动物基因工程
动物基因工程
动物基因工程
动物基因工程是农业和食品生产中利用生物技术来修改和优化
动物基因组以实现预期目标的一种技术。
它涉及研究和开发改良动物性状，提高动物产量，增强动物健康，改善食品品质和动物营养，以及建立更安全，更有效和更合理的动物繁殖和饲养方法等。
动物基因工程可以把有用的基因组合插入动物体内，以获得更好的性状和能力，从而提高生产效率。
它的应用可以从肉类，乳制品，蛋类，水果和蔬菜等多个方面来看，改善产品的质量和性能，增加其生产量和可持续性。
实施动物基因工程的主要技术有转基因技术和编辑技术。
转基因技术通过将有用的基因插入动物体内来修改它们的性状，通常是将来自其他生物体中的基因插入动物体内。
编辑技术则是在动物体内编辑现有基因，而不是添加新基因，以获得预期的性状。
动物基因工程也是值得讨论的话题，它有助于提高食品安全，增强抗性，延长保质期，改善质量，提高产量，简化品种，等等。
这些改变的从繁殖和遗传学角度都是永久的，即使留下的影响是未知的也可以预见。
当然，它也可能带来一些负面影响，例如引发环境污染或威胁多样性。
因此，必须在研究和使用动物基因工程技术时，严格遵守环境和健康安全法规，并进行足够的监管。
总之，动物基因工程在提高动物的性能和效率方面提供了一种新的途径，但实施此项技术要非常小心，以确保安全和优势的持续使用。
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《动物基因工程》课件
动物基因工程面临的挑战
技术难度
动物基因工程涉及到复杂 的生物学和遗传学知识， 技术难度较大。
伦理和法律问题
动物基因工程涉及到伦理 和法律问题，需要制定相 应的法规和伦理规范。
社会接受度
动物基因工程需要得到社 会的广泛接受和支持，需 要加强宣传和教育。
增强农业生产力
动物基因工程可以提 高农业生产效率，保 障粮食安全。
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生态平衡维护
基因工程动物释放到环境中可能对生态平衡产生影响，引发伦理考 量。
基因歧视
基因工程动物可能引发对某些人群的基因歧视，需要关注平等和公正 的伦理原则。
国际动物基因工程法规
《关于转基因生物安全性的准则》
联合国粮食及农业组织与世界卫生组织共同制定的国际法规，旨在确保转基因生物的安全使用 和释放。
常见的基因修饰动物包括基因敲入动物、基因 敲除与敲入相结合的动物、条件性基因敲除动 物等。
基因修饰动物制备过程中需要关注基因修饰位 点的选择、修饰效率、表型变化等多个因素， 以确保基因修饰动物的制备成功和实验效果。
04
动物基因工程伦理与法规
动物基因工程伦理问题
动物权益保护
基因工程对动物福利的影响，如疼痛、疾病和死亡在实验过程中所 涉及的伦理问题。
福利。
动物基因表达调控
1 2
基因表达调控机制
包括转录水平调控、转录后水平调控和翻译水平 调控等。
调控方式
包括DNA甲基化、组蛋白修饰、miRNA调节等 。
3
调控的意义
通过调控基因表达，可以影响动物的生长发育、 生理功能和行为表现等。
基因工程在动物领域的应用
基因工程在动物领域的应用
基因工程是指通过改变生物体基因序列的方法，来改变其性状和表现形式。
在动物领域，基因工程技术主要应用于以下几个方面：
1. 疾病治疗。
基因工程技术可以通过改变动物体内的基因表达，来治疗一些遗传性疾病。
比如，通过将正常的人类α-1-抗胰蛋白酶基因导入猪体内，可以得到含有人类抗胰蛋白酶的猪胰腺细胞，为治疗胰腺疾病提供了新的途径。
2. 生产工业品。
基因工程技术可以通过改变动物体内的基因表达，来生产一些工业品。
比如，通过将人类凝血因子基因导入奶牛体内，可以得到含有人类凝血因子的牛奶，为制造血友病药物提供了新的途径。
3. 保护生态环境。
基因工程技术可以通过改变动物体内的基因表达，来实现生态环境保护。
比如，通过将人类病毒抑制基因导入蚊子体内，可以减少蚊子对人类的传染病传播，为人类健康和生态环境保护做出了贡献。
基因工程技术在动物领域的应用，为人类提供了新的治疗疾病、生产工业品和保护生态环境的途径，为人类社会的进步和发展带来了重要的贡献。
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动物基因工程
