蛋白质免疫印迹技术

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蛋白质免疫印迹技术

蛋白质免疫印迹技术
与基因测序技术结合
将蛋白质免疫印迹技术与基因测序技术相结合,有助于解析基因表达与蛋白质功能之间的关联,为精准医学和个性化 治疗提供有力支持。
与单细胞测序技术结合
通过将蛋白质免疫印迹技术与单细胞测序技术相结合,可以在单细胞水平上研究蛋白质的表达和功能, 揭示细胞异质性和疾病发生发展机制。
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改进方向
优化样品处理方法 简化样品制备过程,提高处理效 率,降低对实验技能的要求。
提高检测灵敏度和特异性 通过改进技术和方法,提高蛋白 质免疫印迹技术的检测灵敏度和 特异性,进一步减少背景干扰和 假阳性结果。
缩短实验周期 通过改进技术和方法,减少实验 步骤和时间,提高实验效率。
降低成本 寻找更经济实惠的抗体、显影剂 和其他试剂,降低实验成本。
研发自动化、智能化的蛋白质免 疫印迹系统,简化操作流程,减 少人为误差,提高实验效率和准 确性。
定量分析能力
发展蛋白质免疫印迹技术的定量 分析能力,实现蛋白质表达水平 的准确测量,为深入研究生物过 程和疾病机制提供有力支持。
应用领域的拓展
临床诊断
将蛋白质免疫印迹技术应用于临床诊断,为疾病诊断、病情监测和 预后评估提供可靠的蛋白质标志物检测手段。
转膜
选择合适的转移膜
根据实验需求,选择适当的转移 膜,如硝酸纤维素膜或聚偏二氟
乙烯膜。
预处理转移膜
将转移膜在缓冲液中浸泡,使其充 分湿润。
转膜
将凝胶上的蛋白质条带转移到预处 理的转移膜上,完成转膜过程。
抗体孵育与显色
01
一抗孵育
将特异性抗体与转印到膜上的蛋 白质进行孵育,使抗体与目标蛋 白质结合。
原理
基于抗原-抗体反应的特异性,通过将蛋白质样品电泳分离后转印至固相支持物 上,再与特异性抗体进行反应,通过显色反应检测目标蛋白质的存在、表达量 及修饰状态等信息。

蛋白质免疫印迹技术

蛋白质免疫印迹技术

2
特异性
该技术能够高度特异性地识别并检测目标蛋白,即使在复杂的生物样品中也不会产生交叉反应。
3
检测限
得益于优化的实验步骤和灵敏的检测方法,免疫印迹技术的检测限可达到皮克摩尔级别,能够灵敏检测极微量的目标蛋白。
4
重复性
该技术具有良好的实验重复性,可以准确定量并复制实验结果,为蛋白质研究提供可靠的数据支持。
蛋白质定量分析
可以利用Western blot结果对特定蛋白的相对含量进行定量分析,为进一步的生物学研究提供数据支持。
结果可视化展示
Western blot采用化学发光检测,可以清晰地显示蛋白条带,结合分子量标准进行数据分析和解读。
实验数据处理
数据分析
实验结果的数据处理通常包括绘制图表、统计分析和计算参数。数据分析可以揭示实验结果的趋势和特点,为后续的实验设计和结果解释提供依据。
技术改进方向
提高灵敏度
通过优化实验条件和试剂配方,不断提高免疫印迹技术的检测敏感度,以更准确地识别低丰度蛋白。
增强特异性
开发高特异性的抗体,减少非特异性结合,提升识别目标蛋白的准确性。
自动化集成
将实验流程进行自动化处理,实现样品预处理、电泳、转膜、免疫反应等步骤的高度整合,提高操作效率。
数据分析优化
2
结果解释和分析
对实验结果进行深入分析,阐述结果的意义和影响,讨论可能的影响因素。提出合理的解释和推论。
3
图表展示质量
使用恰当的图表、图像等辅助手段,直观、生动地展示实验结果。确保图表制作规范,便于理解和分析。
4
结论和建议
根据实验结果提出明确的结论,并提出后续研究或应用的建议,为后续工作提供参考。
实验设备

免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明

免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明

免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹(Western Blotting,简称WB)是一种常用的分子生物学技术,主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。

下面将详细介绍WB实验的具体步骤。

1.细胞裂解和蛋白质提取:首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集,并添加适量的裂解缓冲液。

使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱,使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。

再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。

2.蛋白质浓度测定:根据实验需要,采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度,以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。

