免疫组织化学免疫组化技术综述

免疫组织化学（免疫组化）技术利用抗原抗体的特异性联合反响来检测和定位组织或细胞中的某种化学物质的一门技术，它是免疫学和传统的组织化学相联合而形成的，这类技术称免疫组织化学（immunohistochemistry IHC）或免疫细胞化学（immunocytochemistry）。

其特色是将形态学改变与功能，代谢变化联合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培育细胞爬片上定位一些蛋白质或多肽物质的存在，并可精准到亚细胞构造水平，联合电子计算机图像剖析系统或激光扫描共聚焦显微术等技术，可对被检物质进行定量剖析。

第一节免疫组化的发展史及应用自1941 年Coons及其同事开创免疫组织化学技术以来，拌随免疫学和组织化学理论与技术的发展，免疫组织化学已发生了日异月新的变化。

以下表免疫组化的发展过程年月研究者事件1941 Coons 适用免疫萤光技术1948 Fagraeus 进一步发展免疫萤光技术1970 Sternberger 抗体酶标技术1974 Taylor 证明组织中浆细胞免疫组化1975 Kohler单克隆抗体技术（被成为免疫学上的一场革命，Milstein也令人类第一次获取了能依据人的意志在体外产生抗体的杂交瘤细胞）。

1981 Hsu ABC 法1990 到现在SP法、原位杂交免疫组化技术因为免疫组化拥有特异性强、敏捷度高等明显特色，且能将形态与功能研究有机的联合在一同，所以，这门技术从一出生起就显示出了强盛的生命力和广阔的应用远景，当今它已被宽泛地应用于生物学和医学研究的很多领域，推动了学科的发展，获得了令人瞩目的成就。

免疫组织化学染色技术的应用跟着大批商品化的单克隆和多可隆抗体出现，配套试剂盒的使用及方法的不停完美，使免疫组化染色已经成为医学基础研究和病理外检中应用最为宽泛的技术手段之一。

免疫组化可用于各样蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属性的判断，淋巴细胞的免疫表型剖析，细胞增殖和凋亡的研究，激素受体和耐药基因蛋白表达检测，以及细胞周期和信号转导的研究等。

在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更重要。

以肿瘤研究为例，在免疫组化技术出现从前，对肿瘤的诊疗和分类还限制于细胞水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提升到了生物化学水平、分子水平。

最近几年来，拌随基因探针研究而盛行的核酸分子原位杂交技术也正在蓬勃发展，更使免疫组化如虎1的发现不单有助于对肿瘤发活力制的商讨，并且使肿瘤的预防，初期诊疗，甚至治疗都向前迈进了一大步，为人类征服癌症代来了希望的曙光。

在外国，病理诊疗免疫组化开始于70年月，80 年月发展至顶峰，90 年月已列入病理技术室惯例工作。

在国内，免疫组化到90 年月才开始在病理诊疗中逐渐普及。

第二节免疫组化的基根源理基根源理：尽人皆知，抗体与抗原之间的联合拥有高度的特异性。

免疫组织化学正是利用这一特征，即先将组织或细胞中的某种化学物质提拿出来，以此作为抗原或半抗原，经过免疫后获取特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的抗原物质。

反之亦然。

因为抗体与抗原联合后形成的免疫复合物是无色的，所以，还一定借助于组织化学方法将抗原抗体反响部位显示出来，以期达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性、定位甚至定量的研究。

如前所述，免疫组化主要波及免疫学和组织化学的相关理论和技术，此中关键在于制备高效的抗体，后者又主要取决于抗原的质量。

组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

在抗系统备上，经历了从抗血清，纯化IgG 到单克隆抗体，甚至发展到应用基因重组技术获取分子量较小的特异性片段。

就单克隆抗体而言，它是在1975 年由Kohler 和Milstein 成立了杂交瘤技术后才开始问世的，现已被宽泛应用于研究中，它拥有更好的特异性，大大地提升了免疫组化的技术水平。

