瘤胃发酵试验方法
瘤胃微生物类群的多样性及其综合发酵的研究进展
ｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ） 在瘤胃中常被检测到。如降解淀粉为主的 Ｒ． ｂｒｏｍｉｉ（ Ｋｒａｕｓｅ 等， １９９９） ； 降解纤维为主的 Ｒ． ｆｌａｖｅ－ ｆａｃｉｅｎｓ 在孙 云章 （ ２００５） 的 研 究 中 占 测 序 克 隆 子 中 比 例 为 ２．０８％； 在 Ｋｒａｕｓｅ 等 （ １９９９） 报 道 中 占 有 ２．２％的 比例， 是以粗饲为主的反刍动物瘤胃中的常在菌类。
狭义遗传多样性是指种内基因的变化， 包括种内 Ｓｕｎｄｓｅｔ 等 （ ２００７） 对 ｒｅｉｎｄｅｅｒ 瘤 胃 微 生 物 １６Ｓ ｒＲＮＡ
ｇｅｎｅ 的测序结果表明 Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ 的比例为
王梦芝 ， 扬 州 大 学 动 物 科 学 与 技 术 学 院 ， 博 士 ， ２２５００９， 江 苏省扬州市文汇路东路 １２ 号。
用于构建系统树的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列 ６ ２０５ 个， 而随着 ｃｌｕｓｔｅｒｓ） （ Ｐｒｙｄｅ 等， ２００２） 。
研究的不断深入，还有新发现的序列不断上传，丰富瘤
瘤胃中除有种类繁多的革兰氏阳性菌外尚存在一
胃微生物的基因库，足以说明其遗传多样性的丰富。 定比例的同样种类繁多的革兰氏阴性菌（ 安登第，２００３） 。
和基因表达具有很大的差异。目前，据 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列 维二糖、蔗糖、淀粉和糖原等几种 ＣＨＯ， 主要产生或只 同源分析建立的核糖体小亚基 １６Ｓ ｒＤＮＡ 和 １８Ｓ ｒＤＮＡ 产生丁酸， 其 ＤＮＡ 的 Ｇ＋Ｃ 摩尔百分比是 ４２．３％。据
体外法研究米曲霉培养物对瘤胃发酵参数及微生物酶活性的影响
Ｄ Ｎ Ｓ 法ｌ ８ ｌ 测定 ； 剩余 培养 物 于４ ５ ￣ Ｃ 下 烘 干备 用 。选取 酶 活性 最高 的Ａ Ｏ Ｃ 用 于瘤 胃体 外产 气试 验 。 １ ． ２ 米 曲霉 培养 物 的体外 产 气试 验 １ ． ２ ． １ 瘤 胃液 来 源 瘤 胃液 取 自３ 头装 有 永 久性 瘤
米 曲霉 （ Ａ ｓ ｐ ｅ ｌ ｌ ｕ ｓ ｏ ｒ ｙ ｚ ａ ｅ ）是一 种好气性 丝状真
１ ． １ ． ３ Ａ Ｏ Ｃ ￥ ￣ 备
取培 养 基 １ ０ ｇ ／ 份 放入 ２ ５ ０ ｍ Ｌ 锥 形
菌， 在 食 品发酵 工业 中应 用历史 悠 久 ， 被美 国食 品与
药 物管 理局 （ Ｆ Ｄ Ａ） 列 为 安全 性 菌种 【 ｌ ｌ ， 其 安全 性 也受 到世 界卫生组织 的公认Ｉ ２ Ｉ 。米 曲霉 是一类 产复合 酶 的
２ Ｏ １ ３ 年 第４ ９ 卷 幕１ １ 期
Ｎ ｕ ｔ ｒ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ Ｆ ｅ ｅ ｄ ｓ ｔ ｕ ｆ ｆ ｓ・营 荠 饲 烈
体 外法研究米 曲霉培养物对 瘤 胃发酵 参数及微生物酶活性的影响
孙 华 ， 吴跃 明 ， 李亚学， 杨 凡 ， 彭永佳 ， 刘 建 新
瓶， 加入 １ ０ ｍ Ｌ 蒸馏水 ， 于１ ２ １ ℃下 高压 灭 菌 ２ ０ ａ ｒ ｉ ｎ ， 冷 却 至 室温 后按 １ Ｘ １ ０ ６ ／ ｇ 接 种 米 曲霉 孢 子 悬 浮液 ， 于
３ ０ ￣ Ｃ 培养 箱 中培养 ，培养 ２ ４ ｈ 开始至 １ ２ ０ ｈ 每隔１ ２ ｈ
酶特 性为标 准研 制米 曲霉 培养 物 ， 体 外 法研 究Ｏ 、 ３ 、 ６ 、 １ ２ ｍ ｇ 米 曲 霉 培 养 物 对 瘤 胃发 酵 和 微 生 物 酶 活 力 的 影 响
牛粪便筛分析
牛粪便筛分析
1、通过感官了解粪便中未消化的饲料颗粒的多少来分析饲料的消化率，判断瘤胃的发酵情况。
2、原理
用三层筛(表2)将粪便过滤，未消化的饲料颗粒因大小不同而分布于不同层的筛上，颗粒大的在上层。
3、方法
取样(要求有代表性，至少占牛群头数的10%)—冲洗—涮洗(要求最后流出的水接近清水)—分层比较(整理成厚度一致的圆饼形，比较面积)
4、感官评定
各层的存留物及比例(顶层：完整的谷物颗粒，大的粗料颗粒;中层：破碎的谷物颗粒，中等大小的粗料颗粒;底层：细小饲料残渣等。
5、结果分析
粪便中颗粒的粒度不应超过7毫米，如果粪便中颗粒粒度过长，表明瘤胃通过率太高。
各层达理想比例时，瘤胃效率高，瘤胃养分达最佳平衡，可以作为评估副产品的快速通过率，评估奶牛生产性能的有力工具。
奶牛粪便的分析评判虽不能对营养问题提供确定的回答。
但它的确是一个很有用的诊断工具，对许多营养问题的发生，它能给予很多的暗示和问题解决的启示。
结合其他的诊断工具，可帮助解决营养问题。
瘤胃微生物体外发酵过程与注意事项
瘤胃微生物体外发酵过程与注意事项瘤胃微生物体外发酵过程通常由以下步骤组成：1. 选择合适的培养基：瘤胃微生物在体外培养需要合适的培养基来提供必要的营养物质和生长因子。
常用的培养基包括Ruminal Fluid Medium和Grain Medium等。
2. 收集瘤胃液：可以通过手术方式或经皮逆行注射等方法收集健康反刍动物的瘤胃液作为发酵的种子物质。
收集过程中需要注意避免污染，确保瘤胃液的质量。
3. 调整酸碱度和温度：瘤胃微生物主要在弱酸性条件下进行发酵，一般采用pH 6.5-7.0的培养条件。
此外，适宜的温度也是促进微生物生长和发酵的关键因素。
4. 添加底物和营养物质：添加适量的底物（如纤维素、淀粉、蛋白质等）和营养物质（如维生素、无机盐等）是瘤胃微生物体外发酵的必要步骤。
不同的瘤胃微生物有不同的营养要求，因此需要根据具体情况进行配方。
5. 保持氧气供应：瘤胃微生物主要是厌氧生物，因此在培养过程中需要注意排除氧气的影响。
可以通过使用密闭容器或添加还原剂等方法来维持适宜的厌氧条件。
6. 监测发酵过程：通过定期取样分析微生物数目、发酵产物和代谢产物的变化等指标，来监测瘤胃微生物体外发酵的进展和效果。
在进行瘤胃微生物体外发酵时，需要注意以下事项：1. 严格控制实验条件：如pH、温度、厌氧条件等，确保实验结果的准确性和可重复性。