3.蛋白质电泳:将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中,进行电泳。

电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移,分子量小的蛋白质迁移速度较快,分子量大的较慢。

电泳结束后,将凝胶转移到膜上。

4.膜上瞬时染色:在转移至膜上后,可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法,以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。

5.阻断:在膜上的蛋白质检测之前,需要对膜进行阻断处理,以防止非特异性结合。

常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液,进行阻断。

6.一抗反应:加入已稀释好的一抗抗体,与目标蛋白质特异性结合。

一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。

7.清洗:一抗反应后,用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗,以去除未结合的一抗抗体。

8.二抗反应:9.清洗:二抗反应后,用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗,以去除未结合的二抗抗体。

10.显色和成像:使用显色剂(如ECL)使膜上的蛋白质发生化学发光反应,然后将膜放入X射线片中,进行曝光。

最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。

11.数据分析:使用专业的成像软件分析成像结果,计算蛋白质的相对表达水平,并与内参蛋白进行比较。

需要注意的是,在进行WB实验的过程中,要严格操作,避免污染和交叉反应的出现。

同时,应根据实验需求选择适当的试剂和抗体,并进行标记、保存和储存等操作。

免疫印迹法原理

免疫印迹法原理

免疫印迹法原理免疫印迹法(immunoblotting)是一种用于检测特定蛋白质的方法,它是通过将待检测蛋白质与特异性抗体结合,然后通过电泳分离蛋白质,并将其转移到固体支持物上进行检测的技术。

这项技术在生物化学和分子生物学研究中得到了广泛的应用,尤其在检测蛋白质表达和定量方面具有重要意义。

免疫印迹法的原理基于免疫学和生物化学的知识,其步骤主要包括制备蛋白质样品、SDS-PAGE电泳分离、转膜、孵育抗体、显色和定量分析等。

首先,待检测的蛋白质样品需要经过裂解和处理,以保持其天然的构象和功能。

然后,蛋白质样品经过SDS-PAGE电泳分离,根据蛋白质的大小和电荷进行分离。

接下来,将分离后的蛋白质转移到固体支持物上,通常是通过电泳转膜或吸附法进行。

转膜完成后,需要将固相支持物进行孵育,以结合特异性的一抗和二抗。

一抗与待检测蛋白质特异性结合,而二抗与一抗结合的部位标记有酶或荧光素,用于检测和定量。

在显色步骤中,通过酶标记或荧光素标记的二抗,可以将待检测蛋白质显示出来,并且可以通过光密度仪或成像系统进行定量分析。

免疫印迹法的结果通常以蛋白质的相对分子质量和表达水平呈现,可以用于比较不同条件下蛋白质的表达差异,或者用于验证特定蛋白质的存在和表达水平。

免疫印迹法的优点在于其高灵敏度和特异性,可以检测低表达水平的蛋白质,同时也能够识别不同大小和电荷的蛋白质。

此外,该技术还可以用于检测蛋白质的修饰状态,如磷酸化、甲基化等。

然而,免疫印迹法也存在一些局限性,如对蛋白质的结构和构象要求较高,同时也需要特异性抗体的选择和优化。

总的来说,免疫印迹法是一种重要的蛋白质检测和定量方法,其原理简单清晰,操作相对容易,同时具有高灵敏度和特异性,因此在生物医学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。

随着生物技术的不断发展,免疫印迹法也在不断地完善和改进,为科研工作者提供了更多的选择和可能性。

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。

收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白(根据蛋白分子的大小,煮沸时间可适当变化,一般不低于5min。

煮沸只是变性蛋白,而不是分解,一般加了抑制酶不会分解。

煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的,只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。

蛋白样品变性后与SDS充分结合,SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的,100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳)。

(3)电泳i.清洗玻璃板:一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

ii.灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

(操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶。

)(2)配10%分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时,可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可。

免疫印迹怎么测定磷酸化的蛋白

免疫印迹怎么测定磷酸化的蛋白

免疫印迹怎么测定磷酸化的蛋白免疫印迹(Western blot,WB)是利用抗原抗体特异性结合的原理,基于SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白质分离、纯化以及相互作用研究的技术,也是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法。

蛋白印迹技术先利用SDS-PAGE分离蛋白质样品,随后将电泳条带转移到固相载体膜上(如PVDF或尼龙膜),再利用磷酸化特异的抗体(一抗)来鉴定目的蛋白,能与磷酸化特异抗体结合的蛋白质即为磷酸化蛋白,最后通过标记的二抗识别一抗可以指示一抗的位置,即是待研究的磷酸化蛋白质的位置。

