大豆脲酶提取与动力学研究-袁永泽-2010-04-14

标准硫酸铵（40 mmol/ml） ddH2O 10 mmol/L 标准脲溶液 20 mmol/L 标准脲溶液 40 mmol/L 标准脲溶液 80 mmol/L 标准脲溶液 10% 三氯乙酸 Tris 缓冲液 （50 mmol/L; pH7.0）
╲ 0.5 ╲ ╲ ╲ ╲ 0.5 1.0
0.3 0.2 ╲ ╲ ╲ ╲ 0.5 1.0
Vm[ S ] v Km [ S ]
v Vm S Km [ S ]
[S ] v
[S ] K m 1 [S ] v Vm Vm
Km Vm
-Km
● ●
斜率= 1/Vm
O
[S]
试剂/ ml
空白管
标准管 1 2
反应管 3 ╲ ╲ ╲ ╲ 0.5 ╲ ╲ 1.0 4 ╲ ╲ ╲ ╲ ╲ 0.5 ╲ 1.0
（9）各管混匀后30 min内，用分光光度计F1800测试：
A1 A2 A3
● 结果与分析
脲酶活力（U/ml）= ( A3 A1 ) 标准管中的NH 3微摩尔数 n ( A2 A1 ) 5 min 酶样品毫升数 式中：n为酶样品的稀释倍数 请思考下面三个问题，这对保证本实验的完成质量很重要! ① 根据上述计算公式，脲酶活力单位如何定义？ ② 你认为上述实验获得的脲酶活性数据严格吗？如果不够 严格，你认为应如何改进实验?
③ 在测活操作中，是否有因素影响结果的准确度？如有不
利因素，应如何克服？
3、脲酶动力学研究
① 底物浓度对脲酶反应速度的影响——Km和Vm的测定 原理：酶的Km和Vm是酶反应动力学重要参数。 Km是酶的特征常数（与反应条件有关）。 利用不同底物浓度[S]下测得的反应速度v,以[S]/v对 [S]作图，或以双倒数作图，可测定脲酶的Km和Vm。
一组
二组
0.4 mol/L
三组 四组
9 10 11 12
13
0.1 mol/L 0.1 mol/L
0.01 mol/L 0.02 mol/L 0.04 mol/L 0.08 mol/L
H2O 0.25毫升
●同前法分别在各试管中加入0.5毫升脲酶提取液，25℃保温 5分钟，立即加入0.5毫升1molH2SO4，然后煮沸至浑浊,取 出静置5分钟。与此同时在14号管中制作标准。 ●从每只试管中取出0.5毫升反应液，依次加入另1′~13′试管 中，各加4.30毫升H2O，摇匀，再加0.50毫升奈氏试剂， 摇匀。与此同时在14号管中制作标准。
生物技术大实验
大豆脲酶制备与动力学研究
生物化学与分子生物学教研室 指导教师：袁永泽
一、实验目的
1、掌握脲酶提取的基本方法
2、掌握脲酶活性检测方法 3、掌握脲酶动力学研究的实验原理 作图法求取动力学参数(Km、Vmax) 4、理解底物浓度、pH以及抑制剂对酶Km 的影响、利用作图法判断抑制类型
二、实验原理
A样 40μmol(NH 3) v A标 时间（ 5 min）
③ 抑制剂对脲水解速度的影响
取14只干燥试管，各管标号，按下表加样。
级数 试管号
1 2 3 4 5 6 7 8
pH7.0磷酸盐缓冲液（0.5 ml）
0.8 mol/L
脲溶液（0.25 ml）
0.01 mol/L 0.02 mol/L 0.04 mol/L 0.08 mol/L 0.01 mol/L 0.02 mol/L 0.04 mol/L 0.08 mol/L
╲ ╲ 0.5 ╲ ╲ ╲ ╲ 1.0
╲ ╲ ╲ 0.5 ╲ ╲ ╲ 1.0
室温平衡 5 min 后依次加入酶液。 脲酶（原液或适当稀释液） 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
迅速摇匀，Βιβλιοθήκη Baidu温下反应 5 min，加入三氯乙酸终止反应。 10% 三氯乙酸 ╲ ╲ 0.5 0.5 0.5 0.5
1、脲酶（urease）的基本生化性质
① 脲酶广泛分布于植物种子中，也存在于某些微生物中。 刀豆、大豆、黄豆中含量丰富。 ② 脲酶催化脲的水解反应，专一性高，生成氨与CO2。 ③ 脲酶为寡聚酶， Urease crystals ( X 728) 分子量约为483 KD, Sumner, J. B. (1926) 等电点为4.8, “ The isolation and crystallization of the 最适pH 7.0。 enzyme urease” J. Biol. Chem. 69:435-441. ④ Km与来源及测定条件 有关，参见表1。
1.00
1.00
（7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5 min，立即向样品管（3号管）加10%三氯乙酸 1.00 mL，终止反应。各管摇匀后，取1.0 ml溶液置于EP管中，室温、10,000 rpm离心 5 min，吸取0.2 ml上清按步骤（8）进行反应。 （8）另取3支洁净的试管，分别对应于上述各管，进行后续反应。 ① 反应液（mL） ② 蒸馏水（mL） ③ 奈氏试剂（mL） 比色记录A480nm 0.20 4.30 0.50 0.20 4.30 0.50 0.20 4.30 0.50
