大豆脲酶提取与动力学研究-袁永泽-2010-04-14
东师实验5脲酶的制备及其生物学性质的研究

K m值一般可看作是酶促反应中间产物的解离常数。
测定K m在研究酶的作用机制、观察酶与底物间的亲和力大小、鉴定酶的种类及纯度、区分竞争性抑制与非竞争性抑整理用等研究中均具有重要的意义。
当环境温度、pH值和酶的浓度等条件相对恒定时,酶促反应的初速度v随底物浓度[S]增大而增大,直至酶全部被底物所饱和达到最大速度V。
反应初速度与底物浓度之间的关系经推导可用下式来表示,即米氏方程式:对于K m值的测定,我们通常采用Lineweaver-Burk作图法,即双倒数作图法。
具体做法为:取米氏方程式倒数形式。
若以1/v对1/[S]作图,即可得下图中的曲线,通过计算横轴截距的负倒数,就可以很方便地求得K m值。
本实验从大豆中提取脲酶,脲酶催化尿素分解产生碳酸铵,碳酸铵在碱性溶液中与纳氏试剂作用,产生橙黄色的碘化双汞铵。
在一定范围内,呈色深浅与碳酸铵的产量成正比。
通过分光光度计所得到的光吸收值可代表酶促反应的初速度(单位时间所产生的碳酸铵含量与光吸收值成正比)。
具体反应如下:(1)酶促反应(2)呈色反应[二]实验试剂1.0.05mol/L尿素溶液2.0.1mol/LpH=7.0Tris-HCl缓冲液3.10%ZnSO4溶液4.0.5mol/LNaOH溶液5.10%酒石酸钾钠溶液6.钠氏试剂将碘化钾75g,碘55g,蒸馏水50mL以及汞75g,置于500mL锥形瓶内,用力振荡约15min,待碘色消失时,溶液即1.饱和K2CO3溶液:取112gK2CO3,加100mL水溶解2.标准盐酸溶液0.00100mol/L,0.00200mol/L,0.00300mol/L 用前标定3.凡士林4.硼酸指示剂混合液称取1g硼酸用水溶解,稀释至98mL,再加入2mL混合指示剂(将33mg溴甲酚绿及66mg甲基红一起溶于乙醇),稀释至100mL。
,用稀氢氧化钠溶液调至紫红色。
(三)操作方法康维皿是由玻璃、瓷或石蜡制成的浅皿,如右图所示,分内外两室,外室比内室高,边缘必须齐平,盖上玻璃片后与外室边缘不得有缝隙或缺刻。
东师实验5脲酶的制备及其生物学性质的研究

综合研究性实验五:脲酶的制备及其生物学性质的研究一.实验目的1.学习大豆脲酶的提取方法;2.掌握脲酶米氏常数Km的测定方法;3.掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的方法;4.测定脲酶的活力单位及此活力;5.测定温度、PH、抑制剂对酶活性的影响。
二.脲酶提取液的制备脲酶提取液的制备方法方法锥形瓶内加入大豆粉2g和30%的乙醇20mL30min充分摇匀,放置于冰箱次日离心15min(3000rpm),取上清液即为脲酶提取液说明大豆粉中含脲酶不均一,酶浓度需作预实验稀释或酌情加量,原则上要求尿素浓度最大的一管的光吸收值在0.5-0.7为宜。
另外,脲酶需新鲜配制,本实验脲酶提取液的制备最好在0-5℃下进行,在室温下放置不应超过12h,在冰箱内放置不应超过24h,否则会影响实验结果。
三.脲酶Km的测定[一]实验原理K m值一般可看作是酶促反应中间产物的解离常数。
测定K m在研究酶的作用机制、观察酶与底物间的亲和力大小、鉴定酶的种类及纯度、区分竞争性抑制与非竞争性抑制作用等研究中均具有重要的意义。
当环境温度、pH值和酶的浓度等条件相对恒定时,酶促反应的初速度v随底物浓度[S]增大而增大,直至酶全部被底物所饱和达到最大速度V。
反应初速度与底物浓度之间的关系经推导可用下式来表示,即米氏方程式:对于K m值的测定,我们通常采用Lineweaver-Burk作图法,即双倒数作图法。
具体做法为:取米氏方程式倒数形式。
若以1/v对1/[S]作图,即可得下图中的曲线,通过计算横轴截距的负倒数,就可以很方便地求得K m值。
本实验从大豆中提取脲酶,脲酶催化尿素分解产生碳酸铵,碳酸铵在碱性溶液中与纳氏试剂作用,产生橙黄色的碘化双汞铵。
在一定范围内,呈色深浅与碳酸铵的产量成正比。
通过分光光度计所得到的光吸收值可代表酶促反应的初速度(单位时间所产生的碳酸铵含量与光吸收值成正比)。
具体反应如下:(1)酶促反应(2)呈色反应[二]实验试剂1.0.05mol/L尿素溶液2.0.1mol/LpH=7.0Tris-HCl缓冲液3.10%ZnSO4溶液4.0.5mol/LNaOH溶液5.10%酒石酸钾钠溶液6.钠氏试剂将碘化钾75g,碘55g,蒸馏水50mL以及汞75g,置于500mL锥形瓶内,用力振荡约15min,待碘色消失时,溶液即发生高热。
脲酶提取工艺及活性检测方法研究报告