免疫印迹法不适用放射性32P标记,避免了使用放射性同位素时的危险品和废物处理。

此外,磷酸化抗体的灵敏性较强,可以轻松的检测常规细胞提取物中的磷酸化蛋白,对样品的用量要求不算严格。

WB除了能定性检测磷酸化蛋白外,还能一定程度上评估磷酸化蛋白质的水平,由于受到不同实验处理和凝集上样误差的影响,通常先用一个抗体来检测同源蛋白的总水平(而不考虑磷酸化状态),以确定磷酸化组分相对于总组分的比例,并充当上样内对照。

百泰派克生物科技拥有纯熟的免疫印迹技术,专业的技术分析团队,为您提供一站式磷酸化蛋白免疫印迹鉴定服务,可以根据您的需求定制实验,并对可能影响结果的潜在因素进行评估。

我们承诺给出的数据可靠,且可重复性高。

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相关服务:Far-Western Blot分析。

翻译后修饰蛋白组分析。

磷酸化定量蛋白组学研究。

免疫共沉淀法(CO-IP)结合质谱联用的蛋白互作分析。

蛋白质相互作用分析。

蛋白质相互作用质谱分析。

SILAC与免疫共沉淀质谱联用的蛋白互作分析。

交联法蛋白相互作用分析。

标记转移法蛋白相互作用分析。

Pull-down靶蛋白质谱鉴定。

蛋白质免疫印迹法原理

蛋白质免疫印迹法原理

蛋白质免疫印迹法原理
蛋白质免疫印迹法(Western Blot)是一种常用于检测蛋白质的方法。

其原理基于蛋白质电泳分离和特定抗体与目标蛋白质的特异性结合。

1. 样品制备:首先,待检样品经过蛋白质提取,然后经过电泳分离,通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将样品中的蛋白质根据其分子量大小分离。