动物基因工程
动物基因工程是一种在生物界中运用现代生物学技术，借助细胞和分子技术，通过调节和改造动物基因，以达到调节生物学特性的技术。
近年来，动物基因工程受到了广泛关注，它在生物科技进步中起到了重要作用。
首先，动物基因工程能够为人类带来很多益处。
动物基因工程可以用于产生药物，例如，经过基因工程处理的牛胰岛素可以治疗糖尿病，经过处理的野毒蛋白可以抑制艾滋病毒。
此外，动物基因工程也可以用于制作生物医药制品，例如抗癌药物，抗病毒药物和镇痛药等。
其次，动物基因工程在农业和畜牧业发展中也有重要作用。
例如，经过基因工程处理的动物抗病力增强，体型变大，体重增加，产量更高、抗寒性更强，抗病虫更强等等，都能够使农业和畜牧业的生产效率提高。
而且，基因工程还能够改进动物的营养成分，改善动物体内结构，从而获得更高品质的动物产品，例如更高蛋白质含量的牛奶、肉等等。
最后，动物基因工程还可以用于维护动物多样性。
人类文明的发展导致动物多样性日益减少，基因工程技术可以帮助科学家们对濒危物种进行基因重组，以恢复其基因组，从而拯救这些濒危动物，挽救它们的灭绝。
从上述可以看出，动物基因工程在生物科技发展中发挥了十分重要的作用。
它不仅可以为农业和动物畜牧业带来巨大的经济效益，而且还可以为人类提供更强效的药物，以及维护动物多样性的能力。
因
此，未来有可能要继续加大动物基因工程技术的研发投入，以推动生物科技的发展，使其更好地服务于人类和动物。
动物基因工程
动物基因工程是一种改变动物基因的科学技术，通过改变动物基因，以达到改善动物质量，提高生物产量的目的。
一方面，动物基因工程可以改变动物的遗传特性，比如可以增加牲畜的生长速度，改善牲畜的品种，从而提高其数量和质量。
另一方面，动物基因工程还可以改善动物的营养品质，比如可以增加牛奶中的营养成分，改善蛋类中的脂肪含量，从而改善人们的营养质量。
动物基因工程也可以用于改变动物的行为特性，比如可以让家禽更安静，使家畜更容易驯养。
此外，它还可以改变动物的身体特征，比如可以让家禽体型更丰满，使家畜的毛变得更亮更柔软。
动物基因工程也可以用于改变动物的免疫特性，比如可以改变牲畜的免疫系统，从而降低其容易受到疾病影响的风险。
此外，它还可以改变动物的生理特性，比如可以改变牲畜的抗热性，从而使它们更能适应高温环境。
总之，动物基因工程作为一种科学技术，可以改变动物的遗传特性、营养品质、行为特性、身体特征以及免疫特性等，从而改善动物的质量和效率，为人类提供更多的食物和营养元素。
动物基因工程
动物基因工程
随着时代的发展，科技也在飞速进步，人类正在研究和发展更先进的科学技术，其中就包括基因工程。
基因工程是指在一个有机体的基因组中添加、修改或删除基因的过程，以引起其生理或行为特性的改变。
本文主要介绍动物基因工程，以及它在现实生活中的应用。
动物基因工程是基因科技中最重要的一部分，它可以使我们对动物的行为和特性有更深刻的理解，并使它们更加适应环境的改变。
例如，科学家们可以通过基因工程的技术，在动物的染色体上添加、修改或删除特定的基因，使这些动物拥有更深刻的特性，更丰富的行为模式，更强的适应性，甚至更强的抗病能力。
动物基因工程在现实生活中有着广泛的应用。
最常见的就是利用该技术来改良家畜，使其更易于饲养，产量更高。
其次，基因工程也可以用于改良动物产品，提高其质量和性能，从而使它们更加适合消费。
此外，它还可以用于改善动物的健康水平，加速动物的增殖速度，以及帮助治疗动物的疾病。
尽管动物基因工程具有巨大的应用前景，但一些人认为这种技术具有不少风险，因此认为应该采取相应措施来防止基因工程带来的危害。
例如，基因工程技术会改变动物的生理或行为特性，可能会对环境造成不可挽回的破坏；其次，基因工程也可能带来很多未知的风险，即在基因组中添加或转移的新基因，以及引入病毒和细菌。
总的来说，动物基因工程在现实生活中具有重要的作用，但也有不少风险和潜在的副作用。
因此，在运用该技术的同时，有必要采取
有效的措施，确保所有的改造可以符合社会的健康、安全和可持续发展的要求。
动物基因工程
五、核酸酶
（一）核酸酶S1 (Nuclease S1) mR核NA酸与酶放S射1主性要标用记于基：因(1组)分、析DDNNAA的：杂R交N体A杂确交定体内结含构子。部通位过。降(2解)切成除熟 DNA片段上的单链末端，形成平末端。(3)切开cDNA合成过程中形成的 发夹环。 (4)在限制酶位点上产生小缺失。 (二)核酸外切酶III
