金属β-内酰胺酶综述

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新德里金属β-内酰胺酶(NDM-1)的标记与抑制研究

新德里金属β-内酰胺酶（NDM-1）的标记与抑制研究β-内酰胺类抗生素（包括青霉素、头孢、碳青霉烯类和单环β-内酰胺类等）是目前临床上使用最为广泛的一类抗生素。

然而,抗生素的滥用和监管缺失加剧了细菌耐药性的产生,抗生素耐药已经严重威胁到人类的生命健康。

金属β-内酰胺酶（Metallo-β-lactamases,MβLs）是细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要因素。

近年来,携带新德里金属β-内酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1）的超级细菌在全球的传播引发了一场严重的生物医学危机,携带这种酶的细菌几乎可以水解所有的β-内酰胺类抗生素。

由于它编码的质粒基因可以水平地在不同细菌之间传递和其水解底物的广谱性,使得对于它的监测和抑制成为临床上很大的挑战。

因此,对于NDM-1的监测、标记和抑制研究对人类健康具有极其重要的学术和应用价值。

基于这一思路,本文进行了以下两个方面的工作研究:1.基于NDM-1活性位点结构中的半胱氨酸（Cys）,发展合成了18个NDM-1的共价抑制剂―1,2-苯并异噻唑-3-酮类衍生物（Ebsulfurs）,通过1H和13C NMR 及HRMS对其结构进行了表征。

酶动力学研究发现,合成的Ebsulfurs化合物（除1a-b和1f）均对NDM-1展现出良好的抑制活性,IC50值范围为0.16–9μM,且是一种浓度和时间依赖性抑制剂。

同时,Ebsulfurs能协同抗生素提高其抗菌活性,其中,1g、1i和1n在浓度为16μg/mL时,使得头孢唑啉对产NDM-1的大肠杆菌的抗菌活性提高了256倍。

平衡透析研究表明,Ebsulfurs使得NDM-1中一个Zn（II）的活性中心解体,并释放出了一个Zn（II）。

将荧光分子罗丹明B引入到Ebsulfurs,成功构建了一个荧光抑制剂Ebs-R,通过SDS-PAGE和荧光共聚焦显微镜在体外和体内对NDM-1进行了标记和可视化研究,进一步证实了Ebsulfurs和靶蛋白的共价结合。

耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌的研究进展

㊃综述㊃D O I:10.3969/j.i s s n.1672-9455.2023.23.027耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌的研究进展*孔娜娜1,严育忠2,杨德平1综述,刘维薇1ә审校1.上海中医药大学附属龙华医院检验科,上海200032;2.上海健康医学院附属周浦医院检验科,上海201318摘要:高毒力肺炎克雷伯菌(h v K P)的致病性强且携带多种毒力基因,常导致严重的社区获得性感染,以及合并眼内炎㊁败血症等其他部位的迁徙性感染㊂虽然传统观点认为h v K P对抗菌药物的灵敏度高,但近年来陆续发现了对碳青霉烯类抗菌药物耐药的h v K P(C R-h v K P),高毒力与高耐药的C R-h v K P给临床治疗带来了极大挑战㊂本文综述了C R-h v K P的流行现状㊁毒力影响因素及耐药播散机制的研究现状,以期为C R-h v K P的防治提供理论依据㊂关键词:肺炎克雷伯菌;高毒力;高黏液表型;碳青霉烯耐药中图法分类号:R378.996文献标志码:A文章编号:1672-9455(2023)23-3531-06 R e s e a r c h p r o g r e s s o f c a r b a p e n e m-r e s i s t a n t h y p e r v i r u l e n t K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e*K O N G N a n a1,Y A N Y u z h o n g2,Y A N G D e p i n g1,L I U W e i w e i1ә1.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y,L o n g h u a H o s p i t a l A f f i l i a t e d t o S h a n g h a i U n i v e r s i t y o f T r a d i t i o n a lC h i n e s e M e d i c i n e,S h a n g h a i200032,C h i n a;2.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y,Z h o u p u H o s p i t a lA f f i l i a t e d t o S h a n g h a i U n i v e r s i t y o f M e d i c i n e a n d H e a l t h S c i e n c e s,S h a n g h a i201318,C h i n aA b s t r a c t:H y p e r v i r u l e n t K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e(h v K P)i s h i g h l y p a t h o g e n i c a n d c a r r i e s a v a r i e t y o f v i r u-l e n c e g e n e s,w h i c h o f t e n l e a d s t o s e r i o u s c o mm u n i t y-a c q u i r e d i n f e c t i o n s,a n d m i g r a t o r y i n f e c t i o n s a s s o c i a t e d w i t h e n d o p h t h a l m i t i s,s e p t i c e m i a a n d o t h e r p a r t s.A l t h o u g h t h e t r a d i t i o n a l v i e w h o l d s t h a t h v K P i s h i g h l y s e n-s i t i v e t o a n t i b a c t e r i a l d r u g s,c a r b p e n e m-r e s i s t a n t h y p e r v i r u l e n t K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e(C R-h v K P)h a s b e e n f o u n d i n r e c e n t y e a r s.C R-h v K P w i t h h i g h v i r u l e n c e a n d h i g h d r u g r e s i s t a n c e h a s b r o u g h t g r e a t c h a l l e n g e s t o c l i n i c a l t r e a t m e n t.T h i s a r t i c l e r e v i e w s t h e e p i d e m i c s t a t u s,v i r u l e n c e i n f l u e n c i n g f a c t o r s,d r u g r e s i s t a n c e a n d d i s s e m i n a t i o n m e c h a n i s m o f C R-h v K P,i n o r d e r t o p r o v i d e t h e o r e t i c a l b a s i s f o r t h e p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t o f C R-h v K P.K e y w o r d s:K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e;h y p e r v i r u l e n t;h i g h m u c u s p h e n o t y p e;c a r b a p e n e m-r e s i s t a n c e肺炎克雷伯菌(K P)是一种机会致病菌,可在尿道㊁呼吸道㊁血液和软组织中引起传染病㊂根据K P的表型和基因型特征,可将K P分为经典K P(c K P)和高毒力K P(h v K P)㊂h v K P的毒力高于c K P,具有独特的表型特征(如高黏液型㊁特殊血清型)和基因型特征(如携带特殊的毒力基因),其临床致病力更强,不仅能感染免疫功能低下的人群,还能使免疫功能正常的年轻人群发生重症社区获得性感染,如化脓性肝脓肿㊁眼内炎和脑膜炎甚至骨髓炎等㊂碳青霉烯类抗菌药物作为一种广谱抗菌药物,是临床治疗多重耐药革兰阴性细菌感染的最后一道防线㊂近年来,这类抗菌药物在临床的广泛应用导致耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(C R K P)的检出率逐年升高,C R K P已成为危害患者生命健康的重要病原体㊂h v K P和C R K P可通过获得携带碳青霉烯耐药基因或毒性编码基因的质粒而进化为耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌(C R-h v K P),此外,c K P也可通过获得携带碳青霉烯耐药基因和高毒力基因的杂交质粒进化为C R-h v K P[1]㊂C R-h v K P兼具多重耐药和高毒力特性,其引起的感染常累及多个部位或发生侵袭性转移,且目前缺乏有效的治疗药物[2]㊂C R-h v K P已经在全球范围内传播,对人类公共卫生构成了巨大威胁㊂本文对近年来C R-h v K P的研究进展进行了简要综述㊂1 C R-h v K P的流行情况自20世纪80年代中期以来,被称为h v K P的特殊K P谱系在世界范围内出现,可导致患者多部位发㊃1353㊃检验医学与临床2023年12月第20卷第23期 L a b M e d C l i n,D e c e m b e r2023,V o l.20,N o.23*基金项目:上海市浦东新区卫生健康委员会青年科技项目(P W202113-07)㊂ә通信作者,E-m a i l:h u a s h a n v i v i a n@126.c o m㊂生转移性传播的化脓性感染(如肝脓肿㊁骨髓炎和眼内炎),甚至在免疫力强的宿主中也是如此,因此h v K P引起的感染逐渐成为全球关注的重点㊂近年来,由于碳青霉烯类抗菌药物在临床中的广泛应用及不合理使用,碳青霉烯耐药基因和耐药质粒在菌株间水平传播,全球各地陆续出现C R-h v K P感染的相关报道㊂2018年G U等[3]首次从肝脓肿继发血流感染患者中分离出S T11型C R-h v K P㊂同年AM I R等[4]报道了一家医院I C U内实施机械通气的5例患者暴发C R-h v K P的院内感染,并导致4例患者死亡㊂2019年,K A R L S S O N等[5]从门诊患者中分离出1株S T23型C R-h v K P,该菌株携带高毒力基因和碳青霉烯酶编码质粒㊂2020年C H E N等[6]对5年间住院患者的556株C R K P进行回顾性研究,分离到18株均携带p K P C-2耐药质粒的C R-h v K P㊂2021年埃及一家医院分离出1株同时携带b l a K P C-2和b l a N D M-1基因的C R-h v K P[7]㊂不同国家C R-h v K P的S T分型表现出一定的地域差异,美国㊁印度㊁俄罗斯㊁埃及㊁意大利等国家的C R-h v K P以S T11㊁S T23和S T258型为代表㊂亚洲是C R-h v K P感染的主要流行地区,以中国㊁印度和新加坡为代表,其中,中国报道的C R-h v K P感染的病例数量最多,最常见的序列类型为S T11,其次是S T23㊁S T25和S T65㊂欧洲主要的碳青霉烯耐药基因是b l a N D M㊁b l a O X A基因,而b l a K P C-2基因在美国更为普遍㊂在中国,C R-h v K P中广泛存在b l a K P C-2基因,在其他亚洲国家如印度㊁伊朗,b l a O X A和b l a N D M基因更为常见㊂日本的一项研究发现,亚胺培南水解酶(I M P)的检出率为100%[8]㊂2020年,苏丹报道了10株同时携带b l a N D M和b l a O X A-48基因的C R-h v K P[9]㊂此外,在过去两年里埃及报道了2例S T11型C R-h v K P感染病例,其中1株同时携带b l a K P C-2和b l a N D M-1基因[7],而另1株同时携带b l a K P C-2和b l a O X A-48基因[10]㊂2 C R-h v K P毒力影响因素尽管世界各国对h v K P的定义未不统一,但一些遗传特征被认为是毒力菌株的标志㊂这些遗传特征主要包括2种:(1)黏液样表型调节因子的辅助毒力因子,包括r m p A㊁r m p A2基因及高黏性和高毒力所必需的r m p D基因;(2)铁载体(S P s)系统,包括有氧肌动蛋白(i u c A B C D)㊁尿囊素㊁大肠杆菌肌动蛋白㊁耶尔森菌素和沙门菌素生物合成位点[11]㊂其他毒力因子可能参与编码铁代谢和转运,血红素和赖氨酸转运系统,代谢转运蛋白和毒力基因表达㊁转录㊁调控蛋白质的过程[12]㊂2.1荚膜多糖在血琼脂平板上,C R-h v K P通常呈高黏液性,高黏液表型通常由拉丝试验确定,即当某个菌落通过接种环拉伸长度>5mm时,拉丝试验结果为阳性㊂C R-h v K P的高黏液表型通常与毒力相关㊂荚膜多糖是构成C R-h v K P荚膜的重要组成成分,与C R-h v K P的高黏液性密切相关,可以保护细菌免受有害环境因素的影响,并提高细菌的毒力㊂荚膜多糖的合成受多种基因调控,其中质粒p-L V P K上的2个质粒携带基因(p-r m p A和p-r m p A2)和染色体携带的c-r m p A基因是荚膜多糖合成的重要调节因子[13]㊂r m p A基因的过表达能增加K P在小鼠感染模型中的毒力,这表明高毒力表型与r m p A基因的过表达相关[14]㊂但也有研究表明,高黏液表型与毒力之间并无相关性㊂一项在中国9个地区收集28株C R K P的回顾性研究发现,其中2株不携带r m p A基因的C R K P的拉丝试验结果仍呈阳性㊂此外,5株C R K P携带r m p A基因,但在拉丝试验中结果呈阴性[15]㊂因此,拉丝试验不是识别h v K P的一种灵敏㊁特异的方法㊂根据荚膜多糖的结构和抗原性,可将K P分为多种血清型,已知的荚膜血清型有82种㊂目前的研究显示C R-h v K P以毒力最强的K1和K2血清型最为多见,其次是K47㊁K64㊂C R-h v K P的血清型与S T分型之间表现出一定的相关性,K1血清型以S T23型为主,K2血清型以S T65型和S T86型为主,Y A N G 等[16]研究报道K47㊁K64血清型均以S T11型为主㊂因此,荚膜多糖可能与细菌毒力有关或可增强毒力,但并不是唯一的细菌毒性决定因素㊂2.2铁载体(S P s) S P s系统对于C R-h v K P的生长繁殖至关重要,同时也是C R-h v K P重要的毒力因子㊂C R-h v K P侵入宿主时可释放S P s㊂S P s可从宿主体内的结合蛋白中获得铁离子,然后与S P s特异性受体结合,重新进入细胞㊂最终,C R-h v K P摄铁生长[17]㊂有研究发现,较高的摄铁能力可介导细菌毒力增强,相关的S P s有耶尔森菌素㊁沙门菌素㊁肠杆菌素和气杆菌素[18],其中气杆菌素是h v K P毒力的主要决定因素,涉及的毒力基因包括i r p㊁i r o㊁e n t㊁i u c㊁a e r o b a c-t i n等基因㊂此外,细菌菌毛介导与宿主细胞接触或黏附于黏膜表面是C R-h v K P感染机体的重要介质,涉及的毒力基因包括f i m㊁m r k等基因㊂3 C R-h v K P的碳青霉烯类耐药机制造成K P对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要原因㊃2353㊃检验医学与临床2023年12月第20卷第23期 L a b M e d C l i n,D e c e m b e r2023,V o l.20,N o.23是产碳青霉烯酶,碳青霉烯酶是一种可以水解头孢菌素类㊁青霉素类及碳青霉烯类抗菌药物的广谱β-内酰胺酶,是治疗革兰阴性菌感染的最后一道防线㊂近年来这类抗菌药物在临床的广泛应用加速了耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的出现,K P已成为最常见的耐碳青霉烯类肠杆菌㊂2016年R A F I Q等[19]研究报道因膜孔蛋白(O m p)K36突变,在缺乏碳青霉烯类耐药基因的情况下,h v K P表现出对碳青霉烯类抗菌药物耐药的现象㊂2018年浙江大学附属第二医院的5例术后患者在住院期间感染了携带K P C-2基因的K1-S T11型h v K P,患者最终因对多种抗菌药物耐药而死亡,该细菌被命名为S T11型C R-h v K P[3],通过对该细菌进行研究发现其高毒力是由约170k b p大小的p L V P K-l i k e毒力质粒进化而来,当敲除该质粒后其毒力大幅下降㊂通过对目前文献进行总结分析,提示C R-h v K P对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制可能存在以下4种途径:(1)h v K P获得碳青霉烯酶编码质粒;(2)C R K P获得h v K P携带的高毒力质粒,如p L V P K-l i k e毒力质粒;(3)h v K P在碳青霉烯类抗菌药物压力诱导下O m p缺失,产生耐药表型;(4)K P获得具有毒力和碳青霉烯耐药基因的融合质粒[1]㊂3.1 h v K P获得碳青霉烯酶编码质粒碳青霉烯类耐药基因编码的碳青霉烯酶在A m b l e r分子分类法中属于A㊁B㊁D类酶㊂A类碳青霉烯酶可以水解几乎所有的β-内酰胺类抗菌药物,常见的A类碳青霉烯酶包括K P C㊁S M E㊁NM C-A㊁I M I㊁G E S㊁S F C-l酶等㊂产K P C酶是K P对碳青霉烯类抗菌药物最常见的耐药机制,K P C酶有许多子类型,包括K P C-2到K P C-13㊂B类碳青霉烯酶又称金属-β-内酰胺酶,可水解带有β-内酰胺环的各种抗菌药物,常见的B类碳青霉烯酶主要包括N D M-1㊁V I M-1和I M P㊂D类碳青霉烯酶主要包括O X A-48和O X A-181㊂C R K P携带可移动碳青霉烯耐药基因的质粒㊁转座子和噬菌体,这些可移动基因原件可以水平转移到h v K