脲酶提取工艺及活性检测方法研究报告本研究报告主要介绍从三个不同品种的刀豆当中提取脲酶的工艺流程并且确立了酶活性的检测方法。
通过固体浸提、乙醇分级沉淀、G-200葡聚糖凝胶过滤、冷冻干燥等工艺处理,最终获得比活性分别为923.6U/g,780.1U/g,585.3U/g 的脲酶。
1刀豆脲酶的提取工艺1.1 30%乙醇提取刀豆脲酶用天平称取干燥的刀豆,粉碎,以100目钢筛筛出豆粉。
向锥形瓶中加入10.0g豆粉,再加入100ml(固液比1:10)的30%乙醇溶液,充分摇匀30min,放置冰箱保存24h后,以4000r/min离心15min,上清液为脲酶粗提取液。
1.2 刀豆脲酶的分离纯化1.2.1乙醇分级沉淀向粗酶液中加入预冷(-20℃)的无水乙醇至终体积分数为10%,以8000r/min 冷冻离心10min进行一级沉淀,收集上清液;再向上清液中加入预冷无水乙醇至终体积分数为40%,以15000r/min冷冻离心10min,弃去上清液,收集沉淀,立即将沉淀溶于少量磷酸缓冲液(pH6.8)中,4℃保存备用。
1.2.2凝胶过滤脲酶分子量较大,脲酶粗制品通过交联葡聚糖Senhadex G-200 层析柱,酶本身不能进入凝胶颗粒,而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒。
用磷酸缓冲液(pH=6.8)作为洗脱剂,分子量大的脲酶首先被洗脱下来,从而达到与其他物质分离的目的。
首先进行凝胶溶胀,然后装柱,加样,控制流速,流出的液体分别收集在刻度离心管中,收集量为 3 mL/管。
或者在设备允许的情况下,直接使用蛋白质自动纯化系统进行蛋白质纯化,本实验采用此种方法。
通过凝胶过滤,收集蛋白质含量较高的各管并4℃保藏备用。
1.2.3冷冻干燥将经凝胶过滤后的酶液分装在能够保证蒸发表面尽量大且厚度尽量薄的容器中,装量要均匀,然后进行冷冻处理,冻结之后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥。
干燥完毕后立即对样品进行酶活性检测,同时将产品低温保藏。
AAA大豆脲酶的提取及其影响因素研究

了大豆脲酶,测得该脲酶的Km值为3.576×10一,1.0 mL提取液的酶活力为26.58 U。大豆脲酶分解尿素的产物
为铵氮,借助钠氏试剂比色法和凯氏定氮法对生成的铵氮进行了比色分析,进而从乙醇浓度、固液比、pH值考察了
脲酶的最佳提取条件。确定的最佳乙醇浓度为30%、固液比为1:10,最适pH值为7.0。
reeiproesl plot)来测定旷1铊辫=芒南+
争,具体方法是将反应速度的倒数1/V对底物浓
yⅢ 度的倒数1/[S]作图,得到一条直线,该直线在Y
轴的截距为l/Vn瞰,在X轴上的截距为1/勋l的绝
对值。在脲酶水解尿素实验中,酶促反应速度V与 时间的积分为生成铵氮的量,铵氮与钠氏试剂生成
棕黄色的络合物,在480 nnl处有最大吸收峰,因此, 在相同时间内,A枷与反应速度成正比,所以用1/A
中加入0.1管中依次加入pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的 缓冲溶液1.0 mL。在25℃恒温水浴中预热5 rain 后向每个管中加入脲酶提取液0.5 mL。反应后立 即向每支试管中加入1.0 tool·L“的盐酸1.0 mL 混匀,把试管放在冰水浴中停止反应。从每支试管 中取0.2 mL反应液用凯氏定氮法定氮bJ。
格低廉、来源广泛的市售大豆中提取了脲酶,并提取 条件进行了考察,为进一步研究提供一定的参考 依据。
1材料和方法
1.1主要仪器及试剂 1.1.1仪器威的V03666B干磨机;721型可见 光分光光度计;凯氏定氮仪;海尔BCD-156TADZ冰 箱;100目钢筛;800B台式离心机。 1.1.2试剂所用试剂均为分析纯,水为蒸馏水。
480 nm(A枷)was proportional to Nix,"concentration in the r'eactJoltl solution,SO it had linear eorrdation with the soybean u-
黄豆豆渣中脲酶的提取精制及其影响因素研究