噬菌体是一种温和噬菌体，由于它的遗 传结构和宿主大肠杆菌的遗传结构研究得比较 清楚，并能在细菌中大量繁殖，所以成为广泛 采用的载体。噬菌体还有一大优点，即使它 的DNA丢失25％仍不失活，这部分丢失的空档 正好可以装载外源DNA。
• 与质粒载体相比，λ 噬菌体作为载体可以克隆 更大一些的DNA片段，欲构件一个基因， 往往可以减少中克隆的数量。
实验结果证明，每个YAC都可以装进100万碱基以上 的DNA片段，这种大小比柯斯质粒的装载能力要大数倍， 所以可以保证基因结构的完整性。
(五) 动物病毒
动物病毒作为载体可用于外源基因向真核细胞的 转入。作为基因介导的动物DNA载体，必须具备以下 条件：(1)具有动物病毒的复制起始部位及启动子，以 便外源基因能有效的转染动物细胞，以及提供必要的 转录信号：(2)具有可供选择的标志基因，因为重建的 病毒转染力很低，一般仅为105～107，只有利用标志 基因才能选出转化细胞株；(3)具有适当的多种单一内 切酶位点供外源基因插入。
一、质粒载体(plasmid vector)
（1）质粒的一般性质 1．质粒的概念 质粒是细菌细胞染色体外存在 于细胞质中能进行自我复制的一类小型DNA分 子，大部分质粒为双链环状。 2．质粒的大小 3．质粒的拷贝数 4．质粒的不亲和性 5．质粒的宿主范围
质粒—存在于细菌染色体外的小型环状双 链DNA分子
动物基因工程—基因工程概况
基因工程概况
转基因动物： 已获得转生长激素基因鱼、转生长激素基因猪和抗猪瘟病转基因猪等 。 采用动物乳腺生物反应器技术生产的抗胰蛋白酶因子、C蛋白、凝血酶Ⅲ、
葡萄糖苷酶和乳转铁蛋白等产品也已陆续上市，年产值约10亿美元。 1995年开始大量投资开发体细胞克隆技术，研发重点是生产干细胞，用于
组织修补等治疗性目的。 我国在转基因鱼研究上处于国际领先地位，已生产出生产性能优良的转基
标志着生物技术的核心技术——基因工程诞生
基因工程概况
基因工程概况
内森斯(1928- )
内森斯和史密斯是美国生物学家， 1978 年诺贝尔生理学及医学奖得主， 他们发现了限止性核酸内切酶。
史密斯(1931- )
基因工程概况
博耶(1936-）
美国科学家科恩和博耶合作于1970年把 外源DNA插入细菌质粒，得到了功能性 表达，为重组DNA技术的迅速发展打下 了良好的基础。他们两人被称为“基因 工程”的创始人。
动物生物技术
基因工程概况
第一章
基因工程概况
基因工程概况
在漫长的生物进化过程中，基因重组从来没有停止过。在自然力量和 人类的干预下，通过基因重组、基因突变、基因转移等途径，生物界无止 境的进化，不断使物种趋向完善，也出现了今天各具特色的繁多物种，有 的能耐高温，有的不怕严寒，有的适应干旱的沙漠，有的能在高盐度海滩 上或海水中不断生繁，有的能固定大气中的氮元素.......种种生物的特殊性 状成为今天定向改造生物，创造新物种的丰富遗传资源。
基因药物：已上市的有50种左右，上百种药物正在进行临床试验
基因工程概况
转基因植物：
1986年首次批准转基因烟草进行田间试验。 1994年，转基因番茄被批准商品化生产，成为第一个上市的转基因产品。 至2000年，共批准10313例转基因作物进入田间试验。 据统计，转基因至少在120种植物中获得成功，涉及性状包括抗虫、抗病毒、 抗细茵、 抗真菌、抗除草剂、抗逆境、品质改良，以及提高产量潜力等。 转基因作物种植面积持续增加，至2005，已达9000万公顷，种植转基因作 物的国家达到21个 。
动物基因工程名词解释(一)
动物基因工程名词解释(一)动物基因工程名词解释1. 动物基因工程（Animal Genetic Engineering）动物基因工程是指利用基因技术对动物的基因组进行修改和改良的一种科学研究领域。
通过插入、删除或改变动物基因中的特定序列，可以使动物具备特定的性状或增强某种功能。
例子：科学家通过动物基因工程技术，成功将蛍光基因导入小鼠基因组中，使得这些小鼠身体发出绿色荧光，用于研究某些疾病的发生机制。
2. 基因组编辑（Genome Editing）基因组编辑是指通过特殊的酶或其他方法对动物基因组进行定点修饰和改变的技术。