P上,形成C R-h v K P㊂在中国和美国,K P C酶基因是最常见的碳青霉烯酶基因,K P C酶基因阳性的C R-h v K P在这些地区的报道也更多㊂一份报道显示,在美国最常见的b l a K P C酶基因亚型是b l a K P C-2和b l a K P C-3基因,在亚洲(特别是中国)和欧洲,最常见的类型是b l a K P C-2基因[20]㊂2014年美国首次报道了一种具有高黏液表型的S T23型K P,该菌株携带b l a K P C-2基因,并进化为耐多药C R-h v K P,2015年中国报道了5株K1型h v K P通过获得携带b l a K P C-2基因的毒力质粒或结合b l a K P C-2基因的可移动D N A片段形成K1型C R-h v K P[21]㊂值得注意的是,B㊁D类碳青霉烯酶基因的传递主要依赖于质粒,故它们的分布更具区域性㊂B㊁D类碳青霉烯酶主要分布在印度㊁伊朗等亚洲国家和俄罗斯㊁意大利等欧洲国家㊂C R-h v K P分离株大多数是O X A-48阳性菌株,其次是N D M-1和V I M-1阳性菌株㊂在2018年,俄罗斯研究人员首次报道了S T23型h v K P同时携带β-内酰胺酶C T X-M-15基因和碳青霉烯酶O X A-48基因的质粒,并进化为C R-h v K P[22]㊂同年,伊朗的一项调查报道了5株携带b l a V I M-2基因的罕见K1-S T23型C R-h v K P,其中4例患者在住院期间死亡,表明此类C R-h v K P具有高毒力[4]㊂此外,一项中国的研究报道了一种罕见的I M P 阳性菌株C R-h v K P X H210,该菌株具有S T17K L38/ O2血清型,携带耐药质粒p X H210-I M P和b l a I M P-4基因[22],实验结果表明p X H210-I M P能从X H210转移到大肠杆菌和K P受体上,说明耐药质粒具有可转移性㊂此外,X H210在小鼠感染模型中表现出高毒力,但缺乏与高毒力相关的特征标记㊂上述研究表明,没有明显高毒力表型的h v K P可以通过获得b l a I M P-4基因进化为C R-h v K P㊂移动基因的水平传递是导致K P不断进化为C R-h v K P的关键因素㊂这些毒性菌株携带碳青霉烯耐药基因表明这些主要的医院病原体正在进化㊂尽管碳青霉烯酶的分布因地理特征而异,但全球移民等因素的增加可能导致这些细菌耐药机制与地区或城市之间的联系发生变化㊂因此,在检测C R-h v K P的相关耐药基因时,不能忽视低流行区㊂C R-h v K P同时产生2种或2种以上的碳青霉烯酶可引起严重的传染性疾病,导致患者病死率升高㊂许多国家和地区报道了这些类型的C R-h v K P,例如意大利和伊朗报道了产生N D M-1和O X A-48的C R-h v K P[23-24]㊂2022年埃及报道了同时携带b l a K P C-2和b l a O X A-48基因的C R-h v K P[10],该菌株分离株包含2个抗性质粒: p E B S I041-2(b l a O X A-48基因载体)和p E B S I041-3 (b l a K P C-2基因载体)㊂p E B S I041-3可以在质粒p E B-S I041-2的辅助下转移,在共转移过程中,2个质粒可以融合成1个携带b l a O X A-48和b l a K P C-2基因的更大的质粒㊂携带不同碳青霉烯类耐药基因的质粒可以通过基因重组㊁重排和融合质粒的形成而进行转移,导致C R-h v K P的耐药机制更加复杂㊂3.2 C R K P获得h v K P携带的高毒力质粒与高毒力菌株相比,多重耐药菌株更容易通过染色体重组产㊃3353㊃检验医学与临床2023年12月第20卷第23期 L a b M e d C l i n,D e c e m b e r2023,V o l.20,N o.23生广泛的表面多糖位点,更容易获得毒力质粒[25]㊂因此,通过移动毒力基因的水平转移,C R K P很容易进化为C R-h v K P㊂多项研究表明,获得p L V P K/ p L V P K-l i k e毒力质粒后,C R K P的毒力可以显著增强[26-27]㊂2018年中国一家医院报道了S T11C R-h v K P的暴发,5例患者感染C R-h v K P后死于严重肺炎,研究人员发现,所有C R-h v K P分离株的拉丝试验结果均呈阳性,并在中性粒细胞杀伤试验中显示出高毒力,此外,这些C R-h v K P分离株都携带170k b p的p L V P K-l i k e毒力质粒[3]㊂h v K P的毒力质粒可以单独水平转移到S T11型C R K P上,也可以与I n c F质粒结合形成S T11型C R-h v K P[28]㊂有趣的是,B O-L O U R V H I等[24]研究报道2株C R-h v K P由携带非结合毒力质粒的h v K P获得携带碳青霉烯耐药基因的质粒进化而来㊂最新研究表明,非结合毒力质粒可以整合其他携带结合转移基因的质粒,提高自身的传播能力㊂当这种新的结合质粒转移到大肠杆菌E C600或其他类型的K P时,其在小鼠感染模型中的毒力潜力可以显著提高[29]㊂这些C R-h v K P在获得毒力质粒后,表现出较强的毒力,具有高毒力传播能力[28],更容易在医院或社区引起暴发㊂3.3 O m p缺失产生耐药表型 O m p是存在于K P 等革兰阴性菌细胞外膜上的非特导性的㊁能跨越细胞膜的孔道蛋白,一些抗菌药物可经O m p进入细菌体内从而发挥杀菌作用㊂O m p C㊁O m p D㊁O m p E㊁O m p F 和P h o E是临床大肠杆菌中常见的O m p[30]㊂属于O m p C家族的O m p K36和属于O m p F家族的O m p K35在K P中很常见㊂在C R K P中,O m p K35和O m p K36水平的改变会产生重要影响㊂低水平O m p K35是超广谱β-内酰胺酶(E S B L)产C R K P耐药的重要机制之一㊂O m p K36可降低C R K P对E S B L 和β-内酰胺酶(A m p C)的灵敏度,与C R K P对碳青霉烯类耐药密切相关㊂仅仅缺乏O m p不会导致K P对亚胺培南耐药,只会增加其最低抑菌浓度(M I C)㊂只有在合并其他抗药性机制时,K P才能对亚胺培南耐药,通常与高水平产E S B L s或A m p C酶耐药机制共同作用引起K P对亚胺培南耐药㊂2009年,一项对28株C R K P的研究发现,9株耐厄他培南水平较高的C R K P始终缺乏O m p K35和O m p K36[31]㊂对O m p K35和O m p K36基因的测序显示,大多数分离株存在不同类型的破坏,包括点突变或插入序列(I S)突变,如I S1和I S10,这表明C R K P的碳青霉烯抗性特征可能受这些O m p突变的影响㊂2010年W E B-S T E R等[32]研究报道,同时丢失O m p K35和O m p K36可能使K P对美罗培南具有完全抗性㊂2015年Z H A N G等[15]从血液标本中分离出的C R-h v K P,该菌株对亚胺培南高度耐药,并证实其耐药机制为O m p K35㊁O m p K36水平降低,并产生E S B L s㊂3.4 K P获得携带毒力和碳青霉烯耐药基因的融合质粒近年来,许多研究报道了K P通过获得杂交质粒进化为C R-h v K P㊂杂交质粒的形成有2个重要的机制:一种是2个单链片段在特殊的融合位点发生变化形成杂交质粒,另一种是同源重组形成杂交质粒[28]㊂有研究人员在1株K2-S T86C R-h v K P中检测到了融合质粒p17Z R-91-V i r-K P C[33]㊂p17Z R-91-K P C质粒是由携带b l a K P C-2基因的圆形抗性质粒p17Z R-91-K P C在H R1和H R2同源区同源重组而成的㊂值得注意的是,p17Z R-91-V i r-K P C融合质粒可以在不同序列类型的菌株之间转移㊂S T11型h v K P 可以通过获得融合质粒进化为S T11型C R-h v K P,这是最流行的S T11型C R-h v K P的进化机制㊂2021年在中国的1株S T11㊁K64型C R K P中检测到杂交质粒p C R H V-C2244,该质粒携带一系列毒力基因,包括i r o B C D N㊁i u c A B C D-i u t A和r m p A2,以及碳青霉烯抗性基因b l a K P C-2基因㊂质粒上的多个I S26序列可以调节携带b l a K P C-2基因和毒力基因片段的重组,逆转质粒上的大序列片段,最终形成杂交质粒p C R H-V C2244[34]㊂因此,基因片段与插入元件之间的重组是杂交质粒形成的一种机制㊂此外,毒力质粒可以整合到染色体中,使细菌进化成毒力更强的菌株㊂2021年E G E R等[35]从1例严重感染患者的伤口中分离出2株h v K P,全基因组测序显示,高毒力基因i r o B-C D N㊁i u c A B C D/i u t A㊁r m p A/A2和p e g均位于插入染色体的特定区域㊂这表明毒力质粒可以整合到染色体中㊂进一步的分析表明,这些过程影响了染色体的功能,进化出的高毒菌株可以垂直传播㊂上述菌株染色体内整合的毒力质粒表明,h v K P可以通过向其他菌株水平转移基因进化,也可以通过垂直传播进化㊂4 C R-h v K P的治疗C R-h v K P作为耐碳青霉烯类肠杆菌(C R E)的一类细菌,目前的治疗方案大多参照C R E的治疗指南㊂碳青霉烯类抗菌药物是治疗C R E最为广泛使用的一线药物㊂美罗培南㊁美罗培南-法硼巴坦和亚胺培南-利巴坦通常用于儿童C R E感染疾病㊂总体而言,美罗培南-法硼巴坦可有效抑制产K P C酶的C R E菌株㊃4353㊃检验医学与临床2023年12月第20卷第23期 L a b M e d C l i n,D e c e m b e r2023,V o l.20,N o.23生长,具有较高的临床治愈率和较低的副作用,特别是肾毒性较低㊂P A S C A L E等[36]指出,高剂量持续输注美罗培南是治疗特殊情况下C R E的明智选择㊂然而,碳青霉烯类抗菌药物的使用导致耐碳青霉烯类生产菌株的数量增加,增强了临床治疗的难度㊂一些新的抗C R E的抗菌药物也是治疗C R E感染的良好选择,包括头孢他啶-阿维巴坦㊁替加环素联合疗法和多黏菌素㊂使用头孢他啶-阿维巴坦治疗C R K P在临床治愈率和生存率方面表现出良好的治疗效果㊂然而,头孢他啶水解活性高和O m p K35缺乏可能导致产K P C酶的S T11型C R K P对头孢他啶-阿维巴坦的灵敏度降低㊂因此,考虑到不同地区的流行病学情况和菌株产酶的特点,临床用药应因地制宜㊂5结语及展望C R-h v K P在许多国家已经普遍存在,其治疗选择也相对有限㊂质粒的转移及质粒在细菌间的融合和重组是C R-h v K P高突变率和高传播率的关键因素㊂今后的研究还应关注整合到染色体上的C R-h v K P毒力质粒的垂直传播,这可能会为研究C R-h v K P的分子机制带来新的发现㊂参考文献[1]R U S S O T A,MA R R C M.H y p e r v i r u l e n t K l e b s i e l l ap n e u m o n i a e[J].C l i n M i c r o b i o l R e 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h h i g h m o r t a l i t y r a t e i n I r a n[J].J G l o bA n t i m i c r o b R e s i s t,2018,15:93-98.[5]K A R L S S O N M,S T A N T O N R A,A N S A R I U,e t a l.I-d e n t i f i c a t i o n o f a c a r b a p e n e m a s e-p r o d u c i n g h y p e r v i r u l e n tK l e b s i e l l a p n e u m o n i a e i s o l a t e i n t h e U n i t e d S t a t e s[J].A n t i m i c r o b A g e n t s C h e m o t h e r,2019,63(7):e00519-19.[6]C H E N Y,MA R I MU T HU K,T E O J,e t a l.A c q u i s i t i o n o fp l a s m i d w i t h c a r b a p e n e m-r e s i s t a n c e g e n e b l a K P C-2i n h y-p e r v i r u l e n t K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e,S i n g a p o r e[J].E m e r gI n f e c t D i s,2020,26(3):549-559.[7]A HM E D M,Y A N G Y,Y A N G Y,e t a l.E m e r g e n c e o f h y-p e r v i r u l e n t c a r b a p e n e m-r e s i s t a n t K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e c o h a r b o r i n g a b l a N D M-1-c a r r y i n g v i r u l e n t p l a s m i d a n d a B l a K P C-2-c a 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v i r u l e n t K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e i s o l a t e i n E-g y p t[J].B M C G e n o m i c s,2022,23(1):1-9.[11]WY R E S K L,L AM M C,HO L T K E.P o p u l a t i o n g e n o m-i c s o f K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e[J].N a t R e v M i c r o b i o l,2020,18(6):344-359.[12]S A B R I N A N,G I O R G I O M,A L B E R T O A,e t a l.H y p e r-v i r u l e n t K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e s t r a i n s m o d u l a t e h u m a nd e n d r i t i c c e l l f u n c t i o n s a n d a f f e c t T H1/T H17r e s p o n s e[J].M i c r o o r g a n i s m s,2022,10(2):384.[13]L I U C,G U O J.H y p e r v i r u l e n t K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e(h y p e r-m u c o v i s c o u s a n d a e r o b a c t i n p o s i t i v e)i n f e c t i o n o v e r6y e a r s i n t h e e l d e r l y i n C h i n a:a n t i m i c r o b i a l r e s i s t a n c e p a t t e r n s,m o l e c-u l a r e p i d e m i o l o g y a n d r i s k f a c t o r[J].A n n C l i n M i c r o b i o l A n-t i m 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c tT h e r,2019,17(10):819-827.(收稿日期:2023-01-26修回日期:2023-08-22)㊃6353㊃检验医学与临床2023年12月第20卷第23期 L a b M e d C l i n,D e c e m b e r2023,V o l.20,N o.23。

