏器指数产生不良影响.2.2 染色体畸变分析结果灌胃解淀粉芽孢杆菌KL-1的染色体畸变率在各试验组与阴性对照组以及各试验组之间均无统计学差异，而各试验组与阳性对照组相比差异极显著(P<0.01)，见图2.提示在本试验条件下，解淀粉芽孢杆菌KL-1对小鼠骨髓细胞染色体无致畸作用. 2.3 骨髓细胞微核分析结果灌胃解淀粉芽孢杆菌KL-1的骨髓细胞微核率在各试验组与阴性对照组以及各试验组之间均无统计学差异，而各试验组与阳性对照组相比差异极显著(P<0.01)，见图3.提示在本试验条件下，解淀粉芽孢杆菌KL-1无致小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成的作用.2.4 巨噬细胞吞噬功能分析结果腹腔注射解淀粉芽孢杆菌KL-1的巨噬细胞吞噬率和吞噬指数在各试验组与阴性对照组以及各试验组之间均无统计学差异，见图4和5.提示在本试验条件下，解淀粉芽孢杆菌KL-1对小鼠巨噬细胞的吞噬率及吞噬功能无影响.解淀粉芽孢杆菌种类多，分布广，不仅能够对多种细菌和真菌产生抑制作用，而且具有十分丰富的代谢产物，在生物防治方面具有较高的应用价值，可以适当代替传统的化学农药[14，15].急性毒性试验是研究和评价受试物安全性的第一步工作，通过急性毒性试验可了解动物机体一次较大剂量接触受试物所产生的毒性特征和毒性强度，获得受试物最基本的毒理学参数，为进一步的毒性试验和毒理学研究奠定基础.本研究采用急性毒性试验-固定剂量法，检测了解淀粉芽孢杆菌KL-1的急性毒性.根据预实验结果在灌服解淀粉芽孢杆菌KL-1达1×108 CFU/mL的14 d内，未引起小鼠死亡，未出现不良症状，未引起小鼠的体重和饮食的异常变化.血常规分析是最基本的血液检验，主要是检查血液方面的问题，如是否有感染，是否贫血，是否有血液疾病.由动物试验获得血液系统变化的数据对人类是否中毒具有较高的预测价值[16].本研究结果表明，试验组小鼠血常规指标与空白对照组比较无显著性差异，提示解淀粉芽孢杆菌KL-1对小鼠的造血功能和白细胞的形成无影响.谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)是存在于动物肝脏中的重要的血清酶，是评价肝功能的重要指标，血清中这两种酶浓度升高是肝脏受到损害的一种应答反应[17，18]；总胆红素也影响着肝脏的各种功能，血清中总胆红素的升高是肝脏受损的重要标志，也可能是胆道梗阻的标志[19].本研究结果表明，试验组在ALT、AST、总胆红素等血清指标上与空白对照组比较无明显差异，提示解淀粉芽孢杆菌KL-1不会引起肝毒性.脏器指数在一定程度上可以反映受试物对脏器的影响，尤其是毒性的重要指标[20]，剖检存活小鼠后，未见心、肝、脾、肺、肾等主要脏器出现肉眼可见的明显病变，且试验组小鼠脏器指数与空白对照组比较差异不显著.因此，在本试验条件下，雌雄小鼠灌服解淀粉芽孢杆菌KL-1的半数致死量(LD50)超过1×108 CFU/mL(>2 000 mg/kg).小鼠骨髓细胞染色体畸变分析和微核分析可以反映受试物对哺乳动物骨髓细胞染色体的作用能力，以检测致突变物对遗传物质的损伤情况[21，22].小鼠巨噬细胞吞噬功能分析可以用来判断受试物是否造成了哺乳动物机体免疫功能障碍，反映了机体免疫系统在外源物质作用下的情况.本研究结果表明，试验组小鼠的染色体畸变分析、骨髓细胞微核分析和巨噬细胞吞噬功能分析结果均为阴性，提示解淀粉芽孢杆菌KL-1对哺乳动物无致突变性和免疫抑制作用.综上所述，解淀粉芽孢杆菌KL-1对雌雄小鼠灌胃的安全剂量超过1×108CFU/mL，且对雌雄小鼠无致突变和免疫抑制作用，为该菌株作为生物农药的安全使用提供试验依据.【相关文献】[1]Kim Y G，Kang H K，Kwon K D，et al. 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生防菌解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的研究进展
生防菌解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的研究进展出晓铭;林毅雄;张珅;严芬;林河通【期刊名称】《包装与食品机械》【年(卷),期】2014(000)006【摘要】生防解淀粉芽孢杆菌具有强烈抑制真菌和细菌的能力，在果蔬采后病害防治方面具有巨大的应用潜力。