基因组编辑可以实现对特定基因进行修饰、添加或删除，从而改变动物的遗传特性和表现。
例子： CRISPR-Cas9是一种常用的基因组编辑工具，它可以精确地剪切DNA，并在剪切位点上引入指定的修饰。
通过使用CRISPR-Cas9技术，科学家们成功将人类患有遗传性疾病的小鼠模型进行基因组修复，恢复了正常的基因功能。
3. 转基因动物（Transgenic Animals）转基因动物是指通过人为手段将外源基因导入动物体内，使其在遗传上表达外源基因的动物。
转基因动物常被用于研究某种特定基因的功能、疾病的发生机制以及药物的研发等。
例子：转基因小猪是一种通过基因工程技术将人类所需的器官（如心脏、肝脏等）的功能基因导入小猪胚胎的动物。
它们可以被用作器官移植的来源，以满足人类对器官移植的需求。
4. 启动子（Promoter）启动子是基因组DNA序列中的一个特定区域，它可以调控特定基因的转录过程。
启动子通过与转录因子结合，促进RNA聚合酶的结合和基因转录的启动。
例子：将一种特定的启动子与荧光基因连接，然后将该组合导入小鼠基因组，可以使得小鼠的某个组织或细胞产生荧光，从而实现对该组织或细胞的追踪研究。
5. 基因突变（Gene Mutation）基因突变是指基因序列中发生的变异或改变，可能影响基因的功能和表达。
动物基因工程
动物基因工程动物基因工程是一种有效利用各种生物材料、物质和能量来改变动物基因组，改变其特性或形态的技术。
20世纪80年代以来，基因工程动物的研究和应用迅速发展，并取得了巨大的成就。
通过利用基因可编程技术，可以改变动物的表观遗传特征，改变其形态和生理功能，可为高效种群选择、兽医疾病预防和治疗、蛋白质工程生物技术研究等带来新的机遇。
首先，基因工程可以改进动物性状，提高抗病性、提高繁殖效率。
研究发现，通过基因工程技术，可以快速地将抗病基因转移到宿主动物，克服其先天的病毒感染病历史，从而提高其免疫力。
同时，人们还可以通过基因工程技术改变动物的遗传特性，提高繁殖效率，以达到发展家畜产业的目的。
其次，基因工程可以改变动物的抗药性，提高其疾病抵抗能力。
研究发现，通过技术干预，可以转移抗性基因到宿主动物，有效降低因病毒感染导致的死亡率，提高疾病抵抗能力。
此外，将不同种类之间的基因转移到动物身上，也可以改变其生理特性，提高抗药性，从而使动物更能适应异质环境，以抵御疾病和抗药性细菌的侵袭。
第三，基因工程可以改变动物性格，增强其逆变能力。
人们可以通过技术干预，改变动物的脑化学物质和神经环路，改变其情绪、行为和性格，使其能够适应复杂的环境，可以更好地适应异质的环境，能够快速适应现实与现实之间的变化。
最后，基因工程可以改变动物的形态，提高动物育种水平。
目前，人们可以利用基因可编程技术改变动物的形态，如颜色、肌肉骨骼结构、毛发长度和纹理等，以满足不同育种需求，提高动物育种水平。
通过以上介绍，可以看出，动物基因工程是一种有效利用各种生物材料、物质和能量来改变动物基因组，从而改变其特性或形态的技术，对于提高动物抗病性、繁殖效率、增强疾病抵抗能力、改变动物性格、改善动物形态等方面都有巨大的意义。
然而，从伦理角度，动物基因工程也涉及到可能存在的安全隐患，如何妥善应用和谨慎管理，将成为一个非常重要的考量议题。
4-1 动物基因工程(简)
生 物 反 应 器
生 产 基 因 工 程 产 品 的
第二节
海洋动物基因工程
一、鳗鲡P450c21基因克隆及功能鉴定
二、转基因技术
基因工程的操作步骤
（一）获取目的基因
（二）构建重组 DNA 分子
（三）将重组DNA引入 受体细胞
（四）阳性重组体的筛选与鉴定 （五）目的基因的表达及
（倾向于工程学的范畴） 。
上游技术指外源基因重组、克隆和表达的
设计与构建（即狭义的基因工程）。
下游技术则涉及到含有重组外源基因的生
物细胞的大规模培养以及外源基因表达产
物的分离纯化过程。 基因工程是生物技术的核心部分。 开展基因工程的四大要素或四个基本条件：
工具酶、基因、载体、受体细胞
第一节 基因工程的操作步骤
3. PCR技术： 利用聚合酶链式反应(PCR)可以在体外很快
将DNA 反复甚至是无休止地复制。
内切酶切开DNA
电泳
DNA变性
印迹转移
放射性探针杂交 洗去未杂交游离探针 胶片显影
印 迹 法