2. 蛋白转膜:随后,将分离得到的蛋白质通过电泳转印到聚合物(如聚偏氟乙烯)膜上,形成蛋白质膜。

3. 阻断:将膜置于含有蛋白质阻断剂(如牛血清白蛋白)的缓冲液中,阻止非特异性结合。

4. 抗体结合:将膜与特异性抗体一起孵育,抗体与目标蛋白质特异性结合。

这些抗体通常是经过免疫动物制备,针对目标蛋白质的特定抗原位点。

5. 靶蛋白检测:使用荧光标记或酶标记的二抗(即与第一抗体结合的抗体)与第一抗体结合。

这些二抗能够使特定结合的蛋白质与检测标记发生反应。

6. 信号检测:使用荧光标记物或底物,通过荧光检测或发色反应检测结合的蛋白质。

常用方法是使用化学发光底物,比如辣根过氧化物酶和酮硫磺胺基碳酸红等底物。

通过这个原理,蛋白质免疫印迹法可以提供关于特定蛋白质的存在、相对丰度以及蛋白质分子量等信息。

它在分子生物学和生物医学研究中被广泛应用于蛋白质分析和诊断。

蛋白质免疫印迹的原理

蛋白质免疫印迹的原理

蛋白质免疫印迹的原理蛋白质免疫印迹是一种常用的实验技术,用于检测特定蛋白质在混合物中的存在并确定其分子量。

该技术基于蛋白质与特异性抗体之间的特异性结合原理,通过将抗体与蛋白质结合,然后使用特定的检测方法来观察和分析蛋白质的存在与性质。

蛋白质免疫印迹技术需要获取感兴趣的蛋白质样本。

这些样本可以来自细胞、组织、血清等。

通常,需要先对样本进行蛋白质提取和纯化,以获得高质量的蛋白质样本。

接下来,将蛋白质样本进行电泳分离。

常用的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和聚丙烯酰胺凝胶电泳法(2-DE)。

通过电泳分离,可以将蛋白质样本按照其分子量和电荷大小进行分离。

分离完成后,将电泳胶中的蛋白质转移到固定膜上。

这通常通过半湿式或干式转移的方法实现。

在半湿式转移中,将电泳胶和膜以间隔层叠放置,通过电流将蛋白质从胶体转移到膜上。

在干式转移中,将电泳胶和膜分开,使用特定的设备将蛋白质转移到膜上。

转移完成后,膜上的蛋白质被固定在膜上,形成蛋白质膜。

为了防止非特异性结合,膜上的蛋白质被处理成一定的条件,如用乙酸酐等进行酰化处理。

这样可以增加膜上蛋白质与抗体之间的特异性结合。

接下来,将蛋白质膜进行免疫染色。

首先,在蛋白质膜上加入特异性抗体。

这些抗体与目标蛋白质结合,形成抗原-抗体复合物。

然后,用荧光标记的或酶标记的二抗与抗原-抗体复合物结合。

这些二抗可以识别并结合一定类型的抗体,从而实现对蛋白质的检测和定量。

使用相应的检测方法观察和分析蛋白质的存在与性质。

常用的检测方法包括荧光成像、放射免疫测定和酶联免疫测定。

这些方法可以通过测量光信号、放射性信号或酶反应产物的生成来确定目标蛋白质的存在与性质。

总结起来,蛋白质免疫印迹技术是一种基于蛋白质与特异性抗体之间的特异性结合原理的实验技术。

通过将抗体与蛋白质结合,然后使用特定的检测方法来观察和分析蛋白质的存在与性质。

这项技术在生物医学研究和临床诊断中被广泛应用,对于研究蛋白质功能和疾病机制具有重要意义。

蛋白质免疫印迹实验

蛋白质免疫印迹实验

蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)蛋白质免疫印迹(Western Blot)实验原理蛋白质免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的一种蛋白质检测方法。

对已知的表达蛋白,可以用相应的抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可以融合部分的已知片段进行检测,如HA-tag,Flag-tag,c-myc-tag等。

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳,被检测的是蛋白质,其中检测探针是相应的抗体,显色是使用的标记后的二抗。

经过PAGE凝胶分离的蛋白质样品,转移到固相载体上,如醋酸纤维素膜,固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质。

然后以固相载体上的蛋白质作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,然后再与标记后的二抗起反应,经过底物显色以检测目的蛋白。

蛋白质免疫印迹(Western Blot)原理蛋白免疫印迹法主要分为三个阶段进行第一阶段是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在这个阶段,经过变性处理的蛋白质样品经SDS处理后会带上阴性电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中在电场的作用下从阴极向阳极泳动,且分子量越小,泳动速度就越快。