该文对解淀粉芽孢杆菌产生的抗菌蛋白、蛋白的分离纯化、抑菌机理和生防应用等方面进行了综述，并对其在果蔬采后病害防治应用前景进行了展望。
【总页数】6页(P49-54)【作者】出晓铭;林毅雄;张珅;严芬;林河通【作者单位】福建农林大学食品科学学院，福州350002; 福建农林大学农产品产后技术研究所，福州350002;福建农林大学食品科学学院，福州350002; 福建农林大学农产品产后技术研究所，福州350002;福建农林大学食品科学学院，福州350002; 福建农林大学农产品产后技术研究所，福州350002;福建农林大学食品科学学院，福州350002; 福州大学生物科学与工程学院，福州350108;福建农林大学食品科学学院，福州350002; 福建农林大学农产品产后技术研究所，福州350002【正文语种】中文【中图分类】S476;TS255.3【相关文献】1.解淀粉芽孢杆菌X-278菌株抗菌蛋白初步分析 [J], 黎波;魏学军;李亚宁;孟庆芳;张汀;刘大群;赤国彤2.生防菌解淀粉芽孢杆菌研究进展 [J], 吴一晶;林艺芬;林河通;陈艺晖;陈梦茵;姜萍3.响应面法对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)12-7产抗菌蛋白条件的优化 [J], 王全;王占利;高同国;李术娜4.拮抗香蕉枯萎病菌的解淀粉芽孢杆菌LX1菌株的鉴定及其抗菌蛋白基因的克隆[J], 卢娟;夏启玉;顾文亮;孙建波;卢雪花;张欣;王宇光5.解淀粉芽孢杆菌B-4M-6菌株产胞外抗菌蛋白发酵条件优化 [J], 朱永明;宋玉卓;王倩;郗艳菊;郭永红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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生防解淀粉芽孢杆菌Bs-18 TnYLB-1突变体文库的构建孙淑琴;孙冰冰;杨秀荣;张惟;霍建飞【摘要】解淀粉芽孢杆菌Bs-18是一株对黄瓜白粉病具有显著防效的生防菌株,为深入研究此菌株的生防作用机理,本研究应用电击法构建了携带转座子TnYLB-1的穿梭质粒pMarA转化Bs-18的突变体文库.通过对转座温度和转座时间的筛选,筛选出50℃高温诱导16 h可获得最大转座成功率,并对突变体进行了PCR验证.Bs-18突变体文库的构建为研究其生防功能基因并深入揭示其生防作用机制奠定了基础.%Bacillus amyloliquefaciens Bs-18 is a biocontrol strains against cucumber powdery mildew with significant control effect. In this paper, the mutant library of Bs-18 was constructed with the shuttle plasmid pMarA carrying transposon TnYLB-1 by the electric shock method to deeply study the molecular mechanism of the biocontrol strain. Through screening transpositional temperature and time, the maximum transpositional success rate was obtained after induced at 50℃ for 16 hours. The mutants were verified by PCR. The construction of Bs-18 mutant library laid a foundation for further study on its biocontrol function genes and mechanism.【期刊名称】《山东农业科学》【年(卷),期】2018(050)004【总页数】4页(P12-15)【关键词】突变体文库;转座子;生防功能基因【作者】孙淑琴;孙冰冰;杨秀荣;张惟;霍建飞【作者单位】天津市植物保护研究所,天津 300381;天津市植物保护研究所,天津300381;天津市植物保护研究所,天津 300381;天津市植物保护研究所,天津300381;天津市植物保护研究所,天津 300381【正文语种】中文【中图分类】S476.1;Q785随着许多微生物基因组全序列的获得，人们对微生物关注和研究的热点逐渐从结构基因组学转移到功能基因组学上。
