蛋白质的测定使用凯氏定氮法解说

❖ 〖注意〗 ❖ ①加入NaOH一定要过量，判断NaOH是否过量的方法，看反应
室内液体颜色
❖ 加碱足量的判断：
❖ 溶液会变成深蓝色或产生黑色沉淀
❖ 原理：过量的氢氧化钠会跟硫酸铜反应生成氢氧化 铜蓝色沉淀，蓝色沉淀在加热的情况下会分解成黑 色的氧化铜沉淀。
❖ 如果没有上述现象，说明氢氧化钠加的量不足，需 要继续加入氢氧化纳，直到产生上述现象为止。
项目七 食品中蛋白质及氨基
酸态氮的测定
【学习目标】
❖ 1、掌握食品中氮含量与蛋白质含量之间的换 算。
❖ 2、掌握凯氏定氮装置的搭建技术。 ❖ 3、掌握蛋白质的测定技术。
【基础知识】
❖ 1、蛋白质及氨基酸概述
❖ 蛋白质由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物， 它主要含的元素是C、H、O、N。
❖ 子任务1：仪器及试剂的准备 ❖ 仪器： ❖ 25mL酸式滴定管1套
❖ 试剂 ❖ 0.0500mol/L HCL标准溶液
子任务2：盐酸滴定
❖ 接收瓶 以HCL标准滴定液滴定 灰色终点
记录VHcl
（1）硼酸吸收 液的颜色
（2）吸收氨气 后的硼酸吸收液
的颜色
（3）盐酸滴定 终点的颜色
❖ 〖注意〗
❖ ①混合指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中 呈灰色,在酸性溶液中呈红色。
样品（2N
）
H
2SO 4 催化剂 消化
(NH
4
)
2
SO
4
NaOH 蒸馏
2NH
3
Biblioteka Baidu
H3BO 3（ 吸收
NH 4 )2 B4O7
2HCL 滴定
结果处理
❖ 氨基酸～HCl～N ❖ 〖注意〗
❖ 此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶 啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗pro。
❖ ②酸式滴定管的正确使用
任务四、数据记录与计算
项目名称
检测日期
样品名称
检验依据
内容
1
2
样品质量m/g
V初 /mL V终 / mL 消耗的体积V1 /mL 吸取消化液体积V3 /mL 蛋白质含量（g/100g）
平均值（g/100g）
两次测定之差/平均值
精密度Cy
3 空白
（g/100g） F：牛乳及其制品的蛋白质换算系数6.38
❖ （2）特点
❖ 快速、污染少、操作简单、省时
❖ 国家标准测定蛋白质第二法
❖ 2、改良式凯氏装置
江苏畜牧兽医职业技术学院
泰州市质监局
❖ 3、自动凯氏定氮法
1.原理 同常量凯氏定氮法
2.主要仪器 自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸 收和滴定装置以及自动数字显示装置。 消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红外加热装置组 合成的消化炉。
（g/100g）
❖ 有效数字： ❖ 蛋白质含量≥1 g/100 g时，结果保留三位有效数字 ❖ 蛋白质含量＜1 g/100 g时，结果保留两位有效数字。 ❖ 精密度： ❖ 在重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不
得超过算术平均值的10%
步骤 湿法消化
碱化蒸馏 硼酸吸收 盐酸滴定
小结
反应前后颜色变化
数
初读
数
末读 消耗 数 体积
加甲醛后
初读 末读 数数
消耗 体积 V1
空白滴定 V2
1
2 氨基酸态氮含量X（g/100mL）= 平均值
精密度
2.样品中游离酸中和
❖ 吸取5mL试样→100mL容量瓶中→定容→混匀后吸取 20.0mL→200mL烧杯→加水60mL→插入酸度计的指示 电极和参比电极→开动磁力搅拌器→0.050mol/L氢 氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2→记录消耗 体积
任务二：碱法蒸馏、硼酸吸收
❖ 子任务1：仪器及试剂的准备 ❖ 仪器：
10mL
100mL 3只
子任务1：仪器及试剂的准备
❖ 水蒸气发生器： ❖ 装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基橙指示剂
数滴及硫酸数ml，使水呈微红色→按上图所示搭好 装置
❖ 〖注意〗 ❖ ①装置搭建好了之后要先进行捡漏，利用虹吸原理。 ❖ ②在蒸汽发生瓶中要加甲基橙指示剂数滴及硫酸数ml以使其
❖ 若要测定样品的蛋白氮,则需要向样品中加入三氯乙酸溶液, 使其最终浓度为5%,然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入