显示技术的发展也相当迅猛，初期不过简单的将标志物联合在抗体上，此后则发展到将标志物联合在抗抗体上或与抗体拥有特异亲和性的分子上，用于标志的物质有好多种，如荧光染料、放射性同位素、酶、胶体金等。

借助于荧光显微镜、光学显微镜或电子显微镜，便可察看到这些标志物发出荧光、酶促反响产生的有色积淀或高电子密度颗粒，从而察看到抗原抗体复合物所再的部位。

因而可知，免疫组化技术以其特异性和敏捷度高等特色，又因其操作比较简便而得以宽泛应用。

第三节相关的免疫学理论抗原（antigen）：抗原应具备的条件：①异物性②理化性质③特异性抗原的种类：①免疫原性与免疫反响性完好抗原不完好抗原②抗原与机体的亲缘关系异种抗原同种异型抗原自己抗原③抗原的化学构造蛋白质抗原多糖抗原核酸抗原低分子量物质抗原合成多肽抗原④抗原的理化性状颗粒性抗原可溶性抗原抗原的制备：资料的准备和预办理组织的粉碎抗原的提取抗原纯化抗原纯度的检测半抗原的免疫原制备法抗体（antibody ）——是机体受抗原刺激后，由B淋巴细胞，特别是浆细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，称免疫球蛋白（immunolobulin,Ig ）, 共有五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE,主要散布在血清或外分泌物中。

抗体的分子构造抗体的理化性质抗体与抗原的特异性联合抗体的种类抗体的抗原性：同种型抗体同种异型抗体独到型抗体抗体的制备方法：多克隆抗体（血清抗体）——指机体接受抗原的主动免疫或被动免疫后，从血清中分别提纯的抗体。

单克隆抗体——是1975 年由Kohler 和Milstein 发明的一种新技术。

免疫组织化学免疫组化技术综述原理是将体外培育的骨髓瘤细胞与免疫细胞交融，产生杂交细胞。

这类交融的杂交细胞系既有骨髓瘤细胞无穷生长的能力，又有浆细胞分泌单调抗体的能力。

这类免疫细胞经过纯化，成为单克隆系，就能产生大批专一的高纯度的抗体，既单克隆抗体。

这一技术被称为免疫学上的一场革命，也令人类第一次获取了能依据人的意志在体外产生抗体的杂交瘤细胞。

（祥见图解）免疫组织化学免疫组化技术综述单克隆抗体与多克隆的特征比较见下表:单克隆抗体与多克隆的特征比较特性单克隆抗体多克隆抗体构成单调类的抗体多种类抗体的混淆物特异性高，针对单调抗原决定簇低，针对多个抗原决定簇亲协力不定，较低均匀亲和力较高交错反响低高第四节免疫组化的基本技术依据标志物（或示踪物）不一样可分为以下技术：免疫荧光组化技术免疫酶组化技术亲合免疫组化技术免疫胶体金组化技术免疫铁蛋白技术还有两重和多重标志技术等。

不一样的免疫组化技术，各拥有独到的试剂和方法，但其基本技术方法是相像的，都包含抗体的制备，组织资料的办理，免疫染色，比较试验，显微镜察看等步骤。

( 一) 免疫荧光组化技术1. 基根源理依据抗原抗体反响原理，先将已知的抗体标志上荧光素，制成荧光抗体，再用这类荧光抗体作为探针与细胞或组织内相应抗原结合，在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标志的荧光素，利用荧光显微镜察看标本（荧光素受荧光显微镜激发光的照射而发出必定波长的荧光），从而可确立组织中某种抗原的定位，从而还可进行定量剖析。

2. 分类直接法间接法补体法两重免疫荧光标志法1) 直接法——用荧光标志的特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（第一抗体）直接与标本反响（染色），以检测标本中相应的抗原。