金属β-内酰胺酶检测方法学研究进展

阳离子（主要是锌）的内酰胺酶，根据Ａｍｂｅ等口内酰胺酶分子结构的分类和ｌｒ一
一
Ｂｓｕｈ等对口内酰胺酶功能的分类，Ｌ分别属于Ｂ一ＭＢ类和第三类群。该酶广泛水解（括碳青霉烯类、包广
霉烯类抗生素耐药，用ＭＢ运Ｌ酶抑制剂、一口内酰胺类抗生素（用头孢他啶或亚胺培南）同增效原理。多协由于酶抑制剂对ＭＢＬ不同的抑制水平以及ＭＢＬ对头孢他啶或亚胺培南不同的抗性，待测细菌常易漏诊特别是肠杆菌属细菌，而且铜绿假单胞菌常因为外膜蛋白（ｒ水平的改变而出现假阳性结果，以目ＯｐＤ）所前还没有一个准确的表型检测方法用于所有ＭＢＬ的检测。随着ＭＢＬ种类、数量不断增加，种表型检测各
谱头孢菌素类等）多种ｐ内酰胺类抗生素，常用０烯类抗生素的ＭＩ假单胞菌属天然高于肠杆菌属，对一Ｃ，内酰胺酶抑制剂（克拉维酸、巴坦等）敏感。近所以没有严格的ＭＩ如舒不Ｃ限定标准，者建议当假单胞学十年来，得性ＭＢ在世界范围被广泛地发现，获Ｉ以菌属、动杆菌属和肠杆菌属对亚胺培南的ＭＩ分不Ｃ
ＩＭＰ、Ｍ型为主且可分为多种亚型。此外，ＶＩ还包括

β-内酰胺酶

TEM型酶分布很广，尤以TEMTEM型酶分布很广，尤以TEM-1型分布最广，出现频率最高，约占50%。染色体介导酶有K1型，现频率最高，约占50%。染色体介导酶有K1型， P99型及D31型，染色体基因决定细菌对抗生素 P99型及D31型，染色体基因决定细菌对抗生素固有耐药性，近代研究证明在院内感染病人中产生质粒介导酶的耐药菌，其产生耐药性大多是在接触抗生素后获得的，并通过耐药基因的转移而播散，也可由基因表达而传至下代。至今β-内酰播散，也可由基因表达而传至下代。至今β 胺酶的数量已超过200种，其中超广谱β 胺酶的数量已超过200种，其中超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamase,ESBL)已超 β-lactamase,ESBL)已超过50种。 50种。
2.2 B型β-内酰胺酶
B型β-内酰胺酶的活性依赖于2价过渡态金属内酰胺酶的活性依赖于2 离子，大多数情况下为Zn2+，此酶不被棒酸离子，大多数情况下为Zn2+，此酶不被棒酸抑制，但能被EDTA所抑制，按Bush分类属3 抑制，但能被EDTA所抑制，按Bush分类属3 群。按照核苷酸序列，此酶可分为2 群。按照核苷酸序列，此酶可分为2个亚型，一个亚型以L 酶为代表，另一亚型以A2酶和一个亚型以L-1酶为代表，另一亚型以A2酶和 CcrA酶为代表。L1酶和CcrA酶有相当广谱的 CcrA酶为代表。L1酶和CcrA酶有相当广谱的底物轮郭，能水解头孢西丁，也有报告可水解氨曲南。亚胺培南是A2酶的唯一底物，因解氨曲南。亚胺培南是A2酶的唯一底物，因此，A2酶也可称碳青霉烯酶。此，A2酶也可称碳青霉烯酶。
β-内酰胺酶
—细菌耐药性机制之一
柳州市中医院朱胜波
β-内酰胺类抗生素是目前临床抗感染治疗最普遍应用的一类抗生素，随着这类药物的广泛使用 (特别是滥用和误用)和致病菌的变迁，产生了病特别是滥用和误用) 原菌对药物的耐药性问题，而且耐药发生率相当高。细菌产生β 内酰胺酶(β-lactamase)是80%病高。细菌产生β-内酰胺酶(β-lactamase)是80%病原菌耐药的原因之一，另外约12%和8%病原菌原菌耐药的原因之一，另外约12%和8%病原菌 12% 的耐药分别与细菌细胞外膜通透性障碍和靶位的改变有关。本文对细菌产生β 改变有关。本文对细菌产生β-内酰胺酶所致的耐药性作一简要综述，以便采取相应对策以防止耐药性的蔓延。

金属β-内酰胺酶综述

金属类β-内酰胺酶β-内酰胺酶是革兰阴性杆菌对内酰胺类抗生素耐药的主要机制，细菌产生的β-内酰胺酶大部分系活性部位带丝氨酸残基的酶类，也有一小部分是活性部位为金属离子的酶类，称为金属β-内酰胺酶（metallo-β-lactamase,MBL），简称为金属酶。

金属β-内酰胺酶，属Bush分类3群，Ambler分类B类，该群酶最大特点是可以水解碳青霉烯类等抗生素，而对哌拉西林和氨曲南影响较小。

酶活性中心需金属锌离子的参与而发挥催化活性，故称为金属β-内酰胺酶。

底物为包括碳青霉烯类在内的一大类β-内酰胺抗生素，其活性不被常见的β-内酰胺酶酶抑制剂如克拉维酸等所抑制，但可被离子鳌合剂乙二胺四乙酸（EDTA）、菲咯啉或硫基化合物抑制所抑制。

金属β-内酰胺酶可由染色体和质粒介导，可在铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷菌、肠杆菌属菌、肺炎克雷伯菌、嗜水气单胞菌和不动杆菌、脆弱类杆菌属、等细菌中检出此类酶。

一、发现和分布第一个报道的金属酶是从蜡样芽孢杆菌( Bacill us cereus) 中发现的，该酶为锌依赖酶。

20 世纪80 年代初期日本从嗜麦芽窄食单胞菌中鉴定出第二种锌依赖青霉素酶L1 型酶，随后又从嗜水气单胞菌和脆弱拟杆菌中鉴定出多种能水解亚胺培南的金属酶。

这些酶都由染色体基因编码。

该类金属酶分布在蜡样芽孢杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、脆弱拟杆菌、气单胞菌属和戈氏军团菌中，除嗜麦芽窄食单胞菌外,在临床上都极为罕见,而且都是单株散发的。

1991年日本学者在铜绿假单胞菌中发现了第一种质粒介导的金属酶( IMP21) ，不久又从脆弱拟杆菌中发现了一种可转移金属酶，这两个酶的发现意味着金属酶已经从单株散发向随机分布过渡。

现在已报道了10多种可转移金属酶: IMP21～8 和VIM21～3，分布在铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌中，地域分布上已经不再局限于日本，现已分布至亚洲、欧洲和美洲的多个国家（见表1）。

金属β-内酰胺酶的研究进展

垦匾唑堕苤查！！！！堡箜！！鲞筮！塑！坐』垦望￡ｉ！！垒２１：！！！！！∑！！：！！：塑！：！金属１３一内酰胺酶的研究进展曹孟淑张德平【摘要】近年来随着碳青霉烯类药物在Ｉ临床的广泛使用，其耐药率逐年上升，在越来越多的耐药细菌中发现了金属酶，而金属酶对几乎所有的Ｂ一内酰胺类抗生素耐药。

本文就金属酶的流行病学、种类、检测及意义等方面研究作一综述。

【关键词】金属酶；流行病学；分类；检测’金属Ｊ３一内酰胺酶（ｍｅｔａｌｌｏ—ｂｅｔａ—ｌａｃｔａｍａｓｅｓ，ＭＢＬ）又称金属酶，是～类活性位点含有金属离子的Ｇ一内酰胺酶。

这些酶能够有效水解除单环类抗菌药物以外的几乎所有Ｂ一内酰胺类抗生素，使得致病菌对青霉素、头孢菌素和碳青霉烯类耐药，耐药基因由染色体或质粒介导，并在革兰阴性菌尤其是临床铜绿假单胞和其它非发酵菌中广泛传播。