2. 避免污染：在采集瘤胃液和进行发酵过程时，要避免外界杂质的污染，以避免对实验结果的影响。
3. 合理选择培养基和底物：根据瘤胃微生物的特点和需求，选择合适的培养基和底物，以提供必要的营养和生长因子。
4. 注意安全问题：一些瘤胃微生物可能产生有害物质或是具有致病性，因此在操作过程中需要注意个人安全保护，如戴手套、口罩等。
总之，瘤胃微生物体外发酵是一项复杂的实验操作，需要严格控制实验条件，避免污染，并注意安全问题，以确保实验的成功实施和准确性。
奶牛瘤胃发酵及调控
食 物 。 对地不 与人类 竞争食 物 。奶 牛瘤 胃中栖居 着 相
大 量 的 微生 物 ， 料 中 的 营 养 成 分 在 瘤 胃 中 可 被 微 生 饲
中营养物 质 的利 用率或 提 高生奶 质量 ， 奶 牛发酵有 使 利 方 面达 到最 佳 ， 发酵 损失 降 到最 小 ， 内外 动 物 营 国
养 学 家 、 物 化 学 家 和 微 生 物 学 家 对 瘤 胃发 酵 进 行 了 生
果 是脂 类 的质 和量 发生 明显变 化 ： 大部 分不饱 和脂 ①
肪 酸 经 微 生 物 作 用 变 成 饱 和 脂 肪 酸 。 必 需 脂 肪 酸 减 少 。瘤 胃是 一 个 高 度 还 原 的 环 境 ， 物 氢 化 是 瘤 胃 脂 生 肪 消 化 的 一 个 重 要 过 程 。 粮 中 ９ ％以上 的 含 多 个 双 饲 ０ 键 的 不 饱 和 脂 肪 酸 被 氢 化 ， 化 作 用 必 须 在 脂 类 水 解 氢
２ 瘤 胃发 酵 调 控 方 法
２１ 通 过 饲 喂方 式 来 调 控 瘤 胃 发 酵 ． ２１ 增 加 饲 喂 次 数 ．． １ 维 持 瘤 胃 内 稳 定 而 又 有 规 律 的 发 酵 是 提 高 养 分
碳 水化 合物 在瘤 胃内 的降解 产物为 乙酸 、 酸 和 丙
丁酸等挥 发性 脂 肪酸 （ Ｆ 。淀粉 、 类等 非结 构性 利 用效 率 ， 别是提 高微 生物 菌体 蛋 白（ Ｃ ） 成 的 Ｖ Ａ） 糖 特 Ｍ Ｐ合 碳 水化 合物 在 细菌 和真 菌作 用 下 ， 降解 较 快 ， 产物 中 关 键 ， 喂次 数影 响采食 和瘤 胃内乳 酸浓度 。每 天饲 饲 丙酸 比例较 高。 而结构 性碳水 化合物 （ 主要指粗 纤维 ） 降解 较慢 ， 以细 菌和真 菌消化 为 主。细菌 和真 菌伏贴
连续培养瘤胃模拟发酵的工作参数设置研究进展
连续培养瘤胃模拟发酵的工作参数设置研究进展伍梦楠;沈维军;张佩华;陈东【摘要】体外培养法作为反刍动物营养学研究的重要方法，主要有批次培养法和连续培养法两种。
由于连续培养法能够更好地模拟瘤胃内发酵情况，其应用也更为广泛。
但连续培养瘤胃模拟装置的主要运行参数多，如温度、pH、稀释率、缓冲液与瘤胃液接种比、搅拌速率与方式等，且不同运行参数设置以及参数的组合对试验结果影响较大，因此作者在总结前人研究结果的基础上，就不同工作参数对连续培养瘤胃模拟发酵过程中挥发性脂肪酸、干物质消失率、pH、酶活、原虫数量、微生物蛋白等指标的影响进行了综述。
%In vitro culture method is an important way to research in ruminant dietetics,including batch and continuous culture methods.Because the continuous culture method can better simulate the conditions of fermentation in rumen,it was applied more widely.There are many operation parameters of rumen simulation technique involved in continuous culture,such as temperature, pH,dilution rate,the proportion of buffer to rumen fluid,stirring rate andway,meanwhile,dif-ferent operation parameters and their combinations will have a great influence on the fermentation results.On the basis of summarizing the results of previous studies,the authors review the effects of different parameters on volatile fatty acid,dry matter disappearance rate,pH,enzyme activity,number of protozoa and microbial protein,in dual-flow continuous culture system in this paper.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2017(044)001【总页数】7页(P106-112)【关键词】体外培养;连续培养系统;运行参数【作者】伍梦楠;沈维军;张佩华;陈东【作者单位】湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410000;湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410000;湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410000;湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410000【正文语种】中文【中图分类】Q482反刍动物营养传统研究方法主要有体内法或半体内法，均需要利用活体动物进行试验。
体外法研究植物精油对瘤胃体外发酵和甲烷生成的影响
体外法研究植物精油对瘤胃体外发酵和甲烷生成的影响体外法研究植物精油对瘤胃体外发酵和甲烷生成的影响植物精油对瘤胃体外发酵和甲烷生成的影响是近年来的热点研究领域。
瘤胃是许多反刍动物消化系统中的特殊部位，其内部含有大量的微生物群落。
