瘤胃发酵试验方法

瘤胃体外发酵方法

绞股蓝皂甙对山羊瘤胃菌群及微生物发酵特性和甲烷产量的影响_王新峰

1.2瘤胃液的采集和培养基制备

瘤胃液来自4头装有永久性瘤胃屡管的波尔山羊与本地山羊的杂交成年公山羊,日粮以羊草为主,每日补饲1509精料(精料组成,玉米:豆粕=2:1),自由饮用清洁水。于晨饲前采集瘤胃液,用4层纱布过滤,与培养基按1:2混合,在39℃培养箱中培养30分钟,并充分通入CO2,进行厌氧分装,每瓶60mL。

每升培养基中含有15.71mg CaCl2·2H2O,11.90mg MnCl2·4H2O, 1.19mg CoCl2·6H2O, 9.52mg Fe Cl3·6H2O, 0.143g MgSO4·7H2O, 76.2mgNaOH, 0.95gNH4HCO3, 8.33g NaHCO3, l.36g Na2HPO4, 1.48g KH2PO4, 2.98g Na2S·9H2O和0.298g盐酸半肌胺(Menke等,1979)

1.3试验设计

试验根据绞股蓝皂试添加量(0、5、10、20和40 mL /60mL)分为5组,对照组不加皂试,实验组分别加入5,10,20和40mg皂试。取60mL瘤胃液与培养基混合液(瘤胃液:培养基二1:2)分装于160mL的发酵瓶中,每瓶含0.69底物"底物由精料和粗饲料组成(3:7),精料为玉米和豆粕,分别为0.126和0.054g,粗饲料为0.42g羊草草粉(过1mm筛)。发酵瓶封盖!气压平衡后置于39℃培养箱中培养,并定时摇匀,培养24h。第二次发酵培养120h,分别在0,1,2,4,6,8,12,24, 48,72,96,120h, 计算出累积产气量;测定120h后干物质消失率。

1.4指标测定

1.4.1产气量的测定

根据Theodorou等(1994)的方法,使用气压转换器(IGER,UK)定时测定厌氧瘤胃微生物发酵产气量。根据各产气量和气压进行校正,除去空白发酵瓶产气量,计算出累积产气量。

4.3挥发性脂肪酸的测定

取发酵液样品lmL加25%偏磷酸和巴豆酸(内标法,100mL溶液中含巴豆酸0.6464g)混合液0.2mL,-20℃冰箱保存。测定前解冻,12,000rpm离心lomin,取上清液0.6uL测定。优化胡伟莲方法测定VFA(胡伟莲,2005),柱温130℃,进样器温度为180℃,检测器温度为180℃)。高纯氮总流量30.2mL/min,柱流l.7mL/min,氢气流量40mL/min,空气流量4O0mL/min。

4.4氨态氮浓度测定

将样品与0.2N盐酸等体积混合,于-20℃保存。测定前解冻,于4℃条件下,10,000rpm离心l0min,取上清液采用比色法进行测定分析(weatherburn,1967)"

4.5微生物蛋白浓度测定

取瘤胃内容物7ml保存在-20℃冰箱"测定前解冻,取3ml混匀样品在1,000rpm/min,离心8分钟去除原虫和饲料残渣。取2ml上清液在25,000Xg离心20分钟(Makkar等,1982)。取10ul上清液加入到5ml考马斯亮蓝溶液中,在595nm波长下读取吸光度值,以牛血清蛋白为标准溶液计算样品微生物蛋白含量。

1.4.6原虫计数

将混匀发酵液4层纱布过滤后与9%甲醛等比例混合避光保存,用改装的血细胞计数板计数。改装后计数板的计数室高度为0.25mm,以确保较大体积原虫也能被计数(Newbold 等,1987。

4.7氢的还原力

根据Demeyer(1991)挥发性脂肪酸和CH4产量计算,计算公式:

2Hr(%)=(4M+2P+2B)*100/(1A+P+4B)

其中,A,乙酸;P,丙酸;B,丁酸;M,C执(以上均为净摩尔产量)。

对瘤胃微生物发酵参数的影响

1材料与方法

1.1试验动物、日粮组成与试验设计

试验动物为4只1岁左右、体重在30士2.3kg波尔山羊与本地山羊杂交的一岁阉公羊采用4x4拉丁方设计,日粮组成为70%的羊草,20%的玉米及10%的豆粕(代谢能,2742.5kcal/kg;粗蛋白,12.96%;粗纤维,22.33%)。每期为16天,适应期H天,采样时间为5天,共4期。两次于8:00和17:00点等量瘤胃灌注。对照组以与试验组相同体积生理盐水灌注,自由饮用清洁水。

2样品采集与分析

饲料采食量分别在每期的11-13天测定。记录每日饲料添加量和剩余料量,以干物质为基础计算采食量"饲喂后第14天,分别在采食前0h和采食后2,4和8h利用负压通过瘤胃痰管采集瘤胃内容物,用四层纱布过滤去除大的饲料残渣后,迅速测定瘤胃内容物的pH值,将过滤后瘤胃液分成4份。取上述过滤的瘤胃液一份,将瘤胃液与25%偏磷酸溶液按5:1比例进行混合-20℃冷冻保存,以备vFA测定(Jouany,1982),其中25%的偏磷酸溶液中含有6.4g/l的巴豆酸(内标测定vFA)(Cottyn和Boucque,1968).冷冻瘤胃液解冻后于12,ooo×g/min在4℃条件下离心l0min,取上清液0.6u上气相测定vFA含量。气相色谱仪(岛津,GC-14B,日本)具有氢离子火焰检测器,毛细柱为No.34292-07B,30m×0.32rnm×0.25四膜(Supelco,美国)。汽化室温度为180℃,柱温135℃,检测室温度180℃，高纯氮总流量30.2mL/min,柱流1.7mL/min,氢气流量40mL/ min,空气流量400mL/ min。

根据Demeyer(1991)的方程计算CH4产量和氢利用率。方程如下:

瘤胃可发酵有机物(FOM)gmol-1 vFA=162(0.5A+0.5P+B) v

CH4产量(Lkg-1FOM)=(1.8A一l.1P+l.61B)×l000×22.4(4×v)

2Hr(%)=(4M+2P+2B)×100/(2A+P+4B),其中A,乙酸;B,丁酸;P,丙酸;M,CH4。.以上均为净摩尔数。

第二份取4ml瘤胃液样品加入等量的0.2mol/L的盐酸-20℃冷冻,用比色法测定氨态氮浓度,波长为625nm。样品解冻后在4℃条件下15,000×g离心15min,上清液用来测定氨态氮浓度(Chaney,1962)"

第三份取7ml样品-20℃保存用于微生物蛋白的测定"室温解冻,取3ml混匀样

品,1,000r/min离心8min除去原虫和饲料残渣.取上清液2ml在25,000×g离心20min,去除上清液,沉淀中加入0.5mL0.25N氢氧化钠溶液,100℃煮沸10min，取100ul上清液加入到5ml 考马斯亮蓝溶液中,在595nm条件下比色读取吸光度值。以结晶牛血清白蛋白为标准品做标准曲线计算样品微生物蛋白含量。