黄豆豆渣中脲酶的提取精制及其影响因素研究张铁军;施圆圆;孔令漪;曹蓝霄;周嘉青【摘要】为拓展脲酶的国产化途径,对黄豆豆渣中脲酶的提取进行了研究.建立了从黄豆豆渣中提取脲酶的全套流程,利用盐析法和有机溶剂沉淀法,通过浸提及离心等试验操作手段,将黄豆豆渣中的脲酶进行提取精制,产率为0.1%.同时确定了脲酶的最佳提取条件:其最佳浸提温度为50℃,最佳丙酮浓度为50%,最适pH为7.0.利用纳氏试剂比色法的原理,测得该脲酶在最佳实验条件下的米氏常数Km值为4.11×10-2 mol/L,1 mL脲酶溶液中的酶活力为18.63 U.从黄豆豆渣中提取脲酶,既可解决脲酶的国产化问题,又可提高黄豆豆渣的附加值,研究结果具有良好的工业价值和经济效益.【期刊名称】《生物技术进展》【年(卷),期】2017(007)003【总页数】5页(P253-257)【关键词】黄豆豆渣;脲酶;酶活力;Km;酶活影响因素【作者】张铁军;施圆圆;孔令漪;曹蓝霄;周嘉青【作者单位】广州医科大学生命科学学院,广州511436;广州医科大学生命科学学院,广州511436;广州医科大学第三临床学院,广州511436;广州医科大学第三临床学院,广州511436;广州医科大学南山学院,广州511436【正文语种】中文脲酶(urease)亦称尿素酶,是一种寡聚酶,分子量约为293 500 Da,等电点为3.9,具有绝对专一性[1],特异性地催化尿素水解释放出氨和二氧化碳[2]。
脲酶是一种在各行业应用广泛的重要生物制剂。
广泛分布于豆类植物中,尤其是在黄豆、刀豆中含量丰富,约1%~1.5%。
在医药方面,脲酶是幽门螺旋菌感染诊断试验RUT中的一种重要的酶[3];在农业方面,适当条件下应用种子封装与脲酶可显著增强植物早期阶段氮营养的吸收利用[4],另外,脲酶还可用于尿素废水的处理[5]。
国外对脲酶的制备研究早已成熟,生产方法主要是从洋刀豆中提取脲酶,并于近年来开始致力于研究脲酶的其他作用,如利用重组酸性脲酶消除致癌因素氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)前体物质尿素等[6]。
大豆脲酶 提取

大豆脲酶提取介绍大豆脲酶是一种重要的酶类物质,具有广泛的应用价值。
本文将深入探讨大豆脲酶的提取方法、应用领域以及未来的发展前景。
提取方法大豆脲酶的提取方法多种多样,下面将介绍几种常用的方法:1. 酸提法酸提法是利用酸性条件下脲酶的性质,将其从大豆中提取出来。
具体步骤如下: 1. 将大豆粉末与酸性溶液混合搅拌。
2. 调节pH值,使其处于脲酶最稳定的范围内。
3. 进行离心分离,将脲酶从溶液中分离出来。
4. 经过浓缩、纯化等步骤,得到纯度较高的大豆脲酶。
2. 酶解法酶解法是利用其他酶类物质,将大豆中的脲酶释放出来。
具体步骤如下: 1. 将大豆粉末与酶解剂混合,进行酶解反应。
2. 控制酶解反应的时间和温度,使脲酶能够完全释放出来。
3. 进行离心分离,将脲酶从溶液中分离出来。
4. 经过浓缩、纯化等步骤,得到纯度较高的大豆脲酶。
3. 超声波法超声波法是利用超声波的作用,破坏大豆细胞结构,释放脲酶。
具体步骤如下: 1. 将大豆粉末与溶液混合,置于超声波设备中。
2. 开启超声波设备,进行超声波处理。
3. 控制超声波的频率和功率,使脲酶能够充分释放出来。
4. 进行离心分离,将脲酶从溶液中分离出来。
5. 经过浓缩、纯化等步骤,得到纯度较高的大豆脲酶。
应用领域大豆脲酶具有广泛的应用领域,下面将介绍几个主要的应用领域:1. 洗涤剂大豆脲酶在洗涤剂中的应用得到了广泛的认可。
它能够有效地分解血渍、蛋白质等污渍,提高洗涤剂的清洁效果。
2. 食品工业大豆脲酶在食品工业中的应用也非常重要。
它能够降解食品中的蛋白质、淀粉等物质,改善食品的口感和质地。
3. 医药领域大豆脲酶在医药领域中有着广泛的应用。
它可以用于药物的合成、酶替代治疗等方面,具有很大的潜力。
4. 环境保护大豆脲酶在环境保护中也发挥着重要的作用。
它可以用于水处理、废物处理等方面,具有很好的净化效果。
发展前景大豆脲酶作为一种重要的酶类物质,具有广阔的发展前景。
脲酶提取工艺及活性检测方法研究报告