这些微生物通过一系列的发酵作用帮助动物消化木质纤维素等难以降解的物质，并产生甲烷气体作为代谢产物。
然而，甲烷气体的排放是温室效应的一个重要因素，因此，寻找能够有效抑制瘤胃甲烷生成的方法对环境保护和畜牧业发展具有重要意义。
植物精油是从植物中提取的挥发性油状物质，具有广谱的生物活性。
许多研究表明植物精油具有抗菌、抗氧化、抗炎等多种药理作用。
近年来，越来越多的研究开始关注植物精油对瘤胃微生物群落和甲烷生成的调节作用。
这些研究主要通过体外实验方法，模拟瘤胃内环境，研究植物精油对瘤胃微生物的生长、代谢产物的生成以及甲烷生成的影响。
第一步，研究人员需要收集瘤胃液样本，这些样本可以从宰杀的反刍动物胃部获取。
然后，研究人员将瘤胃液与培养基混合，在体外条件下模拟瘤胃发酵过程。
接下来，研究人员将不同浓度的植物精油添加到体外培养体系中，观察其对瘤胃微生物的生长繁殖的影响。
为了进一步研究植物精油对甲烷生成的调节作用，研究人员可以使用气相色谱等技术测定体外发酵液中甲烷的生成量。
研究结果表明，不同类型的植物精油对瘤胃微生物的生长和代谢产物的生成具有不同的影响。
例如，茴香精油和柠檬精油被发现具有较强的抑制作用，可以有效地降低瘤胃甲烷生成。
这是由于茴香精油和柠檬精油中的化合物具有抗菌作用，可以抑制瘤胃内甲烷产生菌的生长和代谢活性。
而其他类型的植物精油则可能对瘤胃微生物的生长产生促进作用，增加发酵液中挥发性脂肪酸等代谢产物的生成。
值得注意的是，体外法研究植物精油对瘤胃微生物群落和甲烷生成的影响只是一种初步的研究方法，研究结果可能与实际动物体内情况存在一定的差异。
此外，植物精油的添加浓度、种类和使用方法等因素都会影响研究结果的可靠性和实用性。
牛胃生理实验报告
一、实验目的1. 了解牛胃的结构及其生理功能。
2. 掌握牛胃消化过程中的重要环节。
3. 分析牛胃对不同饲料的消化能力。
二、实验原理牛胃分为四个室：瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃。
瘤胃和网胃是反刍动物特有的胃室，主要负责发酵和软化食物。
瓣胃和皱胃则与单胃动物的胃相似，负责分泌胃液进行消化。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜牛胃、饲料（如草料、精料等）、生理盐水、pH试纸、试管、滴管等。
2. 实验仪器：解剖显微镜、天平、温度计、计时器等。
四、实验步骤1. 解剖牛胃：将新鲜牛胃取出，沿胃大弯切开，观察瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃的结构特点。
2. 瘤胃发酵实验：取一定量草料，加入瘤胃，观察瘤胃内微生物发酵情况，记录pH值变化。
3. 网胃软化实验：取一定量精料，加入网胃，观察网胃对精料的软化作用，记录软化程度。
4. 瓣胃和皱胃消化实验：取一定量草料和精料，分别加入瓣胃和皱胃，观察胃液分泌情况，记录pH值变化。
五、实验结果与分析1. 瘤胃发酵实验：瘤胃内pH值在发酵过程中逐渐降低，说明瘤胃内微生物对草料进行了发酵。
2. 网胃软化实验：网胃对精料的软化作用明显，说明网胃在反刍动物消化过程中起到了重要作用。
3. 瓣胃和皱胃消化实验：瓣胃和皱胃内pH值在消化过程中逐渐升高，说明胃液分泌有助于食物的消化。
六、讨论与结论1. 牛胃是反刍动物特有的消化器官，其结构复杂，功能多样。
2. 瘤胃和网胃是反刍动物消化过程中的关键环节，负责发酵和软化食物。
3. 瓣胃和皱胃与单胃动物的胃相似，负责分泌胃液进行消化。
4. 本实验结果表明，牛胃对不同饲料的消化能力较强，为反刍动物提供了丰富的营养来源。
七、注意事项1. 实验过程中要严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性。
2. 注意实验材料的新鲜度，避免影响实验结果。
3. 实验过程中要密切观察实验现象，做好记录。
八、实验体会与建议1. 通过本次实验，我们对牛胃的结构和生理功能有了更深入的了解。
瘤胃发酵的概念
瘤胃发酵的概念瘤胃发酵是一种在胃部进行的一种发酵过程，主要在反刍动物的瘤胃中进行。
瘤胃是一种特殊的胃部构造，在先充填食物的瘤胃中，通过分泌特殊的酶和细菌的存在，使食物得到进一步分解和降解。
这种发酵过程有助于反刍动物的消化和能量获取。
本文将详细介绍瘤胃发酵的概念，过程和作用。
瘤胃发酵的过程可以分为三个主要阶段：微生物附着、发酵产物生成和食物降解。
首先，在瘤胃内存在着大量的微生物，包括真菌、细菌、原生动物等。
这些微生物在瘤胃壁上附着并形成一种被称为微生物附着体的菌群。
这些微生物附着体中的微生物都具有特定的功能，它们通过合作和共生的方式参与食物降解和发酵过程。
其中，细菌是主要的附着体成分，包括纤维分解细菌和淀粉分解细菌等。
其次，瘤胃中的细菌通过产生一系列酶促进食物降解。
纤维分解细菌主要分解纤维素，产生短链脂肪酸等有营养的产物。
这些短链脂肪酸可以被反刍动物吸收并提供能量。
淀粉分解细菌则分解淀粉和其他碳水化合物，产生乳酸和醋酸等产物。
最后，瘤胃发酵过程中的产物被吸收和利用。
瘤胃壁上具有高度发达的血管系统，可以有效地吸收产生的短链脂肪酸和其他营养物质。
这些产物被转运到其他部位，满足反刍动物对能量和营养的需求。
除了帮助食物降解和提供能量外，瘤胃发酵还具有其他重要的生理作用。
瘤胃发酵可以改变食物的物理性质和微生物菌群，增强食物的可消化性和提高其营养价值。
此外，瘤胃发酵还可以抑制有害微生物的生长，减少病原菌的数量，从而保护反刍动物的肠道健康。
瘤胃发酵是反刍动物消化系统中一个非常重要的环节。
通过瘤胃发酵，反刍动物能够充分利用发酵产物和营养物质，提高食物利用效率和能量获取。
瘤胃发酵也对反刍动物的生长和发育具有重要的影响。
例如，小牛出生时的瘤胃处于发育不成熟的状态，随着日龄的增加，瘤胃发酵开始逐渐形成。
瘤胃发酵的建立和调控对小牛的生长和发育至关重要。
总结起来，瘤胃发酵是反刍动物独特的消化过程，通过微生物附着、发酵产物生成和食物降解三个阶段实现食物的降解和利用。
反刍动物短期人工瘤胃发酵技术的应用及存在问题
发酵试 验 中 常 用 内径 ３ ２ ｍ ｍ， 长２ ０ ０ ｎ ｌ ｍ． 刻度体 积 为 １ ０ ０ ｍＬ的玻璃 注射 器作 为发 酵器 。
１ ． ２ 发酵装 置 的密封
