人源性天然噬菌体展示库的构建

人源性天然噬菌体展示文库的构建及鉴定

年四季黄黎王栩邬于川袁青(四川省泸州医学院基础医学院,泸州646000)

中国图书分类号R392. 11 文献标识码A 文章编号1000 484X( 2010) 06 0544 04

[摘要] 目的:构建人源性天然噬菌体展示文库并对文库进行鉴定。方法: 从未经主动免疫健康志愿者的外周血淋巴

细胞中提取总RNA, 反转录合成cDNA, 用直接PCR 及半巢式PCR 扩增人抗体重链( VH)及轻链( V 和V ) 可变区基因。采用改

进的重叠延伸PCR 法将VH 基因和VL( V 和V) 基因连接成人单链抗体( scFv) 基因, 并将scFv 文库基因克隆到噬菌体载体

pCANTAB5E中, 电转化E . coli TG1, 构建单链抗体文库。结果: 采用直接PCR 和半巢式PCR 扩增得到42 条VH 基因片段, 16

条V 基因片段, 18条V基因片段。混合的VH 和VL 等摩尔比连接后, 产生的单链抗体文库基因大小为750 bp 左右; 转化后构

建了文库容量为1. 35 108

的单链抗体文库。BstN !酶切分析文库中的单链抗体基因结果显示,酶切得到的scFv 指纹图谱均

不相同。结论:构建的抗体文库多样性好, 可用于多种人源性单链抗体的筛选。

[关键词] 单链抗体;噬菌体抗体文库; 重叠延伸PCR

Construction and identification of nonimmunized human phage display library

NIAN Si Ji , HU ANG Li , WANG Xu , WU Y uChuan, YU AN Qing. School o f BasicMedical Sciences, Luzhou Medical Col

lege, Luzhou 646000, China

[Abstract] Objective:To develop non immunized human phage display library.Methods:The total RNA of lymphocyte cells from pe

ripheral blood of healthy voluntee was isolated and cDNA was synthesized, and the genes of heavy variable chain ( VH) and light variable chain

( V and V ) were amplified by direct PCR and half nested PCR. By overlapping extension PCR, the genes of VH and VL( V and V) were

linked. The linked genes of single chain Fv fragment ( scFv) were ligated with the vector pCANTAB 5E and then cloned into TG1 for the scFv

library construction. Results:By direct PCR and half nested PCR, 42 VH fragments, 16 V and 18 Vfragmen ts were obtained. The size of linked

scFv library genes was 750 bp and the volume of constructed scFv library was 1. 35 10

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. The results of BstN ! analysis of scFv genes from

the phage library showed that fingerprint map of the selected scFvs was different. Conclusion:The developed phage library is diversity and can

be used for selecting humanized scFv.

[Key words] Sin gle chain Fv fragment; Phage antibod y library; Overlapping extension PCR

目前单克隆抗体( mAb) 作为治疗性抗体发展

迅速,主要用于免疫治疗肿瘤、免疫性疾病、器官移

植、感染性疾病及心血管疾病等。但单克隆抗体的

临床应用仍然受到一定的限制, 主要障碍是诱导产

生的人抗鼠抗体( HAHA) 反应、肿瘤渗入量低及半

衰期短的问题[ 1]

。随着基因工程技术的发展, 各种

形式的基因工程抗体被构建来改善它们的性能和效

能,其中小分子单链抗体( single chain Fv fragment,

scFv)可通过噬菌体展示的方法制备, 从而使完全人

源化的抗体制备成为可能, 并且单链抗体分子量小,

组织穿透力强[ 2]

。

噬菌体抗体文库技术的出现是抗体工程领域的

重大技术突破。文库容量和多样性是衡量抗体文库

质量的两个重要参数。文库容量越大, 从中筛选得

到抗体的可能性越大, 而且文库容量的大小与所获

抗体的亲和力成正比。在抗体文库的构建过程中,

另外一个重要的指标为抗体文库的多样性,文库的

多样性可通过设计能扩增所有抗体基因的PCR 引

物加以实现。本研究以未经免疫的健康人外周血为

基因来源,以一套被证明能扩增出所有抗体基因的

PCR 引物及自行设计的引物扩增获得全套抗体可变

区基因,从而构建文库容量大、多样性相对良好的人

源性天然噬菌体抗体库,为以后筛选针对各类病毒、

毒素、肿瘤特异性抗原及自身免疫疾病相关抗原的

特异性人源治疗性单克隆抗体奠定基础。

∀ 544 ∀中国免疫学杂志2010年第26卷1 材料与方法1. 1 实验试剂大肠杆菌TG1、辅助噬菌体

M13K07及pCANTAB 5E 噬菌体载体均购自Gene 公

司。淋巴细胞分离液为天根生物技术有限公司产

品。MMLV 反转录酶和RNase inhibi tor 等反转录试

剂及PCR 试剂购自Promega公司。

1. 2 引物设计人抗体可变区引物序列是根据文献[35]中的人抗体可变区引物序列重新设计而成(表

1) ,重新设计的引物有利于简化抗体基因组装程序,

提高组装效率,并且可增加抗体文库的多样性。

1. 3 实验方法

1. 3. 1 人淋巴细胞cDNA 的合成抽取60 例未经

主动免疫健康人的外周血, 用淋巴细胞分离液常规

分离淋巴细胞, 按Trizol 说明书提取淋巴细胞总

RNA,以oligo dT 为引物反转录合成第1 链cDNA。

1. 3. 2 VH 和VL 基因的扩增直接PCR 扩增VH 和

VL 基因:以第1 链cDNA 为模板, 将VH 基因的上游

引物和VH 基因的下游端引物两两配对, 共组成42

对引物;将V和V基因的上游引物和下游引物两

两配对,分别组成16 对引物和18 对引物, PCR 扩增VH、V和V。PCR 反应条件为94 # 1 分钟, 55 # 1

分钟, 72 # 1 分钟,共30个循环, PCR 产物经琼脂糖