脲酶提取工艺及活性检测方法研究报告本研究报告主要介绍从三个不同品种的刀豆当中提取脲酶的工艺流程并且确立了酶活性的检测方法。
通过固体浸提、乙醇分级沉淀、G-200葡聚糖凝胶过滤、冷冻干燥等工艺处理,最终获得比活性分别为923.6U/g,780.1U/g,585.3U/g 的脲酶。
1刀豆脲酶的提取工艺1.1 30%乙醇提取刀豆脲酶用天平称取干燥的刀豆,粉碎,以100目钢筛筛出豆粉。
向锥形瓶中加入10.0g豆粉,再加入100ml(固液比1:10)的30%乙醇溶液,充分摇匀30min,放置冰箱保存24h后,以4000r/min离心15min,上清液为脲酶粗提取液。
1.2 刀豆脲酶的分离纯化1.2.1乙醇分级沉淀向粗酶液中加入预冷(-20℃)的无水乙醇至终体积分数为10%,以8000r/min 冷冻离心10min进行一级沉淀,收集上清液;再向上清液中加入预冷无水乙醇至终体积分数为40%,以15000r/min冷冻离心10min,弃去上清液,收集沉淀,立即将沉淀溶于少量磷酸缓冲液(pH6.8)中,4℃保存备用。
1.2.2凝胶过滤脲酶分子量较大,脲酶粗制品通过交联葡聚糖Senhadex G-200 层析柱,酶本身不能进入凝胶颗粒,而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒。
用磷酸缓冲液(pH=6.8)作为洗脱剂,分子量大的脲酶首先被洗脱下来,从而达到与其他物质分离的目的。
首先进行凝胶溶胀,然后装柱,加样,控制流速,流出的液体分别收集在刻度离心管中,收集量为 3 mL/管。
或者在设备允许的情况下,直接使用蛋白质自动纯化系统进行蛋白质纯化,本实验采用此种方法。
通过凝胶过滤,收集蛋白质含量较高的各管并4℃保藏备用。
1.2.3冷冻干燥将经凝胶过滤后的酶液分装在能够保证蒸发表面尽量大且厚度尽量薄的容器中,装量要均匀,然后进行冷冻处理,冻结之后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥。
干燥完毕后立即对样品进行酶活性检测,同时将产品低温保藏。
大豆脲酶的提取及其影响因素研究

大豆脲酶的提取及其影响因素研究
周东凯;刘莹;马学良;刘冬梅;王占勇;马娟
【期刊名称】《大豆科学》
【年(卷),期】2008(27)4
【摘要】为了寻求大豆脲酶的国产化途径,对市售大豆进行了脲酶提取研究。
用乙醇水溶液从市售大豆中提取出了大豆脲酶,测得该脲酶的Km值为3.576×10-
2,1.0mL提取液的酶活力为26.58U。
大豆脲酶分解尿素的产物为铵氮,借助钠氏试剂比色法和凯氏定氮法对生成的铵氮进行了比色分析,进而从乙醇浓度、固液比、pH值考察了脲酶的最佳提取条件。
确定的最佳乙醇浓度为30%、固液比为1∶10,最适pH值为7.0。
【总页数】4页(P704-707)
【关键词】大豆;脲酶;Km;酶活
【作者】周东凯;刘莹;马学良;刘冬梅;王占勇;马娟
【作者单位】辽宁石油化工大学
【正文语种】中文
【中图分类】Q550.3
【相关文献】
1.黄豆豆渣中脲酶的提取精制及其影响因素研究 [J], 张铁军;施圆圆;孔令漪;曹蓝霄;周嘉青
2.单一和复合菌对大豆外观特性及脲酶活性的影响研究 [J], 谢益根;练小华;罗垂杨;
何余湧
3.大豆种皮中脲酶提取的研究进展 [J], 冯丽娟;符浩东;窦润雪;孙炜;李磊
4.大豆油体的提取及影响因素研究进展 [J], 田其英;王静
5.大豆脲酶诱导碳酸钙沉淀的多因素影响分析 [J], 原华;刘康;原耀楠;冯佳星因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
脲酶活性的测定

2、空白试验: 准确称取0.200±0.001g样品于 称量瓶中,加入10ml0.05mol/L磷 酸盐缓冲溶液,加塞混合,置于 30℃水浴中。
3、样品试验与空白试验的制备应相 隔5分钟,并且每隔5分钟搅拌内 容物一次。
4、30分钟后,相隔5分钟将样品与空 白试验的称量瓶从水浴中取出,将 上层液体移入5ml烧杯中,在从水 浴中取出刚达5分钟时,分别测定 此种上层液体的PH值。
六、结果的计算
1பைடு நூலகம்计算公式:
样品试验的PH值与空白试验的PH值 两者之间的差异,则为脲酶活性的指数, 即:
脲酶活性 = 试样的PH测定值-空白的PH测定值
2、重复性:
每个样品应取两个平行样测定, 以其算术平均值为结果。
七、注意事项
1、关于酸度计的使用
2、称量瓶应塞紧 3、关于固定质量称量法 4、通常: 0.02<△PH≤0.3 加工适度 △PH<0.02 加工过度 △PH>0.3 加工不够 BACK
三、仪器及试剂
1、仪器
分析天平、样品粉碎机、样品分析 筛、恒温水浴、酸度计、称量瓶、 移液管、角匙等
2、试剂
0.05mol/L磷酸盐缓冲液、尿素缓 冲溶液等
四、试样的选取和制备
选取具有代表性的试样,粉碎至40 目,用“四分法”缩减至200~300g, 密闭保存,以防试样组分变化或变质。
五、测定步骤
实验三 大豆制品中脲酶活性的测定
2010.10.30
一、实验目的
1、掌握大豆制品中脲酶活性的测 定原理 2、熟悉掌握用PH增值法测定大豆 制品中脲酶活性
大豆脲酶活性的两种不同测定方法的研究_卢晓凌