三氯乙酸溶液后样品中的含氮量,进一步计算出蛋白质含量:
蛋白氮=总氮-非蛋白氮
任务五：试验器具的清洗整理
【拓展学习】
❖ 1、其他蛋白质测定方法——分光光度法 ❖ （1）原理
❖ 食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与 硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8 的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中 与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm下测定吸光度值，与 标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。
❖ ⑥在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断 汽,否则会发生倒吸。
❖ ⑦蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，再蒸1分钟， 将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开， 最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。
❖ ⑧所用的试剂溶液 必须用无氨蒸馏水配制。
任务三：盐酸滴定
为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为 5.70、全小麦、大麦、燕麦、裸麦和小米是5.83；硬果类为5.30；牛乳 及其制品为6.38。
2、原理
❖ 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾 一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫 酸胺。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸 标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质 的含量。
❖ ②样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，为防止样液 中氨气逸出。一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要水 封，三要夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽，四要在蒸馏过程 中要注意接头处有无松漏现象
❖ ③加热蒸馏出来的氨可以用硼酸进行吸收，因为硼酸只 呈微弱酸性，不影响指示剂的变色反应，但是具有吸收 氨的作用，与氨形成强碱弱酸盐 。
任务一：相关仪器设备及试剂的准备
❖ 仪器设备：碱式滴定管、移液管、200mL烧杯、100 容量瓶、酸度计、磁力搅拌器、滴定台
❖ 试剂：浓度为36%中性甲醛；氢氧化钠标准溶液： 0.05mol/L（需临用前标定）
任务二：成分分析
1.原始记录表格的设计
项目名称
检测日期
样品名称
检验依据
加甲醛前
样品滴定次
子任务2：碱化蒸馏、硼酸吸收
❖ 10.0mL硼酸溶液 100mL三角瓶 加1～2滴混合指 示剂 冷凝管下端插入三角瓶液面下 准确吸取 10mL试样 由小玻杯流入反应室 少量水洗涤小 漏斗 盖紧玻璃塞 量筒取10.0mLNaOH溶液 倒 入小玻杯 提起玻塞使其缓慢流入反应室 立即 塞紧玻璃塞 加水于小玻杯防漏气 通蒸汽 颜色变化时开始计时蒸馏5min 移动接受瓶使液 面离开冷凝管下端 再蒸馏1min 用少量水冲洗 冷凝管下端外部 取下接收瓶
❖ ④冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。吸 收液温度不应超过40℃，避免氨气逸出，若超过时可置 于冷水浴中使用。
❖ ⑤检验蒸馏是否完成的方法：奈氏试纸法。原理:NH4+或 NH3遇奈氏试剂会反应生成综红色的碘化汞铵化合物，如 NH4+或NH3含量较少，试纸呈黄色，若含量过多，呈棕黄 色或棕红色的沉淀反应
4.空白试验
❖ 取80mL蒸馏水→200mL洁净烧杯→先用氢氧化钠标准 溶液滴定pH8.2→加入10.00mL中性甲醛溶液→用氢 氧化钠标准溶液（0.050mol/L）滴定至pH9.2→记录 消耗体积V2
5.数据处理