所以在此阶段,根据蛋白的泳动速度可以将样品中的蛋白质根据其分子量的大小进行分离,此阶段分离效果肉眼不可见。

如果想观察蛋白的电泳情况,可以在电泳完成后进行考马斯亮蓝染色进行观察;第二阶段为电转移,又称为转膜。

即将在凝胶中已经分离的蛋白质条带通过电场的作用转移至硝酸纤维素膜上, 一般选用恒流300 mA,通电90 min即可将凝胶中的蛋白条带转移到醋酸纤维素膜载体上。

转移到载体上的蛋白条带也是肉眼不可见的,如果想观察转移的效果,可以在转移后对载体进行丽春红染液染色。

第三阶段为酶联免疫显色检测将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使目的条带蛋白显色。

免疫印迹wb的原理

免疫印迹wb的原理

免疫印迹wb的原理免疫印迹(Western Blotting,简称WB)是一种常用的蛋白质分析技术,广泛应用于生命科学研究领域。

它可以用来检测特定蛋白质在复杂的混合物中的存在与表达水平,具有高灵敏度和高特异性的优势。

免疫印迹的原理基于蛋白质的分子量、电荷和亲和性等特性。

首先,需要将待分析的蛋白质样品经过SDS-PAGE电泳进行分离,将蛋白质按照分子量大小分成不同的带状条带。

然后,将蛋白质从凝胶转移到聚合物膜(通常为聚偏氟乙烯膜)上,这个步骤称为电转移。

电转移过程中,蛋白质会被定向转移到膜上,形成与凝胶上相对应的蛋白质条带。

接下来,进行与待检测蛋白质特异性结合的抗体处理。

将膜浸泡在含有特异性一抗的抗体溶液中,一抗与待检测蛋白质结合形成免疫复合物。

为了增强对抗体-蛋白质复合物的检测灵敏度,通常需要进行洗涤步骤,以去除未结合的抗体和其他非特异性结合的物质。

然后,加入与第一抗体结合的二抗,这个二抗通常是与酶结合的二抗。

这种酶可以与染色底物发生反应,产生明显的信号。

这一步骤被称为二抗结合。

经过洗涤去除未结合的二抗后,加入染色底物,底物与酶发生反应后会生成可见的信号,形成蛋白质检测结果。

这种信号可以通过暗室或者专用的设备进行可视化,并进行定量分析。

免疫印迹技术的优点在于其高度特异性和高灵敏度。

通过使用特异性抗体,可以准确地检测目标蛋白质的存在与表达水平。

此外,免疫印迹还可以同时检测多个蛋白质,通过在膜上分别施加不同的抗体可以同时检测多个目标蛋白质。

然而,免疫印迹也存在一些限制。

首先,免疫印迹需要特异性抗体来检测目标蛋白质,这对于一些没有合适抗体的蛋白质来说是一个挑战。

其次,免疫印迹需要较长的实验时间,从样品制备到最终结果的获取需要几天时间。

此外,免疫印迹对于蛋白质分子量较大的蛋白质检测效果较差。

总结起来,免疫印迹是一种常用的蛋白质分析技术,通过将蛋白质从凝胶转移到膜上,并使用特异性抗体进行检测,可以准确地检测目标蛋白质的存在与表达水平。

蛋白质免疫印迹(WesternBlot,WB)实验方法原理步骤及注意事项

蛋白质免疫印迹(WesternBlot,WB)实验方法原理步骤及注意事项

蛋⽩质免疫印迹(WesternBlot,WB)实验⽅法原理步骤及注意事项实验⽅法原理Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋⽩质转移到膜上,然后利⽤抗体进⾏检测的⽅法。

对已知表达蛋⽩,可⽤相应抗体作为⼀抗进⾏检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交⽅法类似,但Western Blot采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋⽩质,“探针”是抗体,“显⾊”⽤标记的⼆抗。

经过PAGE分离的蛋⽩质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质,且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。

以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应,经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。

该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。

实验材料蛋⽩质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基⼄醇ddH2O⽢氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰⼄酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离⼼机离⼼管硝酸纤维素膜匀浆器剪⼑移液枪刮棒实验步骤⼀、试剂准备1. SDS-PAGE试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液:1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml;10%SDS 6.0 ml;β-巯基⼄醇 0.2 ml;ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液:⽢氨酸 2.9 g;Tris 5.8 g;SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH2O定容⾄1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4):NaCl 8.0 g;KCl 0.2 g;Na2HPO4 1.44 g;KH2PO4 0.24 g;加ddH2O⾄1000 ml。

5. 膜染⾊液:考马斯亮兰 0.2 g;甲醇80 ml;⼄酸2 ml;ddH2O118 ml。

蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB )

蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB )

蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB )标签:western-blot免疫印迹 蛋白质蛋白质免疫印迹可应用于:(1)从蛋白质混合物中检出目标蛋白质;(2)定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况;(3)用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。

实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒裂解液 PBS SDS上样缓冲液 电泳缓冲液 转移缓冲液 丽春红染液 TBST TBS 洗脱抗体缓冲液 抗体仪器、耗材电泳仪移液器脱色摇床显影仪实验方法原理Western免疫印迹,是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。

对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,探针是抗体,显色用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液:1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml;10%SDS 6.0 ml;β-巯基乙醇 0.2 ml;ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液:甘氨酸 2.9 g;Tris 5.8 g;SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4):NaCl 8.0 g;KCl 0.2 g;Na2HPO4 1.44 g;KH2PO40.24 g;加ddH2O至1000 ml。

蛋白质印迹技术

蛋白质印迹技术

蛋白质印迹技术蛋白质印迹(Western blotting)是一种检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫化学办法,又称免疫印迹(immunoblotting )。

1979年,Towbin等将分析DNA的Southern blotting技术扩展到蛋白质的讨论领域,并且和特异、敏捷的免疫分析技术相结合,称之为“Western blotting"(蛋白质印迹)。

免疫印迹可分为两个步骤:将蛋白质由凝胶转移至固相基质上;特异性抗体检测。

试验原理蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后,分别为不同的条带,其中含有能与特异性抗体相结合的待检测的蛋白质(抗原蛋白),将凝胶上的蛋白质以电转印的方式,转印至固相支持物(如硝酸纤维素膜,NC膜)上,再用特异抗体作为探针对靶蛋白举行检测的办法。

因为该办法结合了PAGE的高辨别率和固相免疫反应的高特异性等多种优点,可检测到低至1-5 ng的中等分子量大小的靶蛋白。

仪器和材料电转移装置(电源);摇床;暗匣;转印夹;浅盘(30cm×15cm×3cm);玻璃棒;杂交袋或杂交盒;胶片;保鲜膜;滤纸;0. 22μm孔径的硝酸纤维素膜。