有仲裁性。为了更好的了解两种方法的利与弊, 本文
③ 实 验 方 法 : 准 确 称 取 0.400 g 样 品 2 份 , 分 别
置于 2 支 25 ml 比色管中, 其中 1 支加入 20 ml 磷酸
盐 缓冲 液 , 作为 空 白 试 验 管 , 另 1 支 加 入 20 ml 尿 素
卢 晓 凌 , 东 北 林 业 大 学 野 生 动 物 资 源 学 院 , 150040, 黑 龙 江省哈尔滨市东北林业大学 702 信箱。
王忠艳, 单位及通讯地址同第一作者。
磷酸盐缓冲液, 作为试验管, 立即盖好比色管塞并剧 烈摇动,置于(30±0.50) ℃恒温水浴中, 每隔 5 min 振摇 1 次, 准确计时, 保持 30 min。立即分别测定其 pH 值。
收稿日期: 2007- 12- 10
④ 实验结果表示: 脲酶活性=pH - 试验管 pH 。 空白管
30×m
3.5
3
2.5
2
pH 增值法
1.5
滴定法
1
0.5
0
20
40
60
80
100
热处理时间( min) 图 1 140 ℃下大豆粉不同处理时间的脲酶活性
由图 1 可以看出, 140 ℃加热条件下, 0 ̄87 min 内 大豆粉脲酶活性随加热时间延长而降低, 并呈规律性 变化。而且滴定法的测定值大于 pH 增值法的测定值。 由图 1 可知, 用 pH 增值法和滴定法两种方法, 测定同 一种大豆粉中脲酶活性随加热时间延长而降低这种 规律性变化时, 测定出的变化规律基本相同。这表明 两种方法测得的脲酶活性大小在数值上虽然有所不 同, 但数据间存在一定的关系, 可通过一定的方法进 行两者间的数据代换。 2.2 实验数据处理
大豆中脲酶活性的测定

c.试剂:尿素 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 尿素缓冲液(PH6.9至7.0) 4.45克磷酸 氢二钠和3.40克的磷酸二氢钾溶于水并稀 释至1000ml,再将30克尿素溶于此缓冲 液中。 盐酸 氢氧化钠 0.1mol/L标准溶液
操作方法
称取0.2克已粉碎的样品,转入试管中, 加入10ml的尿素缓冲液,立即盖好试管并剧烈 振动,马上置于30℃的恒温水浴中,准确计时 保持30分钟。然后加入10ml0.1mol/L盐酸溶液, 迅速冷却到20℃,将试管内容物全部转入烧杯, 用5ml水冲洗试管2-3次,立即用标准氢氧化 钾标准液滴定至PH=4.70。 另取试管作为空白管,加入10ml的尿素缓 冲液,然后加入10ml0.1mol/L盐酸溶液。称取 与上述试样量相当的试样,迅速加入此试管中, 立即盖好试管并剧烈振动,马上置于30℃的恒 温水浴中,准确计时保持30分钟,冷却到20℃, 将试管内容物全部转入烧杯,用5ml水冲洗试 管2-3次,立即用标准氢氧化钾标准液滴定至 PH=4.70。
快速测定方法2
在培养皿上放入少量的豆饼粕,在样品上 滴入少量指示剂并搅拌,将其平铺于培养皿中, 放置5min后观察结果。 无任何红点出现,再放置25min仍然无红点出 现,说明豆粕过熟; 有少量红点出现,说明脲酶活性较低,豆粕可 用; 样品表面有25%被红点覆盖,豆粕可用; 样品表面有50%被红点覆盖,应慎用; 样品表面有75%-100%被红点覆盖,脲酶活 性过高,豆粕过生,不可用;
4.操作步骤
准确称取0.4克样品2份,分别置于2支试
管中。一支试管加(A管),另一支加入20ml尿素缓冲
液(B管)。盖塞混匀,在30℃恒温水浴中准
确保持30min。在此期间,每隔5min摇匀一次。
取出立即在流水中冷却,5min内测定溶液的
黄豆脲酶的提取与性质研究

文章编号: 100420366 (2000) 0120062205黄豆脲酶的提取与性质研究崔有宏, 罗 侃, 吴育凌, 王 琦, 王绪明(解放军兰州医学高等专科学校生化教研室, 甘肃 兰州 730020)摘 要: 为解决脲酶的国产化问题, 建立了从黄豆中提取脲酶的全套流程, 主要包括 醋酸盐缓冲液提取、亚硫酸钠盐析和离子交换色谱等步骤, 操作简便, 成本低廉。
收率 达 44. 09% 。
产品比活性达 67. 15 U ƒm g 蛋白, 可满足临床测定尿素的需要。
再经分子 筛色谱, 可获得更纯的黄豆脲酶 ( 比活达 1 159. 67 U ƒm g 蛋白)。
酶性质研究结果显 示, 黄豆脲酶的分子量为 293 500, p I 为 3. 9, 在 ED TA 和 T r is- 琥珀酸缓冲系统中的K m 值分别为 0. 011 76m o l . L - 1 和 0. 018 18 m o l . L - 1 , V m ax 分别为3. 42 Λm o l . m i n - 1 和4. 35 Λm o l . m i n - 1 , 在 ED TA 、磷 酸 盐 和 T r is 2琥 珀 酸 缓 冲 系 统 中 的 最 适 pH 6. 00、7. 00 和 6. 50, 最适温度为 65℃。
这些性质与巨豆脲酶有显著差异。
分 别 为关键词: 黄豆; 脲酶; 提取; 分子量中图分类号: Q 55 文献标识码: A脲酶是临床酶法测定尿素的关键工具酶。
目前, 商品化脲酶产品主要由巨豆〔刀豆属种 (C a n a v a l in a sp . ) J ack b ean 〕提取, 国内由于缺乏巨豆资源, 故配制酶法尿素测定试剂盒所需 原酶依赖进口。
为解决脲酶的国产化问题, 我们建立起从黄豆 (G ly c in e m a x ) 中提取脲酶的全 套流程, 并对所提黄豆脲酶的性质作了研究, 为其应用奠定了基础。
新法提取脲酶的研究