密封 发酵器 是 为 了创 造装 置 的厌 氧环 境 ， 使其更 接 近实体 动物 瘤 胃。可采 用胶 管等 作为 注射 器 的封 口， 取长 ５ ｅ ｍ左 右 的胶管 ， 将其 一头 套 于注射 器端 口， 另 一头 折叠 ， 用细绳 系 紧 ， 即可封 闭完好 。 笔者采 用
又称 为人 工瘤 胃法 。
反 刍动物 人工 瘤 胃发 酵技 术可 分为 短期 人工瘤 胃法 和人 工瘤 胃持续 发酵法 （ 长期瘤 胃法 ） 。 短期 人工 瘤 胃技术 是 将瘤 胃液 与 添加底 物 在体 外共 同培 养 。 研究 微 生物 的代 谢活 动 和底 物 消失 利用 情况 ． 将瘤 胃 液 和发酵 底物 一次 性加 入 ， 在 一定 时间 内结束 培 养 ， 观察 产气 量 、 氨态氮 、 挥 发性脂 肪酸 等指标 。 在我 国采 用 较多 的短 期人 工瘤 胃发酵 法是 由 Ｍｅ ｎ ｋ ｅ等 （ １ ９ ７ ９ ） ｔ Ｊ ｌ 建 立 的体外 人工 瘤 胃产气 量 法 ， 该 方 法 由于能 够较 好 地模 拟瘤 胃中 的发酵 过程 和预 测体 内物质 消化 率 ， 且具 有简 单 、 快捷 、 重 复性 好 、 可 在常 规 实验 室 条件 下 进行 等优 点 ， 从 而在评 定 反刍 动物饲 料营养 价值 上得 到 了较为 广泛 的应用 。 本文 在参考 文献 的基 础上 ， 结 合 自己 的试 验经 验介 绍 了短期瘤 胃技 术 的应用 方法 及存在 的问题 。
２ ０ １ ３年 １ １月 第 ６期 （ 总第 １ ６ ３期 ）
瘤胃发酵与乳成分
瘤胃发酵与乳成分今后还有提高无脂固形物率比重的可能性，尤其是乳蛋白质。
长期以来，改良育种牛群往往注重乳脂率，现在是转向以无脂固形物率为主的时候了。
然而，改良育种并非是一朝一夕的事，眼下可做的工作是通过提高饲养管理技术，提高牛乳中的无脂固形物率和乳蛋白质率。
这些乳成分的变化与瘤胃发酵密切相关。
一、饲料的营养成分与乳成分饲料中的营养成分在奶牛体内经消化、吸收转换和再全成等作用，在乳腺中合成牛乳的各种营养成分（图1）。
乳脂肪中50％来自饲料的碳水化合物经瘤胃发酵产生的乙酸和丁酸。
余下的50％来自饲料或体脂肪中的长链脂肪酸。
无脂固形物中主要成分的乳糖来自饲料中碳水化合物经瘤胃发酵产生的丙酸，在肝脏中合成葡萄糖。
无脂固形物中乳蛋白质是饲料中粗蛋白质直接或间接供给的氨基酸，经小肠吸收在乳腺中合成酪蛋白和其他蛋白质。
体组织中蛋白质的氨基酸也是合成乳蛋白质的来源之一。
在所有乳成分的合成中，最重要的是提高葡萄糖含量。
葡萄糖既是合成乳糖的原料，又是作为乳脂肪原料丙三醇的前体物质。
还有葡萄糖在肝脏里与非必需氨基酸可以相互转换，因而也与乳蛋白质有关。
由此可见，饲料中各种营养成分是合成牛乳营养成他的主要来源。
乳成分受饲料中各种营养成分的平衡、饲喂方法、奶牛的泌乳期和能量的收支状态等诸多因素的影响，更为重要的是，饲料营养成分以瘤胃微生物的发酵作用，产生的各种成分在很大程度上决定乳成分。
因此，乳成分与瘤胃发酵紧密相连。
二、氨基酸与乳蛋白质在牛奶成分中，乳糖的含量最多，约占4.7－5％，一般来说，其变动幅度不大。
乳糖在乳腺和乳房内关系到渗透压的维持，若乳糖率有增有减时，产乳量也因此而随之增减。
故在产乳量稳定的状态下，无脂固形物率的变动主要是由乳蛋白质的变化而引起的。
合成乳蛋白质的原料是氨基酸。
其来源有①饲料中非蛋白氮、溶解性蛋白质和降解性蛋白质在瘤胃中分解成氨，合成微生物蛋白质，在小肠里吸收氨基酸；②非降解性蛋白质分解的氨基酸和③体组织蛋白质分解的氨基酸。
持续瘤胃发酵方法测定混合饲料体外发酵产气量和pH值的试验研究
持续瘤胃发酵方法测定混合饲料体外发酵产气量和pH值的试验研究摘要：pH值和产气量是瘤胃发酵参数的重要指标，pH值的变化直接影响着反刍动物的瘤胃内环境，影响着微生物的活动；本试验的目的是通过体外发酵方法测定混合饲料的体外发酵参数，为混合饲料在生产上应用提供理论参数。
而产气量则在一定程度上反映了饲料的发酵类型和发酵程度，是评价饲料营养价值的重要指标。
关键词：pH值；瘤胃发酵参数Continuous rumen fermentation method for determining mixed feed in vitro fermentation gas production rate and pH value of the test researchAbstract: ph value and gas production is rumen fermentation parameters of important indicators ，ph value change directly affectsthe ruminant of rumen internal environment ，affect microbialactivity ，the purpose of this study is through the in vitrofermentation method for determining mixed feed in vitro fermentation parameters ，for mixed feed in the production application provide theoretical parameters ，and the gas production is in a certain extent reflects the feed fermentation type and degree of fermentation .Key words: ph value ; rumen fermentation parameters目录引言 - 1 -1材料与方法 - 1 -1.1试验材料 - 2 -1.1.1试验动物 - 3 -1.1.2试验材料 - 3 -1.1.3试验仪器 - 4 -1.2试验方法 - 4 -1.2.1样品采集与处理 - 4 -1.2.1.1瘤胃内容物的采集 - 5 - 1.2.1.2瘤胃微生物的培养 - 5 - 1.2.1.3开始培养 - 6 -1.2.1.4更换饲料袋和取样 - 7 - 1.2.1.5样品采集 - 8 -1.2.2瘤胃发酵指标测定方法 - 9 - 1.2.2.1pH值的测定 - 10 -1.2.2.2产气量的测定 - 11 -2讨论 - 12 -3结论 - 13 -4参考文献 - 14-5致谢 - 15 -6附录 - 16 -前言目前要以整体上全面清楚地实施瘤胃发酵调控以期获得能发挥动物最大生产性能的最佳发酵模式还不太现实这是因为人们对瘤胃发酵系统本身还不十分清楚, [2]特别是缺乏瘤胃微生物生态学、生理学和生化代谢方面的详尽知识, 就现阶段来说, 瘤胃发酵调控只停留在局部表面上, 是模糊被动的, 很多方面是知其然不知其所以然。