如图特色：操作简单，特异性高，但敏感性低，且因为一种荧光标记抗体只好检测一种特异性抗原，所以应用范围较这窄。

染色步骤:⒈白腊切片惯例脱蜡至水。

冰冻切片、涂片、印片或培育细胞等资料经合适固定。

⒉必需时用酶合适消化。

⒊用PH7.4 PBS洗15分钟。

⒋滴加经合适稀释的荧光抗体，室温或37℃孵育箱内孵育30—60 分钟。

⒌用PBS洗3 次，5 分钟/ 次。

⒍用50%甘油（用碳酸盐缓冲液配制）封片⒎荧光显微镜下察看。

2) 间接法——此法是直接法的重要改进，先用特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（或称第一抗体）与细胞标本反响，随后用缓冲液洗去未与抗原联合的抗体，再用间接荧光抗体（也称第二抗体）与结合在抗原上的抗体（是第二抗体的抗原）联合，形成抗原—抗体—荧光抗体的复合物。

如图因为联合在抗原抗体复合物上的荧光抗体明显多于直接法，从而提升了敏感性。

如细胞抗原上每个分子联合3～5 个分子的抗体，当此抗体作为抗原时又可联合3～5 个分子的荧光抗体，所以和直接法对比荧光明度可增强 3 或4 倍。

特色：特异性强，敏捷度高，应用更广，只需要制备荧光标志的羊抗鼠或羊抗兔即可应用于多种抗体（第一抗体）的标志显示。

染色步骤：⒈白腊切片惯例脱蜡至水。

冰冻切片、涂片、印片或培育细胞等资料经合适固定⒉必需时用酶合适消化。

⒊用PH7.4 PBS洗15 分钟。

⒋滴加经合适稀释的未标志一抗，在室温或37℃孵育箱内孵育30～60分钟。

⒌用PBS洗3 次，5 分钟/ 次。

⒍滴加荧光标志二抗，在室温或37℃孵育箱内孵育30～60 分钟。

⒎用PBS洗3 次，5 分钟/ 次。

⒏用50%甘油（用碳酸盐缓冲液配制）封片⒐荧光显微镜下察看。

3) 补体法——大多半抗原—抗体复合物都能联合补体。

所以，在染色时先将新鲜补体与第一抗体混淆，同时加在抗原标本切片上，经37℃孵育后，如发生特异抗原抗体反响，补体就联合在抗原抗体复合物上，再用抗补体荧光抗体与联合的补体反响，形成抗原——抗体——补体——荧光抗体的复合物。

如图特色：只需一种荧光抗体，可合用于各样不一样种属根源的第一抗体的检测。

染色步骤：⒈白腊切片惯例脱蜡至水。

冰冻切片、涂片、印片或培育细胞等资料经合适固定⒉必需时用酶合适消化。

⒊用PH7.4 PBS洗15分钟。

⒋将抗血清60℃灭活20min，并作合适稀释。

⒌将新鲜豚鼠血清（此中含有补体）稀释10倍⒍取等量抗血清和豚鼠血清混淆，滴加在切片上，将切片置37℃孵育箱内孵育30～60 分钟⒎用PBS洗3 次，5 分钟/ 次。

⒏滴加经合适稀释的荧光标志抗补体抗体，在室温或37℃孵育箱内孵育30分钟。

⒐用PBS洗3 次，5 分钟/ 次。

⒑用50%甘油（用碳酸盐缓冲液配制）封片⒒荧光显微镜下察看。

4 ）两重免疫荧光标志法——在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色，一般均采纳直接法。

将两种荧光抗体（如抗 A 和抗B）以合适比率混淆，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标志，发黄绿色荧光；抗B抗体用四甲基异硫氰酸罗达明荧光素标志，发红色荧光，可以明确显示两种荧光抗原的定位。

3．比较实验与荧光抗体染色结果判断（1）比较实验为了保证免疫荧光组织化学染色的正确性，清除某些非特异性染色，一定在首次试验（新抗体首次使用）时进行以下比较实验。

免疫荧光染色的比较实比较设置直接法间接法抗补体法标本自觉荧光比较★★★阳性比较★★★荧光抗体比较★★克制试验★★★补体比较★自觉荧光——组织不经过荧光染色，在紫外光或短光波的照耀下，所呈的荧光称自觉荧光。