新法提取脲酶的研究
陈菊娣;于云;杜小英;祖桂荣
【期刊名称】《中国医药工业杂志》
【年(卷),期】1997(28)12
【摘要】介绍了从大豆中提取脲酶的新方法,摒弃了传统的柱色谱分离、浓缩、透析等繁琐步骤。
制得的脲酶活性大于50U/mg,比活为61.2U/mg蛋白;酶作用最佳pH为6.7,最适反应温度为37℃;以尿素为底物的米氏常数Km为3.67×10-3mol/L。
【总页数】3页(P531-533)
【关键词】大豆;脲酶;尿素氮;提取
【作者】陈菊娣;于云;杜小英;祖桂荣
【作者单位】天津医药科学研究所
【正文语种】中文
【中图分类】TQ464.8;TQ28
【相关文献】
1.响应面法优化银杏叶多酚提取工艺及对脲酶抑制活性的研究 [J], 王桃云;邱业先;汪金莲;杨磊;薛凯;王罗玲
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脲酶在我国常见豆类及果蔬种籽中分布的研究

脲酶在我国常见豆类及果蔬种籽中分布的研究
陈佩琴;褚松涛
【期刊名称】《氨基酸杂志》
【年(卷),期】1989(000)002
【摘要】本文利用氨气敏电极-动力学法测定了33种我国常见豆类及果、蔬种籽中脲酶的分布,发现其中脲酶活性较高的有刀豆、徐州毛豆、豌豆、青豆、黄豆及新澄一号和苏密一号西瓜籽等7种。
它们的脲酶相对活性次序为刀豆>徐州毛豆、新澄一号西瓜籽>豌豆、青豆、苏密一号西瓜籽及黄豆。
【总页数】3页(P6-8)
【作者】陈佩琴;褚松涛
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】Q946.5
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中国栽培大豆代表品种和野生大豆部分群体脲酶等位酶的分析

中国栽培大豆代表品种和野生大豆部分群体脲酶等位酶的分析王洪新;胡志昂;姚振纯
【期刊名称】《大豆科学》
【年(卷),期】1994(13)1
【摘要】用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分析了我国栽培大豆82个代表品种和野生大豆部分群体的脲酶等位酶。
本实验室条件下脲酶快带Rf=0.54—0.59,慢带Rf=0.36—0.43,与文献报道一致。
所分析82个品种快慢脲酶变异体约各半,各等位的分布与该品种的产地无显著相关性。
在已分析的野生大豆群体中,也发现脲酶存在快带和慢带两种变异。
所以大豆脲酶基因的突变可能发生在野生大豆的天然群体里。
【总页数】5页(P67-71)
【关键词】大豆;脲酶等位酶;品种;野生种
【作者】王洪新;胡志昂;姚振纯
【作者单位】中国科学院植物研究所,黑龙江省农业科学院作物育种研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S565.101
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黄豆脲酶的提取及其活性测定