因此产金属酶细菌引起的感染已经成为一个非常严重的问题，在临床上变得越来越重要。

１金属酶产生的流行病学特征自从１９８８年Ｂｕｓｈ将含金属离子的Ｇ一内酰胺酶定为金属酶以后，日本首先发现了铜绿假单胞菌所产生的金属酶（ｉｍｉｐｅｎｅｍ，ＩＭＰ）Ｌ１Ｊ，１９９１年出现ＩＭＰ—ｌ在革兰阴性菌中播散，随后新加坡、韩国和欧洲也出现了产金属酶的菌株，而欧洲则最早报道ＶＩＭ酶心］，２０００年以后中国台湾和香港、加拿大、美国陆续报道了不同类型的金属酶，２００１年中国广州首次报道了产ＩＭＰ一４的柠檬酸杆菌［３］。

所以从目前看来产金属酶的细菌已在全球范围内广泛存在。

产金属酶的细菌不仅波及范围广泛，在某些国家和地区有爆发流行的趋势，在不同的国家和地区流行菌株可能不同。

如１９９７～１９９８年间意大利发生产ＶＩＭ一１型的金属酶铜绿假单胞菌的爆发流行［４３；２００１～２００２年日本研究耐药革兰阴性菌发现ｌ类整合子携带的ＩＭＰ一１是日本的主要流行菌株［５３；韩国２０００～２００１年从全国２８家医院收集了对亚胺培南（ＩＭＰ）不敏感的细菌，其中６０．７％的医院中可检测到产ＭＢＬ的细菌，其中假单胞菌ＭＢＬ检出率１１．４％，不动杆菌检出率１４．２％［６］。

