第三章 微生物生态学基本研究方法

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1、经典技术和方法——培养研究

优点：能对活的微生物进行计数，并能区分真 菌、放线菌和细菌 缺点：可培养率很低<1%; 单菌落是否由一个 细菌繁殖而来；丝状微生物菌落究竟是由孢子 而来还是由菌丝而来难以区分
Hep G2 Cells Stained Using the LIVE/DEAD® Cell Imaging Kit, showing green-fluorescent live cells and redfluorescent dead cells.
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FISH技术
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细胞膜磷脂双分子层
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毛细管柱
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Watzinger et al.,2008,Soil Biology & Biochemistry 40 (2008) 751–762
Typical GC-FID signal of extracted PLFAs under (a) landfill gas ddition (W+LG) and (b) the control treatment (W, grey colour in the enlargement) in 20 cm soil depth. (1) i14:0, (2) 14:0, (3) i15:0, (4) a15:0, (5) 15:0, (6) i16:0, (7) 16:1o8c, (8) 16:1o7c, (9) 16:1o6c, (10) 16:1o5c, (11) 16:0, (12) 10Me16:0, (13) i17:0, (14) a17:0, (15) 17:1o8c, (16) cy17:0, (17) 17:0, (18) 10Me17:0, (19) 18:2o6,9, (20) 18:1o9c, (21) 36 2016/5/23 18:1o8c, (22) 18:1o7c, (23) 18:0, (24) cy19:0, (IS) internal standard 19:0.
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（1）基内菌丝与培养基结合紧密，不易挑起； （2）菌落边缘有辐射的菌丝，称为辐射状菌丝； （3）生长后期表面形成紧密的绒毛状或坚实、干燥、 不透明、多皱的表面，上面常有一层色彩鲜艳的干粉； （4）可形成絮状或颗粒状的典型菌落，菌落的正反面 颜色往往不一致，菌落边缘培养基的平面有变形现象； （5）有特殊气味（土霉气味）等。

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经典的观察和培养方法能够在一定程度上告诉我们 样品中微生物的数量、可培养微生物的数量及类型。 但这些结果不能告诉我们微生物在样品中能干什么？

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包括用于微生物生物量测定的氯仿熏蒸方法、底物 诱导呼吸法和光合微生物色素法等； 用于测定土壤C矿化速率和微生物呼吸强度等方法； 用于测定土壤中物质转化的生物活性和酶活性的分 析方法； 测定微生物能量代谢的分析方法等
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培养时间 (h)
浅层含水层沉积物中微生物群落培养过程中AWCD的变化
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赵锐等，2010
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赵锐等，2010
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赵锐等，2010
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磷脂类化合物只存在于细胞膜中，不同微生物其磷 脂脂肪酸组成和含量都不相同。 一旦生物细胞死亡，其中的磷脂化合物马上降解。 因此该方法十分适合于微生物群落的动态监测。
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稳定性同位素探针( stable isotope probing ,简称SIP) 要先将标记 的底物13C(或15N) 添加到系统中,然后再提取微生物群落DNA，用 梯度离心法把重的DNA (被13C或15N 标记) 和轻的DNA (未被13C 或15N 标记) 分开。用群落DNA 分析方法分别对重DNA 和轻DNA 进行分析,可以了解活性和非活性微生物群落,从而知道哪些微生物 在起作用。 SIP 技术非常明显的优点是可以明确群落中实际起作用的微生物,但 也有一些缺点。如不易检测数量很少但活性很高的微生物的活性; 鉴于DNA中要求N 的含量相对较低，SIP 技术比较适合研究与碳 素转化有关的活性微生物群落。
Archaea in the picture in red, sulfate reducing Bacteria in green. Credit: Annelie Pernthaler/UFZ
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1、经典技术和方法——培养研究


对采集的样品进行稀释、培养
辨认培养物的种类
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3、分子生物学方法
◦ 基于PCR的指纹图谱分析
DGGE/TGGE
单链构象多态性分析（SSCP）技术 RAPD (random amplified polymorphic DNA) 技术 限制性片段多态性（RFLP: restriction fragment length polymorphism）/扩增性cDNA限制性酶切片段分析（ARDRA: amplified ribosomal DNA restriction analysis ） 末端限制性片段长度多态性（T-RFLP) 核糖体基因间隔序列分析（RISA: ribosomal intergenic spacer analysis）/自动核糖体基因间隔序列分析（ARISA） 扩增片段长度多态性（AFLP） 高度重复序列或微卫星区域
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1、经典技术和方法——直接观察测定

利用显微镜对样品中的微生物直接观察
计算数目，测定丝状微生物长度（普通染色、荧光 染色）
优点：直接观察天然样品中微生物的形态和微生物 所处的位置 缺点：样品量少，代表性差