黄豆脲酶的提取及其活性测定
林丽云;董晓洁;陈阿微
【期刊名称】《食品研究与开发》
【年(卷),期】2013(000)009
【摘要】对市售黄豆进行了脲酶提取研究,通过pH增值法对脲酶活性进行测定,并确定黄豆脲酶的最佳提取方案。
结果表明,提取黄豆脲酶的最佳方案为:采用干黄豆为原料,以30%乙醇溶液提取脲酶粗酶液,用分级沉淀的方法对粗酶液里的
脲酶进行分离,采用Sephadex G-150凝胶层析过滤装置对脲酶液进行纯化,用
真空冷冻干燥技术对脲酶液进行干燥浓缩,得到酶活力最高的脲酶。
【总页数】4页(P85-87,88)
【作者】林丽云;董晓洁;陈阿微
【作者单位】韩山师范学院生物系,广东潮州521000;韩山师范学院生物系,广
东潮州521000;韩山师范学院生物系,广东潮州521000
【正文语种】中文
【相关文献】
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2.黄豆豆渣中脲酶的提取精制及其影响因素研究 [J], 张铁军;施圆圆;孔令漪;曹蓝霄;周嘉青
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1 1 测A480,并计算反应速度。以 为纵坐标, 为横坐 [s] v
标作图,由图判断磷酸盐对脲酶的抑制类型。
A样 40μmol(NH 3) v A标 时间( 5 min)
③ 抑制剂对脲水解速度的影响
取14只干燥试管,各管标号,按下表加样。
级数 试管号
1 2 3 4 5 6 7 8
pH7.0磷酸盐缓冲液(0.5 ml)
0.8 mol/L
脲溶液(0.25 ml)
0.01 mol/L 0.02 mol/L 0.04 mol/L 0.08 mol/L 0.01 mol/L 0.02 mol/L 0.04 mol/L 0.08 mol/L
② pH对脲酶催化速度的影响 ●取7只干燥试管,标以1-7序号。在1-5管中各加入0.5毫升 0.1M脲溶液,再分别加入1毫升0.1M的pH5,pH6,pH7, pH8,pH9的Tris-硫酸缓冲液,室温平衡5分钟后,分别 加入0.5毫升酶溶液,混匀。再于室温反应5分钟,然后在 各管立即加入0.5毫升10%三氯乙酸,终止反应,混匀, 按前法取出1.0 ml离心,取一定体积的上清与奈氏试剂显 色。6号管加入0.3毫升标准硫酸铵溶液,7号管加入0.5毫 升H2O作为空白,6、7号管各加1毫升H2O代替Tris—硫酸 缓冲液。室温平衡、加酶液等操作与1~5号管同时进行。 ●分别由各管吸取0.2毫升反应液依次加入另1′—7′各管中, 各加4.3毫升H2O,摇匀,再加0.50毫升奈氏试剂,摇匀。 测A480,并计算反应速度。 ●以v为纵坐标,pH为横坐标作出v-pH图,求脲酶最适pH。
摇匀各管,分别取 1.0 ml 溶液置于 EP 管中,室温、10,000 rpm 离心 10 min,各取 0.2 ml 上清按下表加样。这里,需准备另外6只洁净的试管。 反应液 ddH2O 奈氏试剂 0.2 4.3 0.5 0.2 4.3 0.5 0.2 4.3 0.5 0.2 4.3 0.5 0.2 4.3 0.5 0.2 4.3 0.5
(纳氏试剂) (碘化氨氧合汞)
奈氏试剂法试剂昂贵 但较为精确
三、实验器材与试剂
1. 粉碎机、试管、烧杯、离心机(离心管)、分光光度计等。 2. 脲酶提取液(粗酶液),使用时可以磷酸缓冲液适当稀释。
3. 标准脲(尿素)溶液:0.01, 0.02, 0.04, 0.08 mol/L。
3%脲的磷酸盐溶液(5.4%磷酸氢二钠- 4.25%磷酸二氢钾) 4. 磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.0):0.1, 0.4, 0.8 mol/L。 5. Tris-H2SO4缓冲液:50 mmol/L, pH 5, 6, 7, 8, 9。 6. 标准硫酸铵溶液:40 mmol/L(即40 mmol/ml)
(9)各管混匀后30 min内,用分光光度计F1800测试:
A1 A2 A3
● 结果与分析
脲酶活力(U/ml)= ( A3 A1 ) 标准管中的NH 3微摩尔数 n ( A2 A1 ) 5 min 酶样品毫升数 式中:n为酶样品的稀释倍数 请思考下面三个问题,这对保证本实验的完成质量很重要! ① 根据上述计算公式,脲酶活力单位如何定义? ② 你认为上述实验获得的脲酶活性数据严格吗?如果不够 严格,你认为应如何改进实验?
生物技术大实验
大豆脲酶制备与动力学研究
生物化学与分子生物学教研室 指导教师:袁永泽
一、实验目的
1、掌握脲酶提取的基本方法
2、掌握脲酶活性检测方法 3、掌握脲酶动力学研究的实验原理 作图法求取动力学参数(Km、Vmax) 4、理解底物浓度、pH以及抑制剂对酶Km 的影响、利用作图法判断抑制类型
二、实验原理
表1 脲酶Km与来源、测定条件的关系
来源 刀豆 缓冲液类型 Tris-硫酸 pH 7.0 8.0 Tris-盐酸 7.4 7.0 温度(℃) 25 21 25 38 25 Km(mol/L) 5.1×10-3 4.0×10-3 4.0×10-3 3.3×10-3 3.0×10-3
√
大豆
Tris-硫酸
Vm[ S ] v Km [ S ]
v Vm S Km [ S ]
[S ] v
[S ] K m 1 [S ] v Vm Vm
Km Vm
-Km
● ●