产新德里金属β-内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型

㊀２０２１,３７(１)中国人兽共患病学报C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e sD O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００２－２６９４．２０２０．００．１７９实验研究产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型傅芬蕊１,２,张㊀娅１,３,潘玉红１,４,曹颖平１,４,郑培烝１,４福建省自然科学基金(N o ．２０１６J ０１４６６)通讯作者:郑培烝,E m a i l :z h e n g p e i z h e n g ＠a l i y u n ．c o m ;O R C I D :００００Ｇ０００２Ｇ６３４２Ｇ０７４５作者单位:１．福建医科大学附属协和医院,福州㊀３５０００１;２．宁德市医院,宁德㊀３５２０００;３．九江学院附属医院,九江㊀３３２０００;４．福建医科大学医学技术与工程学院,福州㊀３５０００４摘㊀要:目的㊀研究某三甲医院临床分离的产新德里金属βＧ内酰胺酶(N D M )大肠埃希菌的耐药机制和分子流行病学特征.方法㊀在某三甲医院收集的耐碳青霉烯类大肠埃希菌中利用聚合酶链反应(P C R )筛查是否携带N DM 基因,通过测序确定N DM 型别并进一步检测其它碳青霉烯酶相关基因和广谱βＧ内酰胺酶类耐药基因.通过载体构建和表达研究N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６及N D M Ｇ９对亚胺培南的水解能力.采用多位点序列分型(M L S T )对产N D M 大肠埃希菌进行分子分型.结果㊀共筛选出８株携带N D M 大肠埃希菌,其中２株为N D M Ｇ９型,６株为N D M Ｇ６型.４株大肠埃希菌同时携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ１基因,１株同时携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ９基因.携带N DM Ｇ１㊁N DM Ｇ６与N DM Ｇ９重组菌对亚胺培南均耐药,最小抑菌浓度(M I C )分别为３２μg /m L ㊁１２８μg /m L 和６４μg /m L .产N D M 大肠埃希菌M L S T 分型结果为S T ２２６㊁S T ６４８和S T １２８４型各１株,S T １０１型５株,此５株均来源于神经内科.结论㊀首次发现同时携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ１基因和携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ９基因的大肠埃希菌,N D M Ｇ６㊁N D M Ｇ９对亚胺培南的耐药性比N D M Ｇ１强,应引起重视.M L S T 分型结果提示某三甲医院可能存在耐碳青霉烯类大肠埃希菌的院内局部传播.关键词:大肠埃希菌;耐药;新德里金属βＧ内酰胺酶;多位点序列分型中图分类号:R ３７８．２㊀㊀㊀文献标识码:A ㊀㊀㊀文章编号:１００２－２６９４(２０２１)０１－００５３－０７C a r b a p e n e m Ｇr e s i s t a n c em e c h a n i s m s a n dm o l e c u l a r t y p i n g of E s c h e r i c h i a c o l i p r o d u c i ng N e wD e lh im e t a l βＧl a c t a m a s e F U F e n Ｇr u i １,２,Z H A N G Y a １,３,P A N Y u Ｇh o n g １,４,C A O Y i n g Ｇp i n g １,４,Z H E N GP e i Ｇz h e n g１,４(１．F u j i a n M e d i c a lU n i v e r s i t y U n i o n H o s p i t a l ,F u z h o u ３５０００１,C h i n a ;２．N i n g d eM u n i c i p a lH o s p i t a l ,N i n gd e ３５２０００,C h i n a ;３．J i u j i a n g U n i v e r s i t y A f f i l i a t e d H o s p i t a l ,J i u j i a n g ３３２０００,C h i n a ;４．S c h o o l o f M e d i c a lT e c h n o l o g y a n dE n g i n e e r i n g ,F u j i a n M e d i c a lU n i v e r s i t y ,F u z h o u ３５０００４,C h i n a )A b s t r a c t :T h e a i m o f t h i ss t u d y w a s t o i n v e s t i g a t e t h er e s i s t a n c e m e c h a n i s m sa n d m o l e c u l a re p i d e m i o l o gi c a l f e a t u r e so f E s c h e r i c h i ac o l i s t r a i n s p r o d u c i n g N e wD e l h im e t a l βＧl a c t a m a s e (N D M )c o l l e c t e d i n a t h i r d c l a s sAh o s p i t a l ．N DM g e n e sw e r e s c r e e n e dw i t hP C R i n c a r b a p e n e m Ｇr e s i s t a n t E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s ．T y p e s o f N DM g e n e sw e r e i d e n t i f i e db y s e q u e n c i n g ．O t h e r c a r b a p e n e m Ｇr e s i s t a n c e r e l a t e d g e n e sa n de x t e n d e d Ｇs p e c t r u m ＧβＧl a c t a m a s e g e n e sw e r ed e t e c t e db y P C Rf o r N DM g e n e p o s i t i v e s t r a i n s ．A n e x p r e s s i o n s y s t e m w a s u s e d t o e v a l u a t e t h e i m i p e n e m Ｇh y d r o l y s i s a b i l i t y o fN D M Ｇ１,N D M Ｇ６a n dN D M Ｇ９．M o l e c u l a r t y p i n g o f E s c h e r i c h i a c o l i p r o d u c i n g N D M w a s p e r f o r m e dw i t h t h em u l t i l o c u s s e q u e n c e t y p i n g (M L S T )m e t h o d ．E i g h t s t r a i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i p r o d u c i n g N D M w e r e i d e n t i f i e d ,a m o n g wh i c hs i xw e r eN D M Ｇ６s t r a i n s ,a n dt h er e m a i n d e rw e r eN D M Ｇ９s t r a i n s ．F o u r s t r a i n so f E s c h e r i c h i ac o l i w e r ef o u n dt os i m u l t a n e o u s l y c a r r y N DM Ｇ６,T E M a n d C T X ＧM Ｇ１g e n e s ,a n do n e s t r a i nw a s f o u n d t o s i m u l t a n e o u s l y c a r r y N DM Ｇ６,T E M a n d C T X ＧM Ｇ９g e n e s ．R e c o m b i n a n t E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s e x p r e s s i n gN DM Ｇ１,N DM Ｇ６a n d N DM Ｇ９g e n e sw e r e r e s i s t a n t t o i m i pe n e m ,w i t h m i n i m u mi n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n so f３２μg /m L ,１２８μg/m La n d６４μg /m L ,r e s p e c t i v e l y．M L S Tr e v e a l e d f o u r d i s t i n c t s e Ｇq u e n c e t y p e s (S T s ),a m o n g wh i c h f i v e s t r a i n s o f S T １０１w e r e c o l Ｇl e c t e d f r o mt h en e u r o l o g i c a l u n i t ,a n d t h e r e m a i n i n g t h r e e s t r a i n s w e r eS T ２２６,S T ６４８a n dS T １２８４,r e s p e c t i v e l y ．T h i s s t u d y r e po r t s t h e f i r s t i d e n t i f i c a t i o no f E s c h e r i c h i ac o l i s i m u l t a n e o u s l y c a r r y i n g N DM Ｇ６,T E M a n d C T X ＧM Ｇ１g e n e s ,o r N DM Ｇ６,T E M a n d ３５C T XＧMＧ９g e n e s．N o t a b l y,ND MＧ６w a s a s s o c i a t e dw i t h t h eh i g h e s t i m i p e n e mh y d r o l y s i s a b i l i t y,a n dw a s f o l l o w e db y N D MＧ９a n dN D MＧ１．T h eM L S Tr e s u l t s i n d i c a t e d t h a t an o s o c o m i a l i n f e c t i o no f c a r b a p e n e mＧr e s i s t a n tE s c h e r i c h i a c o l i o c c u r r e d l o c a l l y i na t h i r d c l a s sAh o s p i t a l．K e y w o r d s:E s c h e r i c h i a c o l i;r e s i s t a n c e;N e w D e l h im e t a l l oＧβＧl a c t a m a s e;m u l t i l o c u s s e q u e n c e t y p i n gS u p p o r t e db y t h eN a t u r a l S c i e n c eF o u n d a t i o no fF u j i a nP r o v i n c e(N o．２０１６J０１４６６)C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:Z h e n g P e iＧz h e n g,E m a i l:z h e n g p e i z h e n g＠a l i y u n．c o m㊀㊀大肠埃希菌是引起人类各种感染如泌尿道㊁呼吸道㊁创面伤口的感染以及菌血症常见的病原体之一.近年来,由于抗菌药物使用不规范,大肠埃希菌对抗菌药物的耐药性明显增强,出现耐碳青霉烯类药物的大肠埃希菌.根据全国耐药性监测网２０１８年的数据,大肠埃希菌对碳青霉烯类药物全国平均耐药率为１．５％.碳青霉烯类药物是目前临床上控制革兰阴性菌感染最有效的抗生素之一,对大肠埃希菌具有强大抗菌活性,一旦出现耐药,将使得感染后的治疗变得十分困难.大肠埃希菌对碳青霉烯类药物最常见的耐药机制是产碳青霉烯酶[１].碳青霉烯酶是指所有能水解碳青霉烯类的βＧ内酰胺酶,依据A m b l e r分子分类将碳青霉烯酶分为A类碳青霉烯酶㊁B类金属βＧ内酰胺酶(M e t a l l oＧβＧl a c t a m a s e,M B L)和D类苯唑西林酶(O x a c i l l i n a s e,O X A).自２００９年在印度分离的大肠埃希菌中发现新德里金属βＧ内酰胺酶１(N e w D e l h im e t a l l oＧβＧl a c t a m a s eＧ１,N D MＧ１)以来,产N D M型酶的大肠埃希菌在世界范围内被广泛报道,而亚洲大陆被认为是主要的流行区域,特别是中国和印度[２],目前已发现２０多种型别的N D M.本文收集来自住院患者的耐碳青霉烯类药物大肠埃希菌８株,对其耐药机制和分子分型进行研究,结果报道如下.１㊀材料和方法１．１㊀菌株来源㊀从住院患者临床标本中分离的８株对亚胺培南耐药的大肠埃希菌.１．２㊀仪器与试剂㊀V I T E KＧ２c o m p a c t全自动微生物分析仪㊁革兰阴性细菌鉴定卡(G N)㊁药敏卡片(A S TＧG N１６)㊁亚胺培南E t e s t试纸条(法国生物梅里埃公司)㊁P C R扩增仪(美国A p p l i e dB i o s y s t e m s 公司)㊁凝胶成像分析系统(美国B I OＧR A D公司)㊁T a q D N A聚合酶(２．５U/μL)㊁d N T P(２．５mm o l/L)㊁D N A纯化回收试剂盒㊁质粒小提试剂盒及T O P１０感受态细胞(北京天根生化科技有限公司)㊁p C R２．１载体(２５n g/μL)(美国I n v i t r o g e n生命技术公司)㊁MＧH琼脂(英国O x o i d公司)㊁引物的合成及P C R产物测序(上海博尚生物技术有限公司).１．３㊀方㊀法１．３．１㊀菌株鉴定与药敏㊀使用V I T E KＧ２c o m p a c t 全自动微生物分析仪进行菌株鉴定和药敏.采用亚胺培南E t e s t试纸条对亚胺培南耐药性进行验证.药敏结果根据２０１９年C L S I的抗菌药物敏感性试验标准进行判断.以大肠埃希菌A T C C２５９２２为质控菌株.１．３．２㊀碳青霉烯酶基因检测及测序㊀煮沸法提取细菌D N A模板,采用P C R法扩增常见的A类碳青霉烯酶基因(K P C㊁G E S㊁S M E㊁I M I/NM C)㊁B类金属酶基因(N DMＧl i k e㊁I MPＧl i k e㊁V I MＧl i k e㊁S I MＧ１㊁G I MＧ１和S P M)㊁D类苯唑西林酶基因(O X AＧ２３Ｇl i k e㊁O X AＧ２４Ｇl i k e㊁O X AＧ５８Ｇl i k e和O X AＧ１４３Ｇl i k e)和广谱βＧ内酰胺酶类耐药基因(S HV㊁T E M㊁C T XＧMＧ１群㊁C T XＧMＧ２群㊁C T XＧMＧ８群㊁C T XＧMＧ９群和C T XＧMＧ２５群).P C R的扩增体系均为２５μL:上下游引物各０．