转座子随机突变技术因操作简单逐渐成为研究功能基因组(如发现新基因、克隆功能基因、发掘已知基因的新功能)的一种有效工具。
目前利用转座子随机突变技术对于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的研究较为深入，并且获得了与芽孢形成、生物被膜形成以及植物与微生物互作等相关基因[1,2]。
随着对转座子技术研究的深入，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在这一领域的工作也逐渐展开。
郝建安等[3]通过对解淀粉芽孢杆菌Mu转座突变子进行表型筛选，并结合克隆和测序发现了2个新的抑菌作用调节基因rpmGA和yxlC。
高卫华等[4]对1株野生型解淀粉芽孢杆菌进行了mini-Tn10 转座突变库的构建，根据菌落形态差异进行初筛，利用结晶紫染色法筛选生物被膜缺陷菌株，由此发现了芽孢杆菌生物被膜形成相关基因。
从突变库中筛选到4株生物被膜缺陷株，经过鉴定发现突变株citB、citG、gpsA和yvfB基因发生插入突变，其中citB、citG 和gpsA均与能量代谢相关，yvfB基因功能未知。
由此可见，转座突变技术已成为发现功能基因的一种有效手段。
穿梭质粒载体 pMarA 上携带转座子TnYLB-1，它具有转座频率高、插入稳定、随机插入、非寄主专化性等优点，已成为人们研究细菌基因功能的首选转座子。
Bs-18是本实验室分离自黄瓜根系的微生物，大田防治试验表明其对黄瓜白粉病的防效达79%，经生理生化和分子鉴定为解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)。
本研究以携带转座子TnYLB-1的质粒pMarA为插入质粒，通过电击法转化野生生防菌株Bs-18，筛选高温诱导转座的最佳温度和时间，从而构建Bs-18的转座插入突变体文库，为研究其生防功能基因及深刻揭示生防解淀粉芽孢杆菌的生防作用机理提供参考。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 供试菌株菌株Bs-18(B. amyloliquefaciens Bs-18)由本实验室分离保存。
质粒pMarA购自BGSC中心。
1.1.2 引物本试验引物合成和序列测定均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
表1 本研究所用引物引物名称引物序列(5'-3')Km-FTCCGTCGATACTATGTTATACGKm-RTATGGACAGTTGCGGATGTACoAtnpFwdCCCGGTCAATGGAGCAATTCGGA CGATTGACAAGCoAtnpRevCCCGGTCAAGTCGACGCAGATTCCGGTCTAACAA AGoITRTAACAGGTTGGCTGATAAGTCCCCGGTCT1.1.3 试剂 DL2000、MIX等分子试剂购自天根生化科技(北京)有限公司；卡那霉素(Kan)、红霉素(Erm)购自上海生工生物工程有限公司；蛋白胨、牛肉浸膏等其它试剂均为国产分析纯。
1.2 质粒转化生防解淀粉芽孢杆菌Bs-181.2.1 质粒pMarA转化Bs-18菌株挑取单菌落Bs-18接种于5 mL试管中，37℃、160 r/min摇床过夜培养。
将培养液按1%接种量接种于20 mL LB液体培养基中，摇床培养至OD600为0.65左右。
将培养好的菌液冰浴20 min。
4℃、8 000r/min离心2 min，收集菌体。
加入10 mL预冷的 ddH2O清洗菌体细胞3次。
再加入ddH2O重悬菌体，制得感受态细胞。