印迹法的关键是“分子杂交”，利用 碱基配对的原则，用一段小的已知的 DNA 片断去寻找（“钓”）大的未知的 基因片断。
2、影响重组DNA导入受体细胞的因素：
(1) 使用的受体细胞。如向动物卵细胞显微注射，
成功率在50％左右。 (2) 导入的方法。 (3) 重组DNA在受体细胞中是否受到排斥。
(4) 重组DNA在受体细胞中表达的条件是否具备。
基因工程的操作步骤之(四)
（一）获取目的基因 （二）构建重组 DNA 分子
(2). 物理方法
• 电刺激：在高频电流的作用下，使受体细胞膜出
动物基因工程及应用PPT课件
动物基因工程的应用需要符合相关政策要求。例如，在医学研究中，需要遵循伦 理审查和实验动物管理规定等。
未来发展前景与展望
发展前景
随着技术的不断进步和伦理观念的转变，动物基因工程的应用前景广阔。例如，基因改造动物可用于药物研发、 疾病模型建立等领域。
展望
未来，动物基因工程将更加注重技术突破和伦理问题的解决，以实现更加安全、有效和可持续的应用。同时，国 际合作和政策制定也将在推动动物基因工程的发展中发挥越来越重要的作用。
发展阶段。
2000年代至今
随着CRISPR-Cas9等基因编 辑技术的出现，动物基因工程
取得了突破性进展。
动物基因工程的应用领域
生物医药
利用动物基因工程生产 用于药物研发、疾病治 疗和预防的蛋白质和抗
体。
农业
生物反应器
培育抗病、抗虫、高产、 优质的新品种动物，提 高畜牧业生产效率和经
济效益。
利用转基因动物作为生 物反应器，生产具有重 要价值的蛋白质和药物。
的基因导入到动物基因组中。
打靶后动物的筛选与鉴定
03
通过分子生物学技术，对打靶后动物进行筛选和鉴定，确保获
得所需打靶动物。
03
CHAPTER
动物基因程的应用实例
转基因动物的生产与应用
转基因动物
通过基因工程技术将外源基因 导入动物细胞，使动物获得新
的性状或功能。
应用领域
生物制药、疾病模型、生物反 应器等。
对人类和动物的潜在影响
食品安全与健康
基因工程动物可能携带新 的基因，对人类健康存在 潜在风险，需要加强食品 安全监管。
伦理与道德问题
基因工程动物的出现引发 了关于动物权益、人道对 待和伦理准则的讨论。
动物基因工程
动物基因工程近年来，动物基因工程的发展取得了长足的进步，在生物芯片、转基因动物、多基因改良生物等多个领域取得了巨大成就，对于科学家来说是一个极具活力的研究领域。
动物基因工程实际上是一种通过人工干预，改变生物体特性和性状的技术，最初用于解决动物繁殖问题，并不断拓展应用，彻底改变了人类与动物之间的关系。
一方面，动物基因工程能在短时间内繁殖出性状一致的动物，从而大大提高生物群体的稳定性和良种的纯度，极大地满足了人类对于某些高品质或者医疗目的动物需求。
例如，高产奶牛是利用动物基因工程技术实现的，可以让牛群在短时间内大量增加，帮助人类更好地利用牛奶资源，获取更多的天然营养元素。
另一方面，通过动物基因工程我们也可以人工调整动物的基因，利用基因改造来改善动物的性状，让动物更适合于当地环境、更容易繁殖和更有价值，从而帮助人们更好地利用动物资源。
例如，野猪改良工程的成功利用了动物基因改造技术，使野猪体型健壮、抗病能力强，繁殖能力强，更易被人类利用，大大丰富了人类猪肉资源。
此外，动物基因工程技术在医学研究中也发挥了重要作用，例如通过转基因动物从而发现新的药物，为人类治疗疾病提供新的技术革命。
同时，动物基因工程也为人工繁殖野生动物提供了一条新途径，使处于绝种危险的动物得以通过基因重组、转基因等方式复苏，从而保护动物多样性。
虽然动物基因工程有着巨大的科学价值，但是也存在一些潜在的风险。
首先，当我们干预动物基因时，往往会改变人类和其他动物之间的物种关系，导致物种的不完整和不稳定，或者改变本地生物群落的结构，破坏自然环境的生态平衡，威胁生物多样性的安全。
其次，人为干预的出错也会带来一些风险，比如基因转移、治疗失败等，从而引发不可预料的后果。
因此，动物基因工程的发展需要在遵守法律法规的前提下，坚持科学安全原则，加强对产品的管理，避免污染环境，以及提高科学家们对由此带来的其他后果的认识。
只有这样，动物基因工程可以在不损害人类和动物健康的前提下，发挥其最大的价值，为保护野生动物种群、改善动物性状、促进医药健康发展等发挥积极作用。
第10章 动物基因工程