瘤胃发酵试验方法
瘤胃体外发酵方法绞股蓝皂甙对山羊瘤胃菌群及微生物发酵特性和甲烷产量的影响_王新峰1.2瘤胃液的采集和培养基制备瘤胃液来自4头装有永久性瘤胃屡管的波尔山羊与本地山羊的杂交成年公山羊,日粮以羊草为主,每日补饲1509精料(精料组成,玉米:豆粕=2:1),自由饮用清洁水。
于晨饲前采集瘤胃液,用4层纱布过滤,与培养基按1:2混合,在39℃培养箱中培养30分钟,并充分通入CO2,进行厌氧分装,每瓶60mL。
每升培养基中含有15.71mg CaCl2·2H2O,11.90mg MnCl2·4H2O, 1.19mg CoCl2·6H2O, 9.52mg Fe Cl3·6H2O, 0.143g MgSO4·7H2O, 76.2mgNaOH, 0.95gNH4HCO3, 8.33g NaHCO3, l.36g Na2HPO4, 1.48g KH2PO4, 2.98g Na2S·9H2O和0.298g盐酸半肌胺(Menke等,1979)1.3试验设计试验根据绞股蓝皂试添加量(0、5、10、20和40 mL /60mL)分为5组,对照组不加皂试,实验组分别加入5,10,20和40mg皂试。
取60mL瘤胃液与培养基混合液(瘤胃液:培养基二1:2)分装于160mL的发酵瓶中,每瓶含0.69底物"底物由精料和粗饲料组成(3:7),精料为玉米和豆粕,分别为0.126和0.054g,粗饲料为0.42g羊草草粉(过1mm筛)。
发酵瓶封盖!气压平衡后置于39℃培养箱中培养,并定时摇匀,培养24h。
第二次发酵培养120h,分别在0,1,2,4,6,8,12,24, 48,72,96,120h, 计算出累积产气量;测定120h后干物质消失率。
1.4指标测定1.4.1产气量的测定根据Theodorou等(1994)的方法,使用气压转换器(IGER,UK)定时测定厌氧瘤胃微生物发酵产气量。
汪水平PDF 2015 体外法研究生石膏对瘤胃发酵、甲烷生成及微生态的影响
收稿日期：２０１４－０６－２６ 基金项目：中央高校基本科研业务费专项基金资助项目（ＸＤＪＫ２０１４Ｃ１５４） 作者简介：汪水平（１９７９－），男，副教授，博士。
体外法研究生石膏对瘤胃发酵、甲烷生成及微生态的影响汪水平 （西南大学荣昌校区，重庆４０２４６０）摘要：通过体外产气法研究了生石膏对瘤胃发酵、甲烷生成及微生态的影响。
按单因子试验设计，在底物中分别按其干物质的０（对照组）、１．２５％（低水平组）、２．５％（高水平组）添加生石膏，每个组设４个重复，进行２４ｈ体外发酵培养。
结果显示，随生石膏添加水平升高，乙酸与总挥发性脂肪酸浓度、乙酸与丙酸的浓度比、１２和２４ｈ产气量、氢的生成量及甲烷菌数量显著（Ｐ＜０．０５）或极显著（Ｐ＜０．０１）降低，而丙酸占总挥发性脂肪酸的比例与原虫数量极显著（Ｐ＜０．０１）升高；生石膏添加会显著（Ｐ＜０．０５）或显著（Ｐ＜０．０１）降低１２和２４ｈ甲烷产量，而高水平添加会显著（Ｐ＜０．０５）降低丙酸浓度与乙酸占总挥发性脂肪酸的比例。
结果表明，生石膏可通过减少氢的供应量和抑制甲烷菌生长而降低体外甲烷产量，同时会促进原虫增殖，致使２种添加水平的相对甲烷抑制潜势没有显著（Ｐ＞０．０５）差异。
关键词：生石膏；瘤胃发酵；甲烷生成；微生态中图分类号：Ｓ８１６．７ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００５－４５４５（２０１５）０５－０７８９－０６Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｇｙｐｓｕｍ Ｆｉｂｒｏｓｕｕｍｏｎ ｒｕｍｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌｆｌｏｒａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＷＡＮＧ Ｓｈｕｉ－ｐｉｎｇ （Ｒｏｎｇｃｈａｎｇ Ｃａｍｐｕｓ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０２４６０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｇｙｐｓｕｍ Ｆｉｂｒｏｓｕｕｍｏｎ ｒｕｍｅｎ ｆｅｒ－ｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｍｅｔｈａｎｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｕｍｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇａｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｒａｎｄｏｍ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ，Ｇｙｐｓｕｍ Ｆｉｂｒｏｓｕｕｍｗａｓ ａｄｄｅｄ ａｔ ｌｅｖｅｌｏｆ ０（ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ），１２．５ｇ（ｌｏｗ ｌｅｖｅｌ ｇｒｏｕｐ），２５ｇ（ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｇｒｏｕｐ）ｐｅｒ ｋｇ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｄｒｙｍａｔｔｅｒ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｅｖｅｒｙ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｉｎ ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ．Ｔｈｅ ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｗａｓ ２４ｈ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ｇｙｐｓｕｍ Ｆｉｂｒｏｓｕｕｍ，ａｃｅｔａｔｅ ａｎｄｔｏｔａｌ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ（ＶＦＡ）ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ａｃｅｔａｔｅ ｔｏ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ｒａｔｉｏ，ｇａｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｔ １２ｈａｎｄ ２４ｈ，ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５ｏｒ Ｐ＜０．０１）ｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｂｕｔ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ｔｏ ｔｏｔａｌ ＶＦＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｚｏａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０１）ｉｎｃｒｅａｓｅｄ；ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｙｐｓｕｍ Ｆｉｂｒｏｓｕｕｍｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５ｏｒ Ｐ＜０．０１）ｄｅ－ｃｒｅａｓｅｄ ｍｅｔｈａｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｔ １２ｈａｎｄ ２４ｈ，ａｎｄ ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５）ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｒａｔｉｏ ｏｆ ａｃｅｔａｔｅ ｔｏ ｔｏｔａｌ ＶＦＡ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓ－ｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｙｐｓｕｍ Ｆｉｂｒｏｓｕｕｍｃｏｕｌｄ ａｂａｔｅ ｍｅｔｈａｎｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉａ ｔｈｅ ｒｅｄｕｃ－ｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｓｕｐｐｌｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｓ，ａｎｄ ｍｉｇｈｔ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆｐｒｏｔｏｚｏａ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｉｎ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ＞０．０５）ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｅｔｈａｎｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｔｈｅ Ｇｙｐｓｕｍ Ｆｉｂｒｏｓｕｕｍａｄｄｅｄ ｇｒｏｕｐｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｙｐｓｕｍ Ｆｉｂｒｏｓｕｕｍ，ｒｕｍｅｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｒｕｍｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｅｓ 瘤胃微生物发酵为宿主动物提供挥发性脂肪酸（ｖｏｌａｔｉｌｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ，ＶＦＡ）和微生物蛋白等发酵产物，同时也产生甲烷通过嗳气释放进大气中。
瘤胃发酵试验方法讲述
瘤胃体外发酵方法绞股蓝皂甙对山羊瘤胃菌群及微生物发酵特性和甲烷产量的影响_王新峰1.2瘤胃液的采集和培养基制备瘤胃液来自4头装有永久性瘤胃屡管的波尔山羊与本地山羊的杂交成年公山羊,日粮以羊草为主,每日补饲1509精料(精料组成,玉米:豆粕=2:1),自由饮用清洁水。
于晨饲前采集瘤胃液,用4层纱布过滤,与培养基按1:2混合,在39℃培养箱中培养30分钟,并充分通入CO2,进行厌氧分装,每瓶60mL。
每升培养基中含有15.71mg CaCl2·2H2O,11.90mg MnCl2·4H2O, 1.19mg CoCl2·6H2O, 9.52mg Fe Cl3·6H2O, 0.143g MgSO4·7H2O, 76.2mgNaOH, 0.95gNH4HCO3, 8.33g NaHCO3, l.36g Na2HPO4, 1.48g KH2PO4, 2.98g Na2S·9H2O和0.298g盐酸半肌胺(Menke等,1979)1.3试验设计试验根据绞股蓝皂试添加量(0、5、10、20和40 mL /60mL)分为5组,对照组不加皂试,实验组分别加入5,10,20和40mg皂试。
取60mL瘤胃液与培养基混合液(瘤胃液:培养基二1:2)分装于160mL的发酵瓶中,每瓶含0.69底物"底物由精料和粗饲料组成(3:7),精料为玉米和豆粕,分别为0.126和0.054g,粗饲料为0.42g羊草草粉(过1mm筛)。
发酵瓶封盖!气压平衡后置于39℃培养箱中培养,并定时摇匀,培养24h。
第二次发酵培养120h,分别在0,1,2,4,6,8,12,24, 48,72,96,120h, 计算出累积产气量;测定120h后干物质消失率。