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HeLa cells showing negative staining by ICC/IF using only secondary antibody. The cells were 100% methanol fixed (5 min) and then incubated in 1%BSA / 10% normal goat serum / 0.3M glycine in 0.1% PBS-Tween for 1h to permeabilise the cells and block nonspecific protein-protein interactions. The secondary antibody (red) was ab150091 Alexa Fluor® 647 goat anti-rabbit IgG (Fc) used at 2µ g/ml for 1h. DAPI was used to stain the cell nuclei (blue) at a concentration of 1.43µ M.
3、分子生物学
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3、分子生物学方法
◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ (G+C)摩尔百分含量 核酸探针杂交技术 DNA-DNA杂交 DNA序列分析 基因芯片 宏基因组学 基于PCR的指纹图谱分析
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周继中 Oklahoma
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什么是微生物生态学？ 微生物生态学的研究方法有哪些？ 每种方法的优缺点是什么？举例说明
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氨氧化 NH3+→NO2- →NO3- 硝化作用 amoA（功能基因） 氨氧化细菌（AOB）, 氨氧化古菌（AOA）
土壤呼吸测定仪
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代谢活力研究 优点：能确定样品中微生物能做什么； 缺点：无法说明样品究竟是哪些微生物 在起作用，样品存在哪些微生物种类和 微生物在自然样品中的分布情况

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Biolog微平板法 PLFA图谱分析
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Biolog 微生物自动分析系统是美国Biolog 公司从 1989 年开始推出的一套微生物鉴定系统，最早进入 商品化应用的是G-好氧细菌鉴定数据库(GN) ,其后陆 续推出G+好氧细菌( GP) 、酵母菌( YT) 、厌氧细菌 (AN) 和丝状真菌(FF) 鉴定数据库。 Biolog 系统6101 版数据库共包括1973 种微生物， 其中细菌234 个属，1 226 个种，与其他鉴定系统 相比，其微生物种类的数据量较大，适合于环境、食 品、工业、临床和动植物病原菌的鉴定分析。
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Biolog 自动微生物分析系统主要根据细菌对糖、醇、 酸、酯、胺和大分子聚合物等95 种碳源的利用情况 进行鉴定。 细菌利用碳源进行呼吸时,会将四唑类氧化还原染色 剂( TV) 从无色还原成紫色，从而在鉴定微平板上形 成该菌株特征性的反应模式或“指纹图谱”。 通过纤维光学读取设备——读数仪来读取颜色变化, 由计算机通过概率最大模拟法将该反应模式或“指纹 图谱”与数据库相比较，将目标菌株与数据库相关菌 株的特征数据进行比对，获得最大限度的匹配,可以 在瞬间得到鉴定结果，确定所分析的菌株的属名或种 名。
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BIOLOG ECO微平板
含3组相同的碳源，根据平均颜色变化情况，计算 微生物群落的多样性指数、代谢特征的变化等。
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四氯唑染料
96孔微孔板
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1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
0 mg/kg DBP 96 mg/kg DBP 200 mg/kg DBP 400 mg/kg DBP 796 mg/kg DBP
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微生物生态学？
研究微生物与其周围生物和非生物环境之间相 互关系的一门学科
关注的内容：主要研究微生物的分布、种群组成、 数量和活力等与环境的关系，以及微生物之间、 微生物与高等有机体之间的相互关系。
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1、经典技术和方法 直接观察测定 培养研究 2、生理生化方法 3、分子生物学方法 4、稳定同位素方法
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代谢活力研究：放射性/稳定 同位素标记记某种代谢物， 测定代谢活力
◦ C14， C13， H3， N15

酶活性测定
ATP含量测定：ATP仅存在 于活的细胞中，且在细胞中 的含量基本一致
ATP检测仪
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代谢活力研究

叶绿素含量测定：估计藻 类和光合细菌的生物量和 代谢活力 土壤呼吸速率测定：间接 估计土壤中的生物量，不 适于仅有厌氧呼吸或发酵 的微生物测定
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陈声明，林海萍，张立钦主编，微生物生态学导论， 高等教育出版社，2007 池振明主编，2005，现代微生物生态学，科学出版社 杨家新主编，2004，微生物生态学，化学工业出版社 宋福强主编，2008，化学工业出版社 张素琴著：2005， 科学出版社 Molecular Microbial Ecology, A. Mark Osborn & Cindy J. Smith, Taylor & Francis Group, 2005

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Microbial Ecology Applied and environmental microbiology Advances in microbial ecology ISME Journal Applied Microbiology and Biotechnology FEMS Microbiology Ecology Frontiers in Microbiology Geomicrobiology Journal Nature Microbiology Review