５μL(１０μmm o l/L),１μL模版D N A,２．５μL１０ˑT a q B u f fＧe r,２μLd N T P,０．５μLT a q聚合酶(２．５U/μL),用灭菌水补足至２５μL.反应参数为:９４ħ预变性５m i n;９４ħ３０s,５５ħ３０s,７２ħ１m i n,循环３０次;７２ħ延伸１０m i n.扩增产物用１％琼脂糖凝胶进行电泳,凝胶成像分析系统进行结果观察.电泳阳性产物送测序公司纯化并双向测序,所得测序结果使用B L A S T与G e n B a n k中的序列进行比对. N DMＧl i k e基因阳性的标本再用N DMＧf u l l引物扩增N DM型基因全长,经测序确定具体的N DM基因型别.引物名称㊁引物序列及预计产物长度见表１.４５中国人兽共患病学报２０２１,３７(１)表１㊀扩增耐药基因相关引物信息T a b ．１㊀P r i m e r i n f o r m a t i o n f o r r e s i s t a n c e g e n e a m pl i f i c a t i o n 引物名称引物序列(５ᶄＧ３ᶄ)扩增产物长度/b p参考文献K P C 上游:C G G T G T G T A C G C G A T G G A T A ５７４本文下游:T C C G G T T T T G T C T C C G A C T G G E S 上游:C G G T T T C T A G C A T C G G G A C A ３２１本文下游:C G T T T G G T T T C C G A T C A G C C S M E 上游:A T A G C G A C A A T G G G G C A A C A ３００本文下游:C A G C A G G A A C A C T A G C A C G AI M I /NM C上游:A T C G G T G G T C C T G A G G G T A T ３０１本文下游:C G T A T G C T C C G C A A C T A C C AO X A Ｇ２３Ｇl i k e 上游:G A T C G G A T T G G A G A A C C A G A ５０１[３]下游:A T T T C T G A C C G C A T T T C C A T O X A Ｇ２４Ｇl i k e 上游:G G T T A G T T G G C C C C C T T A A A２４６[３]下游:A G T T G A G C G A A A A G G G G A T T O X A Ｇ５１Ｇl i k e 上游:T A A T G C T T T G A T C G G C C T T G ３５３[４]下游:T G G A T T G C A C T T C A T C T T G G O X A Ｇ５８Ｇl i k e 上游:A A G T A T T G G G G C T T G T G C T G ５９９[３]下游:C C C C T C T G C G C T C T A C A T A CO X A Ｇ１４３Ｇl i k e 上游:T G G C A C T T T C A G C A G T T C C T１４９[５]下游:T A A T C T T G A G G G G G C C A A C CI M P Ｇl i k e 上游:G A A T A G (A /G )(A /G )T G G C T T A A (C /T )T C T C １８８[６]下游:C C A A A C (C /T )A C T A (G /C )G T T A T C V I M Ｇl i k e 上游:G T T T G G T C G C A T A T C G C A A C ３８２[６]下游:A A T G C G C A G C A C C A G G A T A G S I M Ｇ１上游:G T A C A A G G G A T T C G G C A T C G ５６９[６]下游:T G G C C T G T T C C C A T G T G A GG I M Ｇ１上游:T C A A T T A G C T C T T G G G C T G A C ７２[６]下游:C G G A A C G A C C A T T T G A A T G G S P M 上游:C T A A A T C G A G A G C C C T G C T T G ７９８[６]下游:C C T T T T C C G C G A C C T T G A T C N DM Ｇl i k e 上游:T C C T C A A C T G G A T C A A G C A G G ２４９本文下游:A A A A T A C C T T G A G C G G G C C A N DM Ｇf u l l 上游:A T G G A A T T G C C C A A T A T T A T G C A C ８１３[７]下游:T C A G C G C A G C T T G T C G G CP r e ＧN DM Ｇf u l l 上游:C A C C T C A T G T T T G A A T T C G C C ９８４[８]下游:C T C T G T C A C A T C G A A A T C G C S H V 上游:A G G A T T G A C T G C C T T T T T G ３９３[９]下游:A T T T G C T G A T T T C G C T C GT E M 上游:A T G A G T A T T C A A C A T T T C C G８５８[１０]下游:C C A A T G C T T A A T C A G T G A G G C T X ＧM Ｇ１群上游:G G T T T A A A A A A T C A C T G C G T C８３３[１１]下游:T T G G T G A C G A T T T T A G C C G C５５１期傅芬蕊,等:产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型表１(续)引物名称引物序列(５ᶄＧ３ᶄ)扩增产物长度/b p参考文献C T X ＧM Ｇ２群上游:A T G A T G A C T C A G A G C A T T C G ８６５[１２]下游:T G G G T T A C G A T T T T C G C C G C C T X ＧM Ｇ８群上游:A T G A T A G A G A C A T C G C G T T A A G ８６０[１３]下游:C G G T G A C G A T T T T C G C G G C A G C T X ＧM Ｇ９群上游:A T G G T G A C A A A G A G A G T G C A ８６３[１２]下游:C C C T T C G G C G A T G A T T C T C C T X ＧM Ｇ２５群上游:C A C A C G A A T T G A A T G T T C A G９２３[１４]下游:T C A C T C C A C A T G G T G A G T １．３．３㊀N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６与N D M Ｇ９酶水解亚胺培南能力的比较㊀实验分为８组,见表２.分别扩增含与不含启动子序列的N DM Ｇ１㊁N DM Ｇ６及N DM Ｇ９型基因全长(携带N DM Ｇ１型基因的菌株来源于本实验室保存的菌株),引物分别为P r e ＧN DM Ｇfu l l 与N DM Ｇf u l l ,引物序列见表１,反应体系及条件同上.按D N A 纯化回收试剂盒方法对上述基因全长进行纯化,根据p C R２．１载体试剂说明书进行转化.根据抗性筛选与蓝白筛选挑选转化成功的重组T O P １０感受态细胞,进行P C R 检测耐药基因,测序证实转化是否成功和N D M 型别是否正确,琼脂稀释法测亚胺培南M I C 值.表２㊀N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６及N D M Ｇ９水解亚胺培南能力试验分组情况T a b ．２㊀G r o u p e d e v a l u a t i o no f t h e i m i p e n e m Ｇh y d r o l ys i s a b i l i t y o fN D M Ｇ１,N D M Ｇ６a n dN D M Ｇ９菌株解释㊀T O P １０T O P １０感受态细胞T O P １０＋p C R２．１含空载体的重组菌T O P １０＋p C R２．１＋N DM Ｇ１含N DM Ｇ１全长基因的重组菌T O P １０＋p C R２．１＋N DM Ｇ６含N DM Ｇ６全长基因的重组菌T O P １０＋p C R２．１＋N DM Ｇ９含N DM Ｇ９全长基因的重组菌T O P １０＋p C R ２．１＋P r e ＧN DM Ｇ１含启动子和N DM Ｇ１全长基因的重组菌T O P １０＋p C R ２．１＋P r e ＧN DM Ｇ６含启动子和N DM Ｇ６全长基因的重组菌T O P １０＋p C R ２．１＋P r e ＧN DM Ｇ９含启动子和N DM Ｇ９全长基因的重组菌１．３．４㊀多位点序列分型(M L S T )㊀对携带有N DM 基因的８株大肠埃希菌进行分型,P C R 扩增７个管家基因,即a d k ㊁f u m C ㊁g y r B ㊁i c d ㊁m d h ㊁pu r A 和r e c A ,所用引物序列及预计产物长度参考网站(h t Ｇt ps ://e n t e r o b a s e ．r e a d t h e d o c s ．i o /e n /l a t e s t /m l s t /m l s t Ｇl e g a c yＧi n f o Ｇe c o l i ．h t m l ).P C R 的扩增体系及扩增参数同上.扩增的P C R 产物的测序结果提交到p u b M L S T 数据库进行在线序列比对获得序列型.２㊀结㊀果２．１㊀菌株鉴定与表型筛查结果㊀本次收集的８株大肠埃希菌,经鉴定均为对亚胺培南不敏感的大肠埃希菌.经亚胺培南E t e s t 试纸法验证所有菌株均对亚胺培南不敏感.见表３.２．２㊀碳青霉烯酶基因筛查与测序结果㊀８株对亚胺培南不敏感大肠埃希菌所测A 类和D 类碳青霉烯酶基因均为阴性,B 类碳青霉烯酶基因中除N DM Ｇl i k e 基因为阳性外,其余均为阴性;广谱βＧ内酰胺酶基因中７株T E M 基因阳性,４株C T X ＧM Ｇ１基因阳性,１株C T X ＧM Ｇ９基因阳性,具体见表３.扩增８株N DM 基因全长,电泳结果与预计条带大小(８１３b p )相近,如图１所示.将P C R 产物进行双向测序,序列经比对分析,６株为携带N DM Ｇ６基因,２株为携带N DM Ｇ９基因,见表３.２．３㊀N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６和N D M Ｇ９水解亚胺培南能力结果㊀以T O P １０感受态细胞和含有空载体的重组菌作为阴性对照,仅含有N DM Ｇ１Ｇfu l l 基因㊁N DM Ｇ６Ｇf u l l 基因和N DM Ｇ９Ｇf u l l 基因的重组菌,因不含启动子,N DM 型基因无法表达,故表现为对亚胺培南敏感,与阴性对照组结果相同,M I C 值均为０．２５μg /m L .而含有P r e ＧN DM Ｇ１Ｇfu l l 基因㊁６５中国人兽共患病学报２０２１,３７(１)表３㊀８株产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠杆菌临床相关信息㊁耐药基因检测及分子分型结果T a b ．３㊀R e l a t e d c l i n i c a l i n f o r m a t i o n ,r e s i s t a n c e g e n e d e t e c t i o na n dm o l e c u l a r t y p i n g o f e i gh t s t r a i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i p r o d u c i n g N e wD e l h im e t a l βＧl a c t a m a s e 科室年龄(岁)标本类型亚胺培南E t e s t 试纸法碳青霉烯酶基因广谱βＧ内酰胺酶基因M L S T分型结果康复科５３中段尿＞３２(R )N DM Ｇ６T E M S T １０１神经内科８６中段尿８(R )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ１S T １０１神经内科８１中段尿４(R )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ１S T １０１神经内科８４中段尿＞３２(R )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ１S T １０１神经内科６７中段尿＞３２(R )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ１S T １０１血液科６０分泌物３(I )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ９S T ６４８呼吸内科６４痰２(I)N DM Ｇ９－S T １２８４小儿外科１７分泌物１２(R )N DM Ｇ９T E MS T ２２６１Ｇ８分别为８株待检菌株;M 为D N A m a r k e r;阴性为阴性对照图１㊀N D M 基因扩增产物电泳图F i g ．１㊀E l e c t r o ph o r e s i s o fP C R p r o d u c t s o f t h e N D M g e n e P r e ＧN DM Ｇ６Ｇf u l l 基因及P r e ＧN DM Ｇ９Ｇf u l l 型基因的重组菌对亚胺培南均耐药,对亚胺培南的M I C 值分别为３２μg /m L ㊁１２８μg /m L 和６４μg/m L .２．４㊀M L S T 结果㊀对该８株耐药大肠埃希菌进行分子分型,S T １０１型有５株㊁S T ２２６㊁S T ６４８和S T １２８４型各１株.见表３.３㊀讨㊀论自２００９年首次发现产N D M Ｇ１酶的菌株以来,产N D M 型酶的菌株迅速向其他国家播散,在世界各地均有发现并报道.我国及世界上流行的分离菌中检出率较高的N D M 型酶基因主要为N DM Ｇ１和N DM Ｇ５[１５].本次实验在８株大肠埃希菌中均检测出N DM 基因,其中６株携带N DM Ｇ６基因,２株携带N DM Ｇ９基因.而N DM Ｇ６基因在２０１２年第一次从新西兰病人携带的大肠杆菌中鉴定出来以来[１６],国内外关于N DM Ｇ６基因报道均较少见.N DM Ｇ９基因是我国学者２０１４年在肺炎克雷伯菌中首次报道发现[１７],目前已在韩国㊁我国大陆及台湾地区等地均发现了携带N DM Ｇ９基因的大肠杆菌㊁肺炎克雷伯菌等细菌[１８].为了进一步分析菌株耐药基因的携带情况,还筛查８株耐药菌的广谱βＧ内酰胺酶基因,发现大肠埃希菌中存在多种耐药基因共存现象,几乎所有的耐药菌株均携带有T E M 基因,４株耐药菌同时携带有N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ１基因,１株同时携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ９基因,目前国内外均未见此类报道.本文结果显示N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６和N D M Ｇ９水解亚胺培南能力从强到弱依次为N D M Ｇ６㊁N D M Ｇ９和N D M Ｇ１,文献中未见同时比较以上３种型别N D M 水解亚胺培南能力的报道.