1.4指标测定1.4.1产气量的测定根据Theodorou等(1994)的方法,使用气压转换器(IGER,UK)定时测定厌氧瘤胃微生物发酵产气量。
短期人工瘤胃发酵法研究不同水平大豆黄酮和染料木素对奶牛瘤胃液的影响
前景 的新型 饲料添 加剂 Ｅ 。近 年来 ，大量 研 究 表 明 ５ ３
大豆 异黄酮 可通 过影 响神经 内分泌 对反 刍动物 机体 产 生一 系列 作用 ， 而促 进动 物生长 、 从 促进 乳腺 发育
试 验 动 物选 用 ３头 体况 良好 ， 装 有永 久 性瘤 安 胃瘘 管 的泌乳 中期 荷斯坦 奶 牛为瘤 胃液 供体 。从 预 试期 开 始 饲 喂 统 一 日粮 ， 天 早 、 各 饲 喂 １次 每 晚 （ ６ ０ 、８ ０ ） 先 精 后 粗 ， 天 榨 乳 ２次 （ ７ Ｏ 、 ０ ：０ １ ：０ ， 每 ０ ： ０ １ ：０ ， 饲栓 系 ， ９０ ）舍 自由饮 水 。
１ ２ 试 验 日粮 ．
和提 高泌乳 、 改善 乳成 分 、 提高 动 物 机体 免 疫 力 、 促
进 生殖 系统 发 育 和影 响 繁 殖力 等 。但 有 关 其 影
响反刍 动物瘤 胃发 酵参数 的报 道不 多且试 验结 果 尚 不 一致 ， 研究 多趋 向于 对 稳定 瘤 胃 ｐ 提 高瘤 胃微 Ｈ、
刘 春 龙 李 忠 秋。 张 帆 许 岩 姜 文 博 单 安 山卜 。
（ 东 北 农 业 大 学 动 物 营 养 研 究 所 ， 尔 滨 １ ０ ３ ； １ 哈 ５ ０ ０ ２ ．中 国 科 学 院 东北 地 理 与农 业 生 态 研 究 所 黑 土 生 态 重 点 实 验 室 ， 尔 滨 １ ０ ８ ； 哈 ５ ０ １ ３ ．黑 龙 江 省 农 业 科 学 院 畜牧 研究 所 ， 尔滨 １ ０ ８ ； ．黑 龙 江 海 顺 奶 牛 场 ， 尔 滨 １ ０ ４ ） 哈 ５０６４ 哈 ５ ０ ０ 摘 要 ： 用 短 期 人 工 瘤 胃发 酵 法研 究 大 豆黄 酮 （ ） 染 料 木 素 （ ） 产气 量 和人 工 瘤 胃发 酵 参数 的影 响 ， 采 Ｄａ 和 Ｇｅ 对 旨在
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瘤胃体外发酵方法绞股蓝皂甙对山羊瘤胃菌群及微生物发酵特性和甲烷产量的影响_王新峰1.2瘤胃液的采集和培养基制备瘤胃液来自4头装有永久性瘤胃屡管的波尔山羊与本地山羊的杂交成年公山羊,日粮以羊草为主,每日补饲1509精料(精料组成,玉米:豆粕=2:1),自由饮用清洁水。
于晨饲前采集瘤胃液,用4层纱布过滤,与培养基按1:2混合,在39℃培养箱中培养30分钟,并充分通入CO2,进行厌氧分装,每瓶60mL。
每升培养基中含有15.71mg CaCl2·2H2O,11.90mg MnCl2·4H2O, 1.19mg CoCl2·6H2O, 9.52mg Fe Cl3·6H2O, 0.143g MgSO4·7H2O, 76.2mgNaOH, 0.95gNH4HCO3, 8.33g NaHCO3, l.36g Na2HPO4, 1.48g KH2PO4, 2.98g Na2S·9H2O和0.298g盐酸半肌胺(Menke等,1979)1.3试验设计试验根据绞股蓝皂试添加量(0、5、10、20和40 mL /60mL)分为5组,对照组不加皂试,实验组分别加入5,10,20和40mg皂试。
取60mL瘤胃液与培养基混合液(瘤胃液:培养基二1:2)分装于160mL的发酵瓶中,每瓶含0.69底物"底物由精料和粗饲料组成(3:7),精料为玉米和豆粕,分别为0.126和0.054g,粗饲料为0.42g羊草草粉(过1mm筛)。
发酵瓶封盖!气压平衡后置于39℃培养箱中培养,并定时摇匀,培养24h。
第二次发酵培养120h,分别在0,1,2,4,6,8,12,24, 48,72,96,120h, 计算出累积产气量;测定120h后干物质消失率。
1.4指标测定1.4.1产气量的测定根据Theodorou等(1994)的方法,使用气压转换器(IGER,UK)定时测定厌氧瘤胃微生物发酵产气量。
根据各产气量和气压进行校正,除去空白发酵瓶产气量,计算出累积产气量。
4.3挥发性脂肪酸的测定取发酵液样品lmL加25%偏磷酸和巴豆酸(内标法,100mL溶液中含巴豆酸0.6464g)混合液0.2mL,-20℃冰箱保存。
测定前解冻,12,000rpm离心lomin,取上清液0.6uL测定。
优化胡伟莲方法测定VFA(胡伟莲,2005),柱温130℃,进样器温度为180℃,检测器温度为180℃)。
高纯氮总流量30.2mL/min,柱流l.7mL/min,氢气流量40mL/min,空气流量4O0mL/min。
4.4氨态氮浓度测定将样品与0.2N盐酸等体积混合,于-20℃保存。
测定前解冻,于4℃条件下,10,000rpm离心l0min,取上清液采用比色法进行测定分析(weatherburn,1967)"4.5微生物蛋白浓度测定取瘤胃内容物7ml保存在-20℃冰箱"测定前解冻,取3ml混匀样品在1,000rpm/min,离心8分钟去除原虫和饲料残渣。
取2ml上清液在25,000Xg离心20分钟(Makkar等,1982)。
取10ul上清液加入到5ml考马斯亮蓝溶液中,在595nm波长下读取吸光度值,以牛血清蛋白为标准溶液计算样品微生物蛋白含量。
1.4.6原虫计数将混匀发酵液4层纱布过滤后与9%甲醛等比例混合避光保存,用改装的血细胞计数板计数。
改装后计数板的计数室高度为0.25mm,以确保较大体积原虫也能被计数(Newbold 等,1987。
4.7氢的还原力根据Demeyer(1991)挥发性脂肪酸和CH4产量计算,计算公式:2Hr(%)=(4M+2P+2B)*100/(1A+P+4B)其中,A,乙酸;P,丙酸;B,丁酸;M,C执(以上均为净摩尔产量)。
对瘤胃微生物发酵参数的影响1材料与方法1.1试验动物、日粮组成与试验设计试验动物为4只1岁左右、体重在30士2.3kg波尔山羊与本地山羊杂交的一岁阉公羊采用4x4拉丁方设计,日粮组成为70%的羊草,20%的玉米及10%的豆粕(代谢能,2742.5kcal/kg;粗蛋白,12.96%;粗纤维,22.33%)。
每期为16天,适应期H天,采样时间为5天,共4期。