❖ 精密度：在重复性条件下的两次独立测定结果的绝 对差值不得超过算术平均值的10%
任务三：试验器具的清洗整理
知识回顾 Knowledge Review
始终保持酸性，以防水中氨蒸出。
子任务1：仪器及试剂的准备
❖ 试剂： ❖ 40%氢氧化钠 ❖ 20%硼酸溶液 ❖ 混合指示剂
❖ 1、1份甲基红乙醇溶液（1g/L）与5份溴甲酚绿乙醇溶液 （1g/L）临用时混合 酒红色→绿色
❖ 2、2份甲基红乙醇溶液（1g/L）与1份亚甲基蓝乙醇溶液 （1g/L）临用时混合 紫红色→绿色
b消化完全的指示剂：蓝绿色，澄清，透明；
c蒸馏时碱性反应的指示剂：变深蓝色或产生黑 色沉淀
硫酸钾 提高溶液沸点，从而加快有机物分解
浓硫酸 氧化作用：有机物质氧化分解为H2O和CO2
子任务2：样品预处理
样品充分混匀
固体试样 0.2~2g 半固体试样 2~5g 液体试样 10~25g
直接消化
子任务3：样品称量、消化
3、试剂 除硫酸铜与硫酸钾制成片剂外，其他试剂与常量测定相同。
4、优点 灵敏、准确、快速以及用量少
准确称取某乳粉样品0.800克，经凯氏法消化定容至100ml， 移 取 5ml 消 化 液 进 行 蒸 馏 ， 用 20ml 硼 酸 吸 收 ， 再 用 0.05000mol/lHCl滴定，结果消耗5.00ml，试计算该乳粉的 蛋白质含量？
1.000g奶粉 0.2g硫酸铜 6g硫酸钾 20mL浓硫酸 玻璃珠
轻摇
小火加热炭化 至泡沫完全停止
大火加热 保持瓶中液体微沸
同时做试剂 空白试验
冷却 加20mL水 冷却
至蓝绿色澄清透明 继续加热0.5～1h
思考
❖ 1、玻璃珠的作用？ ❖ 2、小漏斗的作用？ ❖ 3、消化过程为什么要不断转动凯氏瓶？ ❖ 4、开始消化时为什么用小火？ ❖ 5、消化液不易澄清透明时可采用的措施？ ❖ 6、消化完成时的产物？ ❖ 7、加20mL水的作用？ ❖ 8、空白试验的目的？
❖ 一般来说，pro的平均含氮量为16/100，既一份氮相当于 6.25份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。
❖ 所以在用凯氏定氮法定量pro时，将测得的总氮%乘上pro的 换算系数K=6.25即为该物质的pro含量。
❖ 注意： ❖ ①含N是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。 ❖ ②不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等
3.滴定样品中氨基酸酸基含量
❖ 上述烧杯→加入10mL甲醛溶液→混匀→再用 0.05mol/L氢氧化钠标准的溶液继续滴定至pH9.2→ 记录消耗体积V1
【拓展】
❖ 本法原理： ❖ 氨基酸含有酸性的-COOH和碱性的-NH2，它们相互作
用使氨基酸成为中性的内盐，不能直接用碱液滴定 它的羧基。当加入甲醛时，氨基与甲醛结合，其碱 性消失，使羧基显示出酸性，这样就可以用氢氧化 钠溶液滴定-COOH，并用间接法测定氨基酸的总量。
凯氏烧瓶：样品无色（加硫酸前）→加 硫酸炭化黑色→消化后红棕色→ 棕褐 色→消化终点蓝绿色/墨绿色→淡蓝色
（冷却后溶液） 反应室：深蓝色或黑色沉淀
紫红色→绿色
甲基红和溴甲酚绿混合指示剂：绿色→灰色 甲基红和亚甲基蓝混合液：绿色→蓝紫色
❖ 凯氏定氮法用于所有动物、植物类食品的蛋白质含量的测 定，但因样品中含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及 含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以测定结果为粗蛋白 质含量。
试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消 化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？
样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶 液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？ 须采用什么措施？
❖ 子项目二 ❖ 14酱油中氨基酸态氮的测定
（GB/T 5009.39-2003 ）
3、适用范围
❖ 国家标准第一法 ❖ 适用于各种食品中蛋白质的测定
4、任务分解
❖ 任务一：湿法消化
❖ 任务二：碱法蒸馏
❖
硼酸吸收
❖ 任务三：盐酸滴定
❖ 任务四：数据记录与计算
任务一：湿法消化
❖ 子任务1：仪器及试剂的准备
❖ 仪器：
子任务1：仪器及试剂的准备
试剂
作用
硫酸铜
a催化作用：加速有机物的氧化分解。