试剂 (1) Running Buffer (Tris-甘氨酸电泳缓冲液,1×2500ml) ; 25 mmol/L Tris 7. 55g 250mmol/L甘氨酸 47. 0g 10%SDS 25m1 (2) Transfer Buffer ( Tris-甘氨酸电转膜缓冲液,1× 2500m1,pH=8.3):48 mmol/L Tris 14. 50g 39mmol/L 甘氨酸 7. 25g 10% SDS 9. 25ml 20%甲醇 500m1 (3) TTBS缓冲液(pH 7.5,2 ×2500ml): 20 mmol/L Tris 12. l l g 0. 5 M NaCl 146. 1 g 0.05%Tween 20 2. 5 ml (4) Stripping Buffer(pH2. 0,1000m1):甘氨酸 1. 8768 SDS 10. 0g (5) 10%牛奶封闭液:称取10. 0g脱脂奶粉,溶于80m1 TTBS(pH7.5 )中,搅拌彻低溶解,后加入TTBS定容至100m1,再加入10μl Thimerosal混匀。

蛋白质免疫印迹

蛋白质免疫印迹

蛋白质免疫印迹(Western Blot ,WB )标签: western-blot 免疫印迹 蛋白质蛋白质免疫印迹(Western Blot )可以:(1)从蛋白质混合物中检出目标蛋白质;(2)定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况;(3)用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA 、蛋白质-RNA 相互作用后续分析。

实验方法∙底物化学发光ECL 法∙ Western 印迹法∙ 图解 实验方法原理 Western 免疫印迹(Western Blot )是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。

对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。

与Southern 或Northern 杂交方法类似,但Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。

经过PAGE 分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒 丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB 试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤 一、试剂准备1. SDS-PAGE 试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液:1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml ;10%SDS 6.0 ml ;β-巯基乙醇 0.2 ml ;ddH 2O 2.8 ml 。

免疫印迹检测方法

免疫印迹检测方法

免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法,又称蛋白质印迹或Western Blotting,是一种利用抗
原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。

以下是其基本步骤:
1. 取样:取上清液作为样品。

2. 电泳:制备电泳凝胶,进行SDS-PAGE。

3. 转移:通过半干式转移,将电泳后的凝胶上的蛋白质转移到膜上。

这个过程包括割胶、平衡、膜处理、转膜等步骤。

其中,转膜是关键步骤,需要将凝胶上的蛋白质精确转移到NC膜上,滤纸、凝胶、NC膜需要精确对齐,
去除气泡,并在恒流1mA/cm2下转移小时。

4. 免疫检测:在转移后的膜上,利用抗体进行检测。

这一步通常包括一抗和二抗的结合,以及通过化学发光检测或其他方法检测到结合的抗体。

5. 结果分析:通过对比染色结果和标准条带,可以分析出样品中特定蛋白质的表达情况。

此外,阴性对照是以1%BSA取代一抗,其余步骤与实验组相同。

以上信息仅供参考,具体步骤可能会根据实验需求和条件有所不同,建议咨询专业人士获取具体信息。

蛋白质免疫印迹技术(共62张PPT)

蛋白质免疫印迹技术(共62张PPT)
制备。
一般实验室采用的抗体,多用兔和羊制备,因动物反应良 好,而且能够提供足够数量的血清。
(三)抗原
抗原是多种多样的,就其化学成分而言,有蛋白质抗原、 类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。
为了获得较好的抗血清,最好是选用蛋白质抗原。 不同的抗原,其免疫原性的强弱均不相同,这种免
疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、 立体结构等。
收集的血液置于室温下1h左右,凝固后,置4℃下,过夜(切勿冰冻)析出血清,离心,4000rpm,10min。
1)菠萝蛋白酶以0.
半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合反应。
(二)用于免疫的动物
由于动物的遗传性不同,同一抗原对不同动物 或同种不同品系动物、或不同个体,产生特异 免疫应答的强弱是不同的。因此,进行动物免 疫时,必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康 动物。
功能名称 生理功能 病理表现 取兔血有两种方法,一是耳缘静脉或耳动脉放血,一是颈动脉放血,也可心脏采血。
收集的血液置于室温下1h左右,凝固后,置4℃下,过夜(切勿冰冻)析出血清,离心,4000rpm,10min。
由多个抗原决定簇刺激机体,相应地就产生各种各样的单克隆抗体,这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。
为了获得较好的抗血清,最好是选用蛋白质抗原。
2)纯化的鸡卵类粘蛋白(周四上午)。
第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备
⑷二抗杂交:第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。
收集的血液置于室温下1h左右,凝固后,置4℃下,过夜(切勿冰冻)析出血清,离心,4000rpm,10min。
如要是获得直接标记诊断的抗体,则直接采用本动物;
完全佐剂。
每2~3周加强免疫一次。 在第2次加强免疫后2周,从耳缘静脉取2~3mL血,制备血

