生防解淀粉芽孢杆菌Bs-18 TnYLB-1突变体文库的构建

生防解淀粉芽孢杆菌Bs-18 TnYLB-1突变体文库的构建孙淑琴;孙冰冰;杨秀荣;张惟;霍建飞

【摘要】解淀粉芽孢杆菌Bs-18是一株对黄瓜白粉病具有显著防效的生防菌株,为深入研究此菌株的生防作用机理,本研究应用电击法构建了携带转座子TnYLB-1的穿梭质粒pMarA转化Bs-18的突变体文库.通过对转座温度和转座时间的筛选,筛选出50℃高温诱导16 h可获得最大转座成功率,并对突变体进行了PCR验证.Bs-18突变体文库的构建为研究其生防功能基因并深入揭示其生防作用机制奠定了基础.%Bacillus amyloliquefaciens Bs-18 is a biocontrol strains against cucumber powdery mildew with significant control effect. In this paper, the mutant library of Bs-18 was constructed with the shuttle plasmid pMarA carrying transposon TnYLB-1 by the electric shock method to deeply study the molecular mechanism of the biocontrol strain. Through screening transpositional temperature and time, the maximum transpositional success rate was obtained after induced at 50℃ for 16 hours. The mutants were verified by PCR. The construction of Bs-18 mutant library laid a foundation for further study on its biocontrol function genes and mechanism.

【期刊名称】《山东农业科学》

【年(卷),期】2018(050)004

【总页数】4页(P12-15)

【关键词】突变体文库;转座子;生防功能基因

【作者】孙淑琴;孙冰冰;杨秀荣;张惟;霍建飞

【作者单位】天津市植物保护研究所,天津 300381;天津市植物保护研究所,天津300381;天津市植物保护研究所,天津 300381;天津市植物保护研究所,天津300381;天津市植物保护研究所,天津 300381

【正文语种】中文

【中图分类】S476.1;Q785

随着许多微生物基因组全序列的获得，人们对微生物关注和研究的热点逐渐从结构基因组学转移到功能基因组学上。转座子随机突变技术因操作简单逐渐成为研究功能基因组(如发现新基因、克隆功能基因、发掘已知基因的新功能)的一种有效工具。目前利用转座子随机突变技术对于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的研究较为深入，并且获得了与芽孢形成、生物被膜形成以及植物与微生物互作等相关基因[1,2]。

随着对转座子技术研究的深入，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在

这一领域的工作也逐渐展开。郝建安等[3]通过对解淀粉芽孢杆菌Mu转座突变子

进行表型筛选，并结合克隆和测序发现了2个新的抑菌作用调节基因rpmGA和yxlC。高卫华等[4]对1株野生型解淀粉芽孢杆菌进行了mini-Tn10 转座突变库的构建，根据菌落形态差异进行初筛，利用结晶紫染色法筛选生物被膜缺陷菌株，由此发现了芽孢杆菌生物被膜形成相关基因。从突变库中筛选到4株生物被膜缺陷株，经过鉴定发现突变株citB、citG、gpsA和yvfB基因发生插入突变，其中citB、citG 和gpsA均与能量代谢相关，yvfB基因功能未知。由此可见，转座突

变技术已成为发现功能基因的一种有效手段。穿梭质粒载体 pMarA 上携带转座子TnYLB-1，它具有转座频率高、插入稳定、随机插入、非寄主专化性等优点，已成

为人们研究细菌基因功能的首选转座子。

Bs-18是本实验室分离自黄瓜根系的微生物，大田防治试验表明其对黄瓜白粉病的防效达79%，经生理生化和分子鉴定为解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)。本研究以携带转座子TnYLB-1的质粒pMarA为插入质粒，通过电击法转化野生

生防菌株Bs-18，筛选高温诱导转座的最佳温度和时间，从而构建Bs-18的转座

插入突变体文库，为研究其生防功能基因及深刻揭示生防解淀粉芽孢杆菌的生防作用机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株菌株Bs-18(B. amyloliquefaciens Bs-18)由本实验室分离保存。

质粒pMarA购自BGSC中心。

1.1.2 引物本试验引物合成和序列测定均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

表1 本研究所用引物引物名称引物序列(5'-3')Km-FTCCGTCGATACTATGTTATACGKm-RTATGGACAGTTGCGGATGTACoAtnpFwdCCCGGTCAATGGAGCAATTCGGA CGATTGACAAGCoAtnpRevCCCGGTCAAGTCGACGCAGATTCCGGTCTAACAA AGoITRTAACAGGTTGGCTGATAAGTCCCCGGTCT

1.1.3 试剂 DL2000、MIX等分子试剂购自天根生化科技(北京)有限公司；卡那霉

素(Kan)、红霉素(Erm)购自上海生工生物工程有限公司；蛋白胨、牛肉浸膏等其

它试剂均为国产分析纯。

1.2 质粒转化生防解淀粉芽孢杆菌Bs-18

1.2.1 质粒pMarA转化Bs-18菌株挑取单菌落Bs-18接种于5 mL试管中，37℃、160 r/min摇床过夜培养。将培养液按1%接种量接种于20 mL LB液体培养基中，摇床培养至OD600为0.65左右。将培养好的菌液冰浴20 min。4℃、8 000