斜率= 1/Vm
O[S]ຫໍສະໝຸດ 试剂/ ml空白管
标准管 1 2
反应管 3 ╲ ╲ ╲ ╲ 0.5 ╲ ╲ 1.0 4 ╲ ╲ ╲ ╲ ╲ 0.5 ╲ 1.0
③ 在测活操作中,是否有因素影响结果的准确度?如有不
利因素,应如何克服?
3、脲酶动力学研究
① 底物浓度对脲酶反应速度的影响——Km和Vm的测定 原理:酶的Km和Vm是酶反应动力学重要参数。 Km是酶的特征常数(与反应条件有关)。 利用不同底物浓度[S]下测得的反应速度v,以[S]/v对 [S]作图,或以双倒数作图,可测定脲酶的Km和Vm。
2、脲酶活性的测定
试管号
步 骤
(1)酶液(mL,原液或适当稀释) (2)标准硫酸铵溶液(mL) (3)蒸馏水(mL)
1 0 0 2.00
2 0 0.30 1.70
3 1.00 0 1.00
(4)10%· 三氯乙酸 (mL)
(5)室温平衡5 min。 (6)3%尿素(mL)
1.00
1.00
0
1.00
7. 奈氏试剂:配制方法参见教材;注意离心取上清,避光储
于棕色瓶中备用。 8. 人造沸石、2%乙酸、32%丙酮 √ 9. 10%(W/V)三氯乙酸(沉淀蛋白、终止酶反应!)
四、实验内容与操作步骤
1、脲酶的提取
① 称取5 g人造沸石,置小烧杯中,用2%乙酸浸泡两次,倾 去酸,用蒸馏水反复洗涤至中性,沥干备用。 √ ② 称取10 g新鲜大豆粉,置于锥形瓶中,加上述人造沸石, 再加入50 ml 32%丙酮溶液,冰浴中持续摇动15-20 min, 4℃、10,000 rpm离心15 min,收集上清液备用。 √ ③ 向②中沉淀加入10 ml 32%丙酮溶液,重悬,复抽提一 次(操作同上),两次上清合并,即为粗酶液。
标准硫酸铵(40 mmol/ml) ddH2O 10 mmol/L 标准脲溶液 20 mmol/L 标准脲溶液 40 mmol/L 标准脲溶液 80 mmol/L 标准脲溶液 10% 三氯乙酸 Tris 缓冲液 (50 mmol/L; pH7.0)
╲ 0.5 ╲ ╲ ╲ ╲ 0.5 1.0
0.3 0.2 ╲ ╲ ╲ ╲ 0.5 1.0
显色 10 min,摇匀,室温、10,000 rpm 离心 10 min,取上清于 480 nm 处测光吸收值。
结果与分析
△ 将测定结果列表:
编号 A480 A标-A空 A样-A空 V [S] [S]/v 1 2 3 4 空白管 标准管
△ 以[S]/v对[S]作图,求取Km和Vm。 思考:上述动力学参数的求取在实验设计上是否严密? 若不够严密,请你提出改进的方案。
1.00
1.00
(7)从样品管加尿素开始计时,准确反应5 min,立即向样品管(3号管)加10%三氯乙酸 1.00 mL,终止反应。各管摇匀后,取1.0 ml溶液置于EP管中,室温、10,000 rpm离心 5 min,吸取0.2 ml上清按步骤(8)进行反应。 (8)另取3支洁净的试管,分别对应于上述各管,进行后续反应。 ① 反应液(mL) ② 蒸馏水(mL) ③ 奈氏试剂(mL) 比色记录A480nm 0.20 4.30 0.50 0.20 4.30 0.50 0.20 4.30 0.50
一组
二组
0.4 mol/L
三组 四组
9 10 11 12
13
0.1 mol/L 0.1 mol/L
0.01 mol/L 0.02 mol/L 0.04 mol/L 0.08 mol/L
H2O 0.25毫升
●同前法分别在各试管中加入0.5毫升脲酶提取液,25℃保温 5分钟,立即加入0.5毫升1molH2SO4,然后煮沸至浑浊,取 出静置5分钟。与此同时在14号管中制作标准。 ●从每只试管中取出0.5毫升反应液,依次加入另1′~13′试管 中,各加4.30毫升H2O,摇匀,再加0.50毫升奈氏试剂, 摇匀。与此同时在14号管中制作标准。
╲ ╲ 0.5 ╲ ╲ ╲ ╲ 1.0
╲ ╲ ╲ 0.5 ╲ ╲ ╲ 1.0
室温平衡 5 min 后依次加入酶液。 脲酶(原液或适当稀释液) 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
迅速摇匀,室温下反应 5 min,加入三氯乙酸终止反应。 10% 三氯乙酸 ╲ ╲ 0.5 0.5 0.5 0.5
1、脲酶(urease)的基本生化性质
① 脲酶广泛分布于植物种子中,也存在于某些微生物中。 刀豆、大豆、黄豆中含量丰富。 ② 脲酶催化脲的水解反应,专一性高,生成氨与CO2。 ③ 脲酶为寡聚酶, Urease crystals ( X 728) 分子量约为483 KD, Sumner, J. B. (1926) 等电点为4.8, “ The isolation and crystallization of the 最适pH 7.0。 enzyme urease” J. Biol. Chem. 69:435-441. ④ Km与来源及测定条件 有关,参见表1。
7.0
二、实验原理
2、脲酶活性测定原理
脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳,最适反应pH 7.0。 反应式:
(NH2)2CO + H2O
2 NH3 + CO2
氨与奈氏试剂反应生成黄色配合物,其吸光度与氨浓度 成正比。故可以测定脲酶活力的大小。反应式: NH3· H2O + 2K2HgI4 + 3KOH → HgO· HgNH2I + 7KI + 3H2O