限制性片段长度多态性

SNP（单核苷酸多态性），由 单个核苷酸变异引起的DNA顺 序的多态性，估计人类基因组 中存在约几百万个，约每1000 个bp左右就有一个。
–如 在 限 制 性 内 切 酶 酶 切 位 点 发生核苷酸的变异（或多态 性 ） ， 就 会 产 生 RFLP ， 除 SNP外，还包括缺失、重复、 插入、基因重排以及串联重 复序列拷贝数的变异。
基因物理图谱等技术中广泛应 用。
2. 性质和特点：
• 分子大小 • 作用条件 • 识别顺序 • 切口
20－100kdal 对离子强度要求高 大多4－6bp 迴文结构 就在识别顺序内
同工异源酶 （isoschizomer）
不同来源分离出来，但具有相 同 识 别 顺 序 ， 切 割 DNA 方 式 可 以相同，也可以不同。
II 型 酶
就是通常指的DNA限制性内 切 酶 ， II 型 限 制 酶 分 子 量 小 、 仅需Mg2＋作为催化反应辅助 因子。它们能识别双链DNA 的特异顺序，并在这个顺序 内进行切割，产生特异的 DNA片段。
II型限制性内切酶的最大特点 是识别DNA特异顺序并进行切 割，因而在基因重组、DNA序 列分析、基因组甲基化分析及
1 / 46 ＝ 1 / 4.1kb
–识别8个核苷酸的内切酶， 在DNA链上出现机率为:
1 / 48＝1 / 65.5kb
DNA限制性内切酶酶切图谱的 建立
A、部分酶解法：
①完全酶解
3 ，2， 1 kb
②部分酶解 6，5，4，3，2, 1 kb
③分析
5=3+2 4=3+1 3在中间
B.两种以上限制性内切酶交叉酶解法：
–④逻辑判断以上二片段在哪一边末端
C.同位素末端标记，部分酶解法
三、RFLP的检测
1、 RFLP产生的原因
在一个特定基因座位上，存在着两
个或两个以上的等位基因，其中任 何一个在人群中频率不低于10%， 这就是多态性。
但现在认为不同个体中同一位 点上DNA核苷酸序列产生变异， 且在人群中发生频率大于1%， 就可认为是多态性。
7. 药物遗传学和药物基因组学
药物遗传学主要研究遗传因 素对药物代谢和药物反应的 影响，尤其在异常的药物反 应中的作用。
2. 检测方法
(1). 酶切电泳法：
抽提DNA或PCR扩增后的DNA 经内切酶酶切, 然后在琼脂糖凝 胶电泳分析，适合较小分子的 DNA分析
(2). Southern Blot:
DNA先酶切，电泳分离，变性 后转移到尼龙膜或硝酸纤维膜， 然后与同位素标记的探针杂交， 最后做放射自显形，就可检测 出多态性条带。
母（杂合子） 30kb/25kb
患儿（纯合子） 30kb/30kb
胎儿（？） 30kb/25kb
4. 疾病易感或抵抗基因的 检测
HLA DQ 分子Asp57 与胰島素 依赖性糖尿病（IDDM）易感 性有关。
HLA DR2与IDDM 抵抗有关。
5. 器官移植配型
6. 病原体的分型
HPV 6，11型诱发湿疣 HPV 16，18型诱发生殖道癌症
二、DNA限制性内切酶酶 切图谱
限制性内切酶图谱：也称 DNA物理图谱，是DNA链上 某些限制性内切酶酶切位点 的图谱，可作为DNA片段的 特殊标记。是DNA特征的证 据。
–识别4个核苷酸的内切酶， 在DNA链上出现机率为:
1 / 44＝1 / 256bp
–识别6个核苷酸的内切酶， 在DNA链上出现机率为:
四． 应 用
1. 鉴定是否是需要的DNA片段
酶切和电泳
2. 建立基因组图谱
用作多片段的拼装
3. 遗传性疾病的研究和诊断
（1）. 研 究
根据多态性片段寻找与疾 病相关的基因。
(2). 诊 断
– 直接检测 – 连锁分析
苯丙酮尿症连锁分析
父 （杂合子） EcoR V 30kb /25kb
–总长 –3kb – –
EcoRⅠ
HpaⅡ
1.7，0.9，0.4 1.6，1.4
EcoRⅠ+ HpaⅡ
1.2 , 0.9 , 0.5 , 0.4
总长 3kb
EcoRⅠ
Baidu Nhomakorabea
HpaⅡ
1.7，0.9，0.4 1.6，1.4
EcoRⅠ+ HpaⅡ
1.2 , 0.9 , 0.5 , 0.4
–分析： ①HpaⅡ一个切点，可肯定② EcoRⅠ1.7 kb不在末端，在中间③ EcoRⅠ 0.9和0.4 kb都在末端
Sma I
CCCGGG GGGCCC
Xma I
CCCGGG GGGCCC
同尾酶（subset）
不同的酶但切割后突起的核 苷酸序列相同，可相互连接， 重组后可能不被原先酶识别。
BamH I: GGATCC CCTAGG
Bgl II: AGATCT TCTAGA
GGATCT CCTAGA
远距离裂解酶（distant cleavage）
识别位点与切割位点不一致，切 割点在识别位点旁10bp左右，如 Mb2 识别顺序GAAGA,切割位点 在下游第8个bp。
可变酶
–识别顺序中1个或几个核苷酸 是可变的，识别顺序>6bp。 –如Bgl I 识别GCC(N5)GGC, 其N5为5个可变碱基。
3. 内切酶活性定义：
在适当反应条件下，1小时内完 全酶解1g特定DNA底物所需要 的限制性内切酶的量，为一个 活性单位。
I 型 酶:
如酶的识别位点上两条DNA链均未 甲基化，就行使内切酶功能，但切 割点不在识别位点，而在1kb（不少 于400bp）或nkb(最多7kb)处随机切 割；如一条DNA链是甲基化，就行 使甲基化酶功能，使另一条链甲基 化；如两条链均已甲基化，则酶与 DNA链解离。
III 型 酶
与I型酶特性类似，也有甲基化 功能。不同的是它能在DNA链上 的特异位点切割，其切割位点在 识别位点以外，对基因工程的意 义也不大。
RFLP
限制性片段长度多态性
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
是随着生物技术若干领域的 发展而产生的一种分子标记 技术
一． 限制性内切酶
） （restriction endonuclease
1. 简 介
限制性内切酶是一类具有特 殊功能的核酸切割酶，不同 的内切酶可辨认并作用于特 异的DNA序列，并将 DNA切 断