1 1 测A480，并计算反应速度。以 为纵坐标， 为横坐 [s] v
标作图，由图判断磷酸盐对脲酶的抑制类型。
显色 10 min，摇匀，室温、10,000 rpm 离心 10 min，取上清于 480 nm 处测光吸收值。
结果与分析
△ 将测定结果列表：
编号 A480 A标-A空 A样-A空 V [S] [S]/v 1 2 3 4 空白管 标准管
△ 以[S]/v对[S]作图，求取Km和Vm。 思考：上述动力学参数的求取在实验设计上是否严密？ 若不够严密，请你提出改进的方案。
表1 脲酶Km与来源、测定条件的关系
来源 刀豆 缓冲液类型 Tris-硫酸 pH 7.0 8.0 Tris-盐酸 7.4 7.0 温度（℃） 25 21 25 38 25 Km（mol/L） 5.1×10-3 4.0×10-3 4.0×10-3 3.3×10-3 3.0×10-3
√
大豆
Tris-硫酸
摇匀各管，分别取 1.0 ml 溶液置于 EP 管中，室温、10,000 rpm 离心 10 min，各取 0.2 ml 上清按下表加样。这里，需准备另外6只洁净的试管。 反应液 ddH2O 奈氏试剂 0.2 4.3 0.5 0.2 4.3 0.5 0.2 4.3 0.5 0.2 4.3 0.5 0.2 4.3 0.5 0.2 4.3 0.5
2、脲酶活性的测定
试管号
步 骤
（1）酶液（mL，原液或适当稀释） （2）标准硫酸铵溶液（mL） （3）蒸馏水（mL）
1 0 0 2.00
2 0 0.30 1.70
3 1.00 0 1.00
（4）10%· 三氯乙酸 (mL)
（5）室温平衡5 min。 （6）3%尿素（mL）
1.00
1.00
0
1.00
（纳氏试剂） （碘化氨氧合汞）
奈氏试剂法试剂昂贵 但较为精确
三、实验器材与试剂
1. 粉碎机、试管、烧杯、离心机(离心管)、分光光度计等。 2. 脲酶提取液（粗酶液），使用时可以磷酸缓冲液适当稀释。
3. 标准脲（尿素）溶液：0.01, 0.02, 0.04, 0.08 mol/L。
3%脲的磷酸盐溶液（5.4%磷酸氢二钠- 4.25%磷酸二氢钾） 4. 磷酸盐缓冲液（PBS, pH7.0）：0.1, 0.4, 0.8 mol/L。 5. Tris-H2SO4缓冲液：50 mmol/L, pH 5, 6, 7, 8, 9。 6. 标准硫酸铵溶液：40 mmol/L（即40 mmol/ml）
7.0
二、实验原理
2、脲酶活性测定原理
脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0。 反应式：
（NH2)2CO + H2O
2 NH3 + CO2
氨与奈氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度 成正比。故可以测定脲酶活力的大小。反应式： NH3· H2O + 2K2HgI4 + 3KOH → HgO· HgNH2I + 7KI + 3H2O
7. 奈氏试剂：配制方法参见教材；注意离心取上清，避光储
于棕色瓶中备用。 8. 人造沸石、2%乙酸、32%丙酮 √ 9. 10%（W/V）三氯乙酸（沉淀蛋白、终止酶反应！）
四、实验内容与操作步骤
1、脲酶的提取
① 称取5 g人造沸石，置小烧杯中，用2%乙酸浸泡两次，倾 去酸，用蒸馏水反复洗涤至中性，沥干备用。 √ ② 称取10 g新鲜大豆粉，置于锥形瓶中，加上述人造沸石， 再加入50 ml 32%丙酮溶液，冰浴中持续摇动15-20 min， 4℃、10,000 rpm离心15 min，收集上清液备用。 √ ③ 向②中沉淀加入10 ml 32%丙酮溶液，重悬，复抽提一 次（操作同上），两次上清合并，即为粗酶液。
② pH对脲酶催化速度的影响 ●取7只干燥试管，标以1-7序号。在1-5管中各加入0.5毫升 0.1M脲溶液，再分别加入1毫升0.1M的pH5，pH6，pH7， pH8，pH9的Tris-硫酸缓冲液，室温平衡5分钟后，分别 加入0.5毫升酶溶液，混匀。再于室温反应5分钟，然后在 各管立即加入0.5毫升10%三氯乙酸，终止反应，混匀， 按前法取出1.0 ml离心，取一定体积的上清与奈氏试剂显 色。6号管加入0.3毫升标准硫酸铵溶液，7号管加入0.5毫 升H2O作为空白，6、7号管各加1毫升H2O代替Tris—硫酸 缓冲液。室温平衡、加酶液等操作与1~5号管同时进行。 ●分别由各管吸取0.2毫升反应液依次加入另1′—7′各管中， 各加4.3毫升H2O，摇匀，再加0.50毫升奈氏试剂，摇匀。 测A480，并计算反应速度。 ●以v为纵坐标，pH为横坐标作出v-pH图，求脲酶最适pH。