Northern杂交 Northern杂交
*
也称为Northern印迹（ 也称为Northern印迹（Northern Blot），用以检 Northern印迹 Blot）， ），用以检 测某一特定的RNA 通常是mRNA RNA（ mRNA） 测某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在 及表达量。 及表达量。 因与DNA的杂交（ 因与DNA的杂交（Southern 杂交）相对应，故被 DNA的杂交 杂交）相对应， 趣称为Northern杂交。 Northern杂交 趣称为Northern杂交。
RNA来源： RNA来源：新鲜组织或细胞 来源
2008·秋
动物遗传学
DNA提取方法：常规苯酚-氯仿方法、 DNA提取方法：常规苯酚-氯仿方法、试剂盒 提取方法
方法； 方法；
RNA提取： RNA提取：所用器皿和试剂必需经高温灭菌 提取
或DEPC处理 DEPC处理
Genome DNA
Total RNA
20） Library）
含一种生物体的全部基因组DNA 含一种生物体的全部基因组DNA片。 DNA序列。 序列
动物遗传学
* *
2008·秋
第二节
基因体外重组技术
2008·秋
动物遗传学
1 重组质粒构建
载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行 是指携带靶DNA DNA片段进入宿主细胞进行
扩增和表达的工具。 扩增和表达的工具。
质粒是指一种存在于细胞内能独立复制的染色体外的 DNA。 DNA。
2008·秋
动物遗传学
2008·秋
动物遗传学
文 库 构 建
3 PCR
PCR，即聚合酶链式反应或多聚酶链反应 PCR，即聚合酶链式反应或多聚酶链反应 Reaction） （Polymerase Chain Reaction）, 是一种对特定的 DNA片段在体外进行快速扩增的新方法 DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。 片段在体外进行快速扩增的新方法。
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(二)核酸外切酶III （三）核酸外切酶VII （四）DNA酶I （五）RNA酶A (牛胰) （六）RNA酶TI （七）RNA酶H
第三节基因工程的载体 （Vector）
• • • • • • • • • • • 到目前为止，用于基因工程的载体有8类： ① 细菌质粒载体；包括大肠杆菌和枯草杆菌质粒载体。 ② λ噬菌体衍生载体。 ③ 柯斯质粒(Cosmid)载体：一种由质粒和A噬菌体cos尾巴构建 的复合载体。 ④ 噬菌体M13衍生载体一类专门用于Sanger法测序的载体。 ⑤ Phag9m5d载体：一类由噬菌体功能片段和质粒构建的复合 载体。 ⑥ 酵母质粒载体：由酵母2u质粒构建的酵母基因工程载体。 ⑦ 真核病毒载体：包括动物病毒、植物病毒衍生载体。 ⑧ 杆状病毒和Bacmid载体；
瞬时转染 目的基因不整合进宿主基因组 稳定转染 目的基因整合进宿主基因组
第三节
转基因动物技术
一、转基因动物的概念 转基因技术是将外源DNA导入细胞的一种技 术。它是在DNA重组技术的基础上发展起来的。 1981 年 Gordon 和 Ruddle 首 次 用 显 微 注 射 法 (Microinjection)把外源基因导入小鼠受精卵的 雄核，并将注射后的受精卵植入假孕母鼠子宫， 产生了的78只小鼠，其中有2只的所有细胞中 (包括生殖细胞)都含有外源基因，但因缺乏启 动子而不能表达，他们把出生后带外源基因的 小鼠叫做转基因小鼠(Transgenic Mice)，自此 以后，凡带有外源基因的动物都叫做转基因动 物(Transgenic animal)。
六、转化细胞的筛选与鉴定
• 转化或转染的效率是很低的(一般为105～ 106)，也就是说，只有极少数细胞接受到 重组DNA分子，能实现基因的转移。所 以必须从大量的培养细胞中筛选出已被 外源DNA转化了的细胞，然后建立无性 繁殖系，使所需基因大量扩增和表达。
重组体的筛选 screening/selection 1. 直接选择法
三、DNA连接酶