蛋白质免疫印迹技术及PPT课件

蛋白质免疫印迹技术及PPT课件

实验案例二:蛋白质相互作用分析
总结词
蛋白质相互作用分析有助于了解蛋白质之间的相互作用关系,进一步揭示生物学过程的分子机制。
详细描述
在实验中,首先将蛋白质样品进行分离和提纯,然后通过电泳分离蛋白质,再将其转移到膜上。接下 来,利用抗体技术检测两种蛋白质是否相互作用。这种方法可以用于研究蛋白质之间的相互作用关系 ,为生物学过程的研究提供重要信息。
归一化处理
将目标蛋白的密度与内参蛋白的密 度进行归一化,消除实验误差。
统计学分析
对实验组和对照组的数据进行统计 分析,比较组间差异。
数据分析的注意事项
数据可靠性
确保数据来源可靠,避免数据污染和误差。
数据可比性
确保实验条件一致,使数据具有可比性。
数据解读
结合生物学背景和实验目的,对数据进行合理解 读。
凝胶电泳
01
02
03
确定电泳条件
根据蛋白大小和分离需求, 选择合适的凝胶浓度和电 泳电压。
加样与电泳
将稀释后的蛋白样品加入 凝胶的加样孔中,开始电 泳分离蛋白质。
染色与脱色
电泳结束后,对凝胶进行 染色,使蛋白质条带显现 出来,然后进行脱色处理。
转膜

选择合适的转移膜
根据需要,选择NC膜、 PVDF膜等适合的转移膜。
实验操作流程
1. 样品制备
将细胞或组织提取蛋白,进行浓 度测定。
2. 阻断
将膜置于脱脂奶粉或BSA中,封 闭非特异性结合位点。
3. 抗体孵育
将抗体与膜在适当条件下孵育, 使抗体与目标蛋白结合。
6. 结果观察
通过荧光显微镜或其他成像设备 观察蛋白条带。
5. 显影
将荧光染料或其他标记物与抗体 结合,使蛋白在膜上显像。