在100 μL感受态细胞中加入1 μL质粒pMarA，均匀混合，将混合物移至预冷的电击杯中，以1.1 kV电压，电穿孔仪BIO-RAD进行脉冲电击(电阻200 Ω，电容25 μF),电击后迅速加入400 μL复苏培养基，37℃温浴60 min，涂布含Kan(50 μg/mL)和Erm(10 μg/mL)的双抗平板，37℃培养过夜，第二天挑取平板上的转化子Bs18-MA[5-7]。
1.2.2 转化子的验证从转化平板上挑选转化子，接种于含Kan(50 μg/mL)的LB液体培养基中，使用离心柱型质粒小提试剂盒提取转化子质粒。
使用引物oAtnpFwd、oAtnpRev扩增转化子中的HimarⅠ转座酶编码基因片段。
使用引物Km-F和Km-R扩增转化子中的卡那霉素抗性基因片段。
以上验证均以质粒pMarA作为阳性对照，以Wt作为阴性对照，扩增程序为：96℃ 2 min；94℃ 45 s，62℃ 1 min，72℃ 2 min，30 cycles；72℃ 10 min；4℃ forever[8]。
1.3 高温诱导转座子TnYLB-1转座1.3.1 转座子TnYLB-1转座条件的优化挑取转化子于LB(Kan 50 μg/mL，Erm10 μg/mL)液体培养基中，37℃、160 r/min振荡培养24 h。
将菌液系列稀释至10-3～10-6，取100 μL涂布LB (Kan 50 μg/mL)平板，将平板置于不同温度条件下(分别设45、46、47、48、49、50℃温度梯度)，分别处理不同时间(4、10、16、22 h)。
用无菌牙签挑取LB平板上的同一单菌落分别点种于Erm和Kan抗性平板上，进行原位生长比较试验。
具有Kan抗性而缺失Erm抗性的菌株即为TnYLB-1转座插入Bs-18菌株基因组的突变子，挑取突变子构建菌株Bs-18的突变体文库[9]。
转座成功率(%)=(K-E)/K×100式中K∶代表卡那霉素平板上的菌落数，E∶代表红霉素平板上的菌落数。
1.3.2 突变体的验证从Bs-18的突变体文库中随机挑取12个突变体，提取基因组DNA，用引物oITR 扩增突变体基因组的TnYLB-1转座子片段，验证TnYLB-1转座子片段是否成功插入到Bs-18的基因组中。
以质粒pMarA作为阳性对照，以Wt作为阴性对照，扩增程序为：96℃ 2 min；94℃ 45 s，66℃ 1 min，72℃ 2 min，30 cycles；72℃ 10 min；4℃ forever。
2 结果与分析2.1 Bs-18的转化将携带TnYLB-1转座子的穿梭质粒pMarA转化入解淀粉芽孢杆菌Bs-18的感受态细胞中，获得数个转化子Bs18-MA。
使用离心柱型质粒小提试剂盒提取转化子质粒。
通过引物oAtnpFwd-oAtnpRev扩增质粒中的HimarⅠ转座酶编码基因(如图1A)，待验证转化子4—6均得到约为1.5 kb的片段，与质粒pMarA得到的片段一致，而Wt没有扩增出条带。
又通过引物Km-F、Km-R扩增质粒中的卡那霉素抗性基因(如图1B)，1：清水； 2：DL2000 DNA Marker；3：质粒pMarA；4—6：待验证转化子；7：Wt。
1：清水；2—4：待验证转化子；5：1kb DNA Marker；6：质粒pMarA；7—8：Wt。
图1 转化子Bs18-MA的验证待验证转化子2—4得到了与质粒pMarA一致的片段，而Wt没有扩增出此条带。
以上验证结果表明，质粒pMarA已经成功转入到菌株Bs-18中，转化子Bs18-MA可以用于后续试验。
2.2 高温诱导转座子TnYLB-1的转座由于质粒pMarA含有温度敏感型复制子repG+ts，30℃时在菌体中能复制，而50℃不能复制，在50℃下，质粒上的HimarⅠ在启动子PA作用下表达，并识别转座子TnYLB-1两端的反向重复序列ITR，使转座子从质粒上跳跃到宿主菌基因组上，并识别基因组上的插入位点“TA”，随机插入宿主基因组。
在转座子发生转座后，其余的质粒骨架(含ErmR)将在细胞中被降解，因此在LBKan平板上生长而在LBErm平板上不生长的菌落即为成功发生转座的突变子。
原位生长比较试验中随机挑选2 000株目标突变子，构建菌株Bs-18的TnYLB-1突变体文库。
通过菌液浓度系列稀释表明稀释浓度为10-5时，菌落在LB平板中能够较好的以单菌落形式生长，后续试验均采用10-5浓度涂板。