在大肠杆菌和动物细胞中都发现了DNA连接酶，这种酶能够催 化DNA中相邻的 3’一OH和5’一磷酸基末端之间形成磷酸二酯键。 连接反应的最适温度是37℃，但在此温度下粘性末端之间氢键结 合很不稳定。实验表明，15℃对于连接反应和粘性末端氢键结合 的稳定性都是合适的。
四、甲基化酶
细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶(methylase) 米完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序。 甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护DNA不被限 制性内切酶切开。真核生物中目前只发现5甲基胞嘧啶(M5C)。
(五) 动物病毒
动物病毒作为载体可用于外源基因向真核细胞的 转入。作为基因介导的动物DNA载体，必须具备以下 条件：(1)具有动物病毒的复制起始部位及启动子，以 便外源基因能有效的转染动物细胞，以及提供必要的 转录信号：(2)具有可供选择的标志基因，因为重建的 病毒转染力很低，一般仅为105 ～107 ，只有利用标志 基因才能选出转化细胞株；(3)具有适当的多种单一内 切酶位点供外源基因插入。 目 前 常 用 的 基 因 转 移 载 体 有 ： (1) 猴 空 泡 病 毒 (Simian virus 40简称SV40)；(2)腺病毒(Adenovirus)； (3) 乳 头 状 病 毒 (Papilloma virus) ； (4) 逆 转 录 病 毒 (Retrovirus); (5) 牛痘(Vaccinia)病毒; (6) 牛疣病毒 (Bovine papilloma virus)等。
（三）柯斯质粒载体（Cosmid vector）
柯斯质粒载体又叫粘粒载体，这是 一种由人工构建的含有DNA的cos序列和 质粒复制子的特殊类型的质粒载体。柯 斯质粒在结构组成上具有噬菌体的特性、 也具有质粒载体的特性和高容量的克隆 能力，一般可插入35～4基因的克 隆。
一、质粒载体(plasmid vector)
（1）质粒的一般性质 1．质粒的概念 质粒是细菌细胞染色体外存在 于细胞质中能进行自我复制的一类小型DNA分 子，大部分质粒为双链环状。 2．质粒的大小 3．质粒的拷贝数 4．质粒的不亲和性 5．质粒的宿主范围
质粒—存在于细菌染色体外的小型环状双 链DNA分子 理想的质粒 1.拷贝数多; 2.两三个抗药性基因 terr ampr 筛选标志 3.合适的限制性内切酶酶切位点（单一）
三、获得目的基因的方法
(一)利用理化方法分离基因 理化方法分离基因是依据DNA双链结构 的特点和四种碱基互补的氢键差异，其 方法有以下四种： 1．密度梯度超速离心法 2．单链酶法 3．多聚赖氨酸法 4．分子杂交法
(二)利用生物学方法分离基因
利用噬菌体转染或质粒转化等微生物学技 术分离基因的方法，我们把它叫做生物学方法。 这种方法应用于原核基因的分离提取。 用 适 当 的 限 制 性 内 切 酶 (Restriction endonuclease )将整个染色体或DNA分子切成 许多相当于一个或略大于一个基因的片段，然 后把全部DNA片段与质粒组成重组DNA分子，并 转化到某特定基因营养缺陷型受体菌内，进行 纯系繁殖，再经分离鉴定，选出所需基因。
（四）YAC载体
YAC 是 酵 母 人 工 染 色 体 （ Yeast artificial chromosome）的缩写，是目前能容纳最大外源DNA片段 的载体。简单地说，酵母人工染色体载体有两个臂， 之间有着丝粒，每个臂的末端有一个端粒，另外，染 色体上还有供选择的标记基因；当外源DNA片段连接进 两个臂中以后，通过选择标记人们可以从酵母宿主细 胞中筛选出重组的人工染色体。 实验结果证明，每个YAC都可以装进100万碱基以上 的DNA片段，这种大小比柯斯质粒的装载能力要大数倍， 所以可以保证基因结构的完整性。
(三)基因的人工合成
1. 化学合成法 2. 逆转录法(Reverse transcription) 逆转录法也叫cDNA法，它是一种酶促合 成法，即以mRNA为模板，在反转录酶的 作用下，以四种脱氧核苷三磷酸为材料 合成DNA(cDNA)，再经复制后即成双链 DNA。 3. 聚合酶链式反应 (PCR)