两次于8:00和17:00点等量瘤胃灌注。
对照组以与试验组相同体积生理盐水灌注,自由饮用清洁水。
2样品采集与分析饲料采食量分别在每期的11-13天测定。
记录每日饲料添加量和剩余料量,以干物质为基础计算采食量"饲喂后第14天,分别在采食前0h和采食后2,4和8h利用负压通过瘤胃痰管采集瘤胃内容物,用四层纱布过滤去除大的饲料残渣后,迅速测定瘤胃内容物的pH值,将过滤后瘤胃液分成4份。
取上述过滤的瘤胃液一份,将瘤胃液与25%偏磷酸溶液按5:1比例进行混合-20℃冷冻保存,以备vFA测定(Jouany,1982),其中25%的偏磷酸溶液中含有6.4g/l的巴豆酸(内标测定vFA)(Cottyn和Boucque,1968).冷冻瘤胃液解冻后于12,ooo×g/min在4℃条件下离心l0min,取上清液0.6u上气相测定vFA含量。
气相色谱仪(岛津,GC-14B,日本)具有氢离子火焰检测器,毛细柱为No.34292-07B,30m×0.32rnm×0.25四膜(Supelco,美国)。
汽化室温度为180℃,柱温135℃,检测室温度180℃，高纯氮总流量30.2mL/min,柱流1.7mL/min,氢气流量40mL/ min,空气流量400mL/ min。
根据Demeyer(1991)的方程计算CH4产量和氢利用率。
方程如下:瘤胃可发酵有机物(FOM)gmol-1 vFA=162(0.5A+0.5P+B) vCH4产量(Lkg-1FOM)=(1.8A一l.1P+l.61B)×l000×22.4(4×v)2Hr(%)=(4M+2P+2B)×100/(2A+P+4B),其中A,乙酸;B,丁酸;P,丙酸;M,CH4。
.以上均为净摩尔数。
第二份取4ml瘤胃液样品加入等量的0.2mol/L的盐酸-20℃冷冻,用比色法测定氨态氮浓度,波长为625nm。
样品解冻后在4℃条件下15,000×g离心15min,上清液用来测定氨态氮浓度(Chaney,1962)"第三份取7ml样品-20℃保存用于微生物蛋白的测定"室温解冻,取3ml混匀样品,1,000r/min离心8min除去原虫和饲料残渣.取上清液2ml在25,000×g离心20min,去除上清液,沉淀中加入0.5mL0.25N氢氧化钠溶液,100℃煮沸10min，取100ul上清液加入到5ml 考马斯亮蓝溶液中,在595nm条件下比色读取吸光度值。
以结晶牛血清白蛋白为标准品做标准曲线计算样品微生物蛋白含量。
对原虫、产甲烷菌及细菌区系的影响1材料与方法1.1动物、试验设计及采样同本章第一节。
1.2用于原虫PCR/DGGE分析的样品保存及引物比较比较-20℃冷冻保存和液氮保存PCR/DGGE的样品效果及两对常用瘤胃原虫PCR/ DGGE 引物的筛选.2.1实验动物和瘤胃内容物的收集随机选取4只(A、B、C和D)装有永久性瘤胃瘩管的波尔山羊与本地山羊杂交后代,自由采食全粗料。
实验期间分别于饲喂前0h和饲喂后1、2、4和8h从山羊瘤胃采集瘤胃内容物,4层纱布过滤,迅速投入液氮和-20℃保存以备瘤胃微生物基因组DNA的提取。
1.2.2瘤胃内容物总DNA的提取参照Zoetendal等(1998)方法,将液氮和-20℃保存样品室温解冻,取解冻后混匀的瘤胃内容物样品1.smL,珠磨法机械破碎内容物后,用酚和氯仿/异戊醇提取瘤胃内容物总DNA。
1.2.3PCR扩增反应以瘤胃内容物总DNA为模板,两对原虫特异性引物进行比较,对原虫的185rRNA进行特异PCR扩增扩增"引物序列见表2-2。
1.3山羊瘤胃微生物基因组DNA提取本章第一节所采集瘤胃液样品迅速保存在液氮中以备基因组DNA提取（DNA提取效果优于冷冻,见原虫DGGE方法优化部分)(Zoetendal等,1998)。
所提取基因组DNA用于原虫、细菌和产甲烷菌区系及微生物的定量分析。
1.4瘤胃微生物的DGGE引物表2-2试验中使用的PCR引物Table 2-2 The primers used in the experiment使用特异的原虫、细菌和产甲烷菌DGGE引物(表2-2)扩增原虫18srDNA、细菌和产甲烷菌16srDNA。
使用Bio-Rad Dcode系统进行DGGE电泳,8%的丙烯酸胺溶液制成30-50%的梯度凝胶对原虫区系分析,8%的丙烯酞胺溶液制成38-53%的梯度凝胶对细菌区系分析,6%的丙烯酞胺溶液制成30-70%的梯度凝胶对产甲烷菌区系分析。
先200V预电泳10min,然后85V电泳16h。
对DGGE胶进行银染(Muyzer,1993)。
DGGE胶上主要的和特异的条带用洁净的刀片和枪头切下移入。
1.5ml离心管中,37℃或室温过夜再进行PCR扩增,纯化PCR产物后测序,在GenBank上比对寻找最相似菌。
对山羊瘤胃微生物数量的影响1材料与方法1.1试验设计本章第一节山羊在体试验不同时间点的DNA样品进行分析研究,以山羊瘤胃总细菌为参照,对瘤胃中methanogens,fungi,R.flavefaciens和F.succinogenes的相对数量进行定量分析。
1.2仪器设备!试剂与耗材实时定量PCR仪(ABI7300,美国)如图2-12。
实时定量PCR反应采用SYBR Green染料法,荧光染料预混试剂为SYBR Green Realtime PCR master Mix with ROX(TOYOBO,Japan)。
实时定量PCR反应在八联管上进行(Axgen,USA)表2-4 定量PCR引物Table 2-4 PCR Primers for qPCR assay1.3原虫计数取瘤胃液与等量9%的甲醛溶液混合,于4℃保存用于原虫计数。
样品需进一步稀释以便于计数,原虫总数和五种原虫在显微镜下计数(Newbold,1987)。
为保证所有个体大小不同原虫都能被准确计数,对计数板进行了改装,使计数室高度增加为0.25mm。
1.4定量PCR反应体系与扩增条件使用上述DNA样品对瘤胃微生物进行了定量分析(如总菌,真菌,产甲烷菌,黄化瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌),以上微生物的特异性引物见表2-4(Denman等,2006)。
使用荧光染料SYBR Green进行标记,使用瘤胃微生物特异性引物,对微生物进行PCR扩增,根据定量PCR 的循环数对微生物进行相对定量分析(ABI 7300,USA)(Denman等,2006;Chen等,2008)。