蛋白质免疫印迹实验WesternBlot

蛋白质免疫印迹实验WesternBlot
,将膜浸于其中,平放在平缓摇动的摇床平台上,室 温温育 1小时后,用PBS缓冲液将硝酸纤维素薄膜漂 洗 4 次 , 每 次 5 分 钟 , 再 加 入 4- 氯 萘 酚 显 色 液 , 加 入 5μ1 的30%H2O2,将硝酸纤维素薄膜置于其中缓慢
摇动,待所检测的蛋白带显色达到最深程度后,将硝 酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出 硝酸纤维素薄膜,自然晾干后拍照保存结果。
四 思考题
• 1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小 完全一致?若不是这样结果会怎样?
• 2. 电转移时为什么都必须带手套小心 操作并除去气泡, 否则结果会怎样?
• 在进色后应时应注意哪些问题? • 请简述免疫印迹实验的原理,并将之与
免疫学相关概念联系起来。
2024/2/11
2024/2/11
一 实验原理
• 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极,二 者结合在一起,然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合,形成“三明治 ”结构,放入电转移仪器上,加入电泳 缓冲液,通上电源后,蛋白质即可从凝 胶上转移到固体支持物上。
2024/2/11
一 实验原理
其定量关系符合以下公式: • Ve=Vo+KV1 • Ve:某一溶质的洗脱体积 • Vo:层析柱的外水体积 • Vi:层析柱的内水体积 • K:某一溶质的分配系数
2024/2/11
二试剂和器材
1.试剂
电转移缓冲液 pH8.3 • 39mM甘氨酸 • 4.8mM Tris碱 • 0.037% SDS • 20% 甲醇 • 混合2.9克甘氨酸,5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲2源自24/2/11三 操作步骤
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(一)多克隆抗体的概念
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的。 由一种抗原决定簇刺激机体,由一个B淋巴细胞接
受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体 (Monoclone antibody)。 由多个抗原决定簇刺激机体,相应地就产生各种 各样的单克隆抗体,这些单克隆抗体混杂在一起 就是多克隆抗体。 机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。
及中和反应等各种不同的反应类型。 因抗体主要存在于血清中,在抗原或抗体的检测中多采用
血清作试验,所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应 (serologic reaction)。
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二、印迹法(blotting)
印迹法是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。
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抗体的种类
抗体(antibodies,Ab)是专门对抗抗原特异 结构的球蛋白,故也称为免疫球蛋白 (immunoglobulins, Ig)。存在于血清、体液 中,是构成机体免疫作用的主要物质。
免疫球蛋白依据其理化性质及生化性质的不同, 分为五种类型: IgG、 IgA、 IgM、 IgD和 IgE。
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抗原的分类
抗原可以分为完全抗原和半抗原。 完全抗原:具有免疫原性和免疫反应性的抗原称
为完全抗原(complete antigen) 半抗原:只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原
称为半抗原(hapten),也称为不完全抗原 (incomplete antigen)。与蛋白质结合后成为完 全抗原。半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞 发生特异性结合反应。绝大多数多糖和所有类脂 都属于半抗原。
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淋巴组织
免疫活性细胞
免疫活性介质
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免疫系统功能的生理和病理表现
功能名称
生理功能 病理表现
免疫防御
清除病原微生物及其它抗原性异物
超敏反应(强) 免疫缺陷病(弱)
免疫自稳
清除损伤或衰老细胞
自身免疫性疾病
免疫监视
清除突变或畸变细胞 防止肿瘤发生 杀伤病毒感染细胞
肿瘤或病毒持续性 感染
在种系发育和进化过程中形成的免疫防御功能。
(二)适应性免疫应答(adaptive immune response) 又称获得性免疫应答,特异性免疫应答,是机体出
生后通过与抗原物质接触后所产生的一系列防御功能。 (具有特异性、多样性、记忆性、耐受性、自限性)
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抗原和免疫原性
抗原(antigens,Ag)是指能够刺激机体免疫活性细 胞产生抗体或致敏淋巴细胞,并在体内或体外发生特 异性反应的物质。
方法。
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蛋白质免疫印迹检测技术
一、实验目的 二、实验原理 三、实验仪器 四、操作步骤 五、实验结果与分析 六、思考题
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一、实验目的
学习掌握动物抗血清的制备原理及技术 通过实际操作学会动物抗血清的制备 掌握Western-blotting的基本原理 熟悉Western-blotting的实验操作
常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋 白质、核酸、激素等有机物。
抗原具有两方面的特性:免疫原性(immunogenicity) 和免疫反应性(immunoreactivity)。
免疫原性(immunogenicity)是指抗原刺激机体引起免疫应 答的能力。
免疫反应性(immunoreactivity)是指抗原与相应免疫应答 产物(即抗体)在体内或体外发生特异性结合反应的能力。
人体血清中IgG含量最多, IgA次之, IgM较 少, IgD和IgE微量。
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抗原抗体反应(antigen-antibody reaction)
是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发 生于体内(in vivo),也可发生于体外(in vitro)。
体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用; 体外反应:可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应
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三、蛋白免疫印迹的应用
免疫印迹法 (immunoblotting test,IBT),亦称酶联 免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB
是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术 相结合的杂交技术。
具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点。 是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的
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当外源异体物质,如细菌、病毒、蛋白质、多 糖等进入动物机体后,可以激活机体免疫系统, 产生对外源物质的排除作用,从而保护机体免 受外源物质的侵害。
机体的这一特异免疫应答功能的细胞基础是淋 巴细胞。
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免疫应答的类型
(一)固有性免疫应答(innate immune response) 又称先天性免疫应答,非特异性免疫应答:是机体
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二、实验原理
第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备 第二部分 Western-blotting 检测抗血清
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第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备
将适当的抗原物质注入动物体内,经过一定时间,动 物血清中可出现大量特异性抗体,这种含抗体的血清 称为免疫血清。
优质免疫血清的产生,主要取决于抗原的纯度和免疫 原性,以及动物应答的能力。此外,尚需考虑免疫途 径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因 素。
实验二 蛋白质的结构和功能; 免疫应答产物的结构和功能; 抗原刺激机体产生免疫应答的规律。
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免疫学的研究范围很广,与很多相关学科交织在 一起,并且发展成了很多学科,如免疫生物学、 免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。
随着免疫生物学的发展,人们发现在高等动物体 内存在着具有免疫功能的组织结构(即免疫系 统)。
1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜 (NC膜)上,并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段 的方法,称为Southern 印迹法。
人们用类似的方法,对RNA和蛋白质进行印迹分析,对 RNA的印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的 蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法,对双向电 泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法
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