• 基因克隆示意图
载体DNA (限制性内切酶切开) 目的基因
重组体
宿主细胞
已转化的宿主细胞
繁殖 阳性克隆株
表达
第二节 工具酶
常用的工具酶
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ 切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 探针标记、补平3′末端
反转录酶
多聚核苷酸激酶 末端转移酶
cDNA合成
5′磷酸化、探针标记 3′末端多聚尾
抗药性标志选择 标志补救 表达产物与营养缺陷互补 α—互补 蓝白斑筛选 分子杂交 探针 原位杂交 /Southern印迹法 限制性酶切图谱/PCR
2.非直接选择法 免疫学方法
七 克隆基因的表达 载体有转录、翻译的元件 密码子通用 1 、 原核表达体系 原核表达载体的标准 • 合适的筛选标志 • 强启动子 • 翻译控制序列 • 多克隆位点
融合蛋白 包涵体 大肠杆菌表达体系的不足 1. 缺乏转录后加工机制，只能表达 cDNA 2. 缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖 基化 3. 融合蛋白形成包涵体，复性后才有活 性 4. 很难表达大量的可容性蛋白
2 真核表达体系 筛选标志 Neor G418 转染方法
磷酸钙沉淀 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射
Eco RⅠ
Hind Ⅲ Bam HⅠ Sal Ⅰ
氨苄青霉素 抗性基因 Pst Ⅰ
pBR322
四环素 抗性基因
Ava Ⅰ
Ori
Pvu Ⅱ
（二）噬菌体载体( Phage vector)
噬菌体是一种温和噬菌体，由于它的遗 传结构和宿主大肠杆菌的遗传结构研究得比较 清楚，并能在细菌中大量繁殖，所以成为广泛 采用的载体。噬菌体还有一大优点，即使它 的DNA丢失25％仍不失活，这部分丢失的空档 正好可以装载外源DNA。 • 与质粒载体相比，λ 噬菌体作为载体可以克隆 更大一些的DNA片段，欲构件一个基因， 往往可以减少中克隆的数量。
二、转基因动物技术的一般步骤
(1)选择能有效表达的蛋白质； (2)克隆与分离编码这些蛋白质的基因； (3)选择能与所需组织特异性表达方式相适应的基 因调节序列； (4)把调节序列与结构基因重组拼接，并在培养细 胞或小鼠中预先检验其表达情况； (5)把拼接的基因注射到受精卵的细胞核中； (6)把注射后的受精卵移植到子宫，完成胚胎发 (7) 检测幼畜是否整合外源基因、外源基因的表达 情况以及外源基因在其后代中的传递情况。
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
限制性核酸内切酶 细菌限制修饰体系 限制性核酸内切酶 甲基化酶 识别特异的位点—酶切位点 Eco RⅠ 回文结构 4～6 bp GAATTC 出现两种末端 CTTAAG 粘性末端 粘端 Smal Ⅰ 平头末端 平端 CCCGGG 配伍末端 GGGCCC
二、DNA聚合酶
（一）DNA聚合酶I (全酶) (E. coli DNA Polymease) （二）K1enow片段(E.co1i) （三）T4 DNA聚合酶 (T4噬茵体感染的E．co1i) （四）Taq DNA聚合酶(Thermusaqraticus) （五）逆转录酶（reverse transcriptase） （六）末端转移酶
第七章 动物基因工程
第一节 基因工程概述
基因工程(Genetic engineering)是一种DNA重组技术，它 是在分子水平上进行的遗传操作，即把供体细胞中的 基因或基因组提取出来，按照预先设计的蓝图，经过 体外加工重组，或者把人工合成的基因转移到受体细 胞并获得新的遗传特性的技术。由于被转移的基因必 须与载体DNA重组后才能实现转移，所以基因工程也 叫做重组DNA技术。 基因工程的基本操作程序包括：(1) 目的基因的分离或合 成；(2)用工具酶对目的基因和载体（Vector）进行加 工处理，把目的基因与载体结合成重组DNA分子；(3) 把重组DNA分子引入受体细胞，并使目的基因和载体 上其他基因得以表达；（4）转化体细胞的扩增；（5） 重组体细胞的鉴定与筛选。