对于N DM 型基因,目前已发现了２０多个型别,而它们之间大多只有几个碱基的不同.N DM Ｇ６基因㊁N DM Ｇ９基因与N DM Ｇ１基因的区别是分别在基因６９８位置(CңT )和４５４位置(GңA )上存在有一个碱基的改变,从而导致氨基酸分别由丙氨酸转变为缬氨酸㊁谷氨酸转变为赖氨酸.氨基酸的改变会影响N D M 蛋白的二级结构,可能改变N D M 蛋白的空间结构,从而改变N D M 与底物即碳青霉烯类药物的结合特性,表现出不同的水解能力.不同类型的N D M 水解碳青霉烯类药物的具体机制有待进一步研究.本次研究还采用M L S T 法对８株耐药大肠埃希菌进行分型,结果为:５株携带N DM Ｇ６基因大肠埃希菌为S T １０１型,１株携带N DM Ｇ６基因大肠埃７５１期傅芬蕊,等:产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型希菌为S T６４８型,有２株携带N DMＧ９基因大肠埃希菌分别为S T２２６型和S T１２８４型.在２０１２年首次报道产N DMＧ６基因的大肠埃希菌,其分型结果也为S T１０１型,而在国外报道,产N DM型基因的大肠埃希菌中,也有发现其M L S T分型结果为S T１０１型[１９],提示大肠埃希菌S T１０１型与N D M型碳青霉烯酶基因关系密切.S T６４８型大肠埃希菌常在产超广谱βＧ内酰胺酶的大肠埃希菌中发现[２０],在英国㊁日本分别首次报道产N DMＧ５和N DMＧ７基因的大肠埃希菌,其分型结果均为S T６４８型[２１],国内学者也有在S T６４８型大肠埃希菌中发现N DMＧ５基因,但并未检测出携带有N DMＧ６基因,国际上也并未发现携带有N DMＧ６基因的S T６４８型.产N DM基因的S T１２８４型大肠埃希菌在国内外鲜有报道发现,第一次在S T１２８４型大肠埃希菌中检出N DMＧ５基因是在２０１５年,而后虽有再次检出N DMＧ５基因,但到目前为止未检出携带有包括N DMＧ９基因在内其它N DM型基因.国内外均未在S T２２６型大肠埃希菌中发现N DM型基因.本次分离的８株耐药大肠埃希菌有５株M L S T 分型结果一致,均为S T１０１型,且均检出N DMＧ６基因.其中４株来自神经内科患者,１株来自康复科患者.通过查阅临床相关资料发现,这位康复科患者是在神经内科治疗一段时间后转入康复科的,且与２号患者曾在同一个病房治疗.２号患者长期卧床治疗,在其住院期间,３号㊁４号和５号患者也在神经内科治疗,而且３号和４号患者前后入住同一张病床.以上患者多为免疫力低下㊁有留置导尿管史和长期卧床的老年人.综合以上因素提示这些病人极有可能是在医院内发生了交叉感染.对此,临床上应尽量缩短留置导尿管的时间㊁合理使用抗菌药物㊁规范医护人员的操作和加强对各种医疗器械的消毒措施,同时应重视并加强院感监控力度,避免耐药菌株的传播和医院内感染的发生.利益冲突:无引用本文格式:傅芬蕊,张娅,潘玉红,等．产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型[J]．中国人兽共患病学报,２０２１,３７(１):５３Ｇ５９．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００２Ｇ２６９４．２０２０．００．１７９参考文献:[１]T a nK,N g u y e n J,N g u y e nK,e t a l．P r e v a l e n c e o f t h e c a r b a p e nＧe mＧh e t e r o r e s i s t a n t p h e n o t y p e a m o n g E S B LＧp r o d u c i n g E s c h eＧr i c h i a c o l i a n dK l e b s i e l l a p n e u m o n i a e c l i n i c a l i s o l a t e s[J]．JA n t iＧm i c r o bC h e m o t h e r,２０２０,７５(６):１５０６Ｇ１５１２．D O I:１０．１０９３/j a c/ d k a a０４８[２]L i J,Y uT,T a oX Y,e t a l．E m e r g e n c e o f a nN D MＧ５Ｇp r o d u c i n g E s c h e r i c h i a c o l i s e q u e n c e t y p e４１０c l o n e i n i n f a n t s i n a c h i l d r e n s h o s p i t a l i n C h i n a[J]．I n f e c t D r u g R e s i s t,２０２０,１３:７０３Ｇ７１０．D O I:１０．２１４７/I D R．S２４４８７４[３]W o o d f o r dN,E l l i n g t o n M J,C o e l h oJ M,e t a l．M u l t i p l e xP C R f o r g e n e se n c o d i n gp r e v a l e n tO X Ac a r b a p e n e m a s e s i n A c i n e t oＧb a c t e r s p p[J]．I n t JA n t i m i c r o bA g e n t s,２００６,２７(４):３５１Ｇ３５３．D O I:１０．１０１６/j．i j a n t i m i c a g．２００６．０１．００４[４]B r o w nS,Y o u n g H K,A m y e s S G．C h a r a c t e r i s a t i o n o fO X AＧ５１, an o v e lc l a s s D c a r b a p e n e m a s ef o u n di n g e n e t i c a l l y u n r e l a t e d c l i n i c a l s t r a i n so f A c i n e t o b a c t e rb a u m a n n i i f r o m A r g e n t i n a[J]．C l i n M i c r o b i o l I n f e c t,２００５,１１(１):１５Ｇ２３．D O I:１０．１１１１/j．１４６９Ｇ０６９１．２００４．０１０１６．x[５]H i g g i n sP G,L e h m a n n M,S e i f e r t H．I n c l u s i o no f O X AＧ１４３p r i m e r si na m u l t i p l e x p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n(P C R)f o r g e n e s e n c o d i n gp r e v a l e n tO X Ac a r b a p e n e m a s e s i n A c i n e t o b a c t e r s p p[J]．I n tJA n t i m i c r o b A g e n t s,２０１０,３５(３):３０５．D O I:１０．１０１６/j．i j a n t i m i c a g．２００９．１０．０１４[６]M e n d e sR E,K i y o t aK A,M o n t e i r o J,e t a l．R a p i dd e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o no fm e t a l l oＧb e t aＧl a c t a m a s eＧe n c o d i n g g e n e s b y m u l t iＧp l e x r e a lＧt i m eP C Ra s s a y a n dm e l t c u r v e a n a l y s i s[J]．JC l i n M iＧc r o b i o l,２００７,４５(２):５４４Ｇ５４７．D O I:１０．１１２８/J C M．０１７２８Ｇ０６[７]H o r n s e y M,P h e eL,W a r e h a m D W．An o v e l v a r i a n t,N D MＧ５, o ft h e N e w D e l h im e t a l l oＧβＧl a c t a m a s ei na m u l t i d r u gＧr e s i s t a n t E s c h e r i c h i a c o l i S T６４８i s o l a t e r e c o v e r e d f r o ma p a t i e n t i n t h eUＧn i t e dK i n g d o m[J]．A n t i m i c r o b A g e n t s C h e m o t h e r,２０１１,５５(１２):５９５２Ｇ５９５４．D O I:１０．１１２８/A A C．０５１０８Ｇ１１[８]K a a s eM,N o r d m a n nP,W i c h e l h a u sT A,e t a l．N D MＧ２c a r b a pＧe n e m a s e i n A c i n e t o b a c t e r b a u m a n n i i f r o m E g y p t[J]．JA n t i m iＧc r o bC h e m o t h e r,２０１１,６６(６):１２６０Ｇ１２６２．D O I:１０．１０９３/j a c/d k r１３５[９]B h a t t a c h a r j e eA,S e n M R,P r a k a s hP,e t a l．R o l e o f b e t aＧl a c t aＧm a s e i n h i b i t o r s i ne n t e r o b a c t e r i a l i s o l a t e s p r o d u c i n g e x t e n d e dＧs p e c t r u mb e t aＧl a c t a m a s e s[J]．JA n t i m i c r o bC h e m o t h e r,２００８,６１(２):３０９Ｇ３１４．D O I:１０．１０９３/j a c/d k m４９４[１０]T o n k iM,M o h a rB,Šišk oＧK r a l j e v iK,e t a l．H i g h p r e v a l e n c e a n d m o l e c u l a rc h a r a c t e r i z a t i o n o fe x t e n d e dＧs p e c t r u mβＧl a c t aＧm a s eＧp r o d u c i n g P r o t e u s m i r a b i l i s s t r a i n s i ns o u t h e r nC r o a t i a [J]．J M e d M i c r o b i o l,２０１０,５９(P t１０):１１８５Ｇ１１９０．D O I:１０．１０９９/j mm．０．０１６９６４Ｇ０[１１]P a r kY J,L e eS,K i m Y R,e t a l．O c c u r r e n c e o f e x t e n d e dＧs p e cＧt r u m(b e t a)Ｇl a c t a m a s e sa n d p l a s m i dＧm e d i a t e d A m p C(b e t a)Ｇl a c t a m a s e s a m o n g K o r e a ni s o l a t e so f P r o t e u s m i r a b i l i s[J]．JA n t i m i c r o bC h e m o t h e r,２００６,５７(１):１５６Ｇ１５８．D O I:１０．１０９３/ j a c/d k i４０８[１２]G a r r e cH,D r i e u xＧR o u z e t L,G o l m a r d J L,e t a l．C o m p a r i s o n o f n i n e p h e n o t y p i c m e t h o d sf o rd e t e c t i o n o fe x t e n d e dＧs p e c t r u mb e t aＧl ac t a m a s e p r od u c t i o nb y E n te r o b a c t e r i a c e a e[J]．JC l i nM iＧc r o b i o l,２０１１,４９(３):１０４８Ｇ１０５７．D O I:１０．１１２８/J C M．０２１３０Ｇ１０[１３]N a v o nＧV e n e z i a S,C h m e l n i t s k y I,L e a v i t tA,e t a l．D i s s e m i n aＧt i o no f t h e C T XＧMＧ２５f a m i l y b e t aＧl a c t a m a s e s a m o n g K l e b s i e l l a８５中国人兽共患病学报２０２１,３７(１)p n e u m o n i a e,E s c h e r i c h i a c o l i a n d E n t e r o b a c t e rc l o a c a e a n d iＧd e n t i f i c a t i o no f t h en o v e l e n z y m eC T XＧMＧ４１i n P r o t e u sm i r aＧb i l i s i n I s r a e l[J]．JA n t i m i c r o bC h e m o t h e r,２００８,６２(２):２８９Ｇ２９５．D O I:１０．１０９３/j a c/d k n１８２[１４]G o r e nM G,N a v o nＧV e n e z i a S,C h m e l n i t s k y I,e t a l．C a r b a p e nＧe mＧr e s i s t a n tK P CＧ２Ｇp r o d u c i n g E s c h e r i c h i ac o l i i na T e lA v i vM e d i c a lC e n t e r,２００５t o２００８[J]．A n t i m i c r o b A g e n t s C h eＧm o t h e r,２０１０,５４(６):２６８７Ｇ２６９１．D O I:１０．１１２８/A A C．０１３５９Ｇ０９[１５]Z o u H,J i aX,L i u H,e t a l．E m e r g e n c eo fN D MＧ５Ｇp r o d u c i n g E s c h e r i c h i ac o l i i nat e a c h i n g h o s p i t a l i nC h o n g q i n g,C h i n a: I n c FＧt y p e p l a s m i d s m a y c o n t r i b u t e t o t h e p r e v a l e n c e o f b l a N D MＧ５[J]．F r o n tM i c r o b i o l,２０２０,１１:３３４．D O I:１０．３３８９/ f m i c b．２０２０．００３３４[１６]W i l l i a m s o nD A,S i d j a b a tH E,F r e e m a nJ T,e ta l．I d e n t i f i c aＧt i o na n dm o l e c u l a r c h a r a c t e r i s a t i o no fN e wD e l h im e t a l l oＧβＧl a cＧt a m a s eＧ１(N D MＧ１)Ｇa n d N D MＧ６Ｇp r o d u c i n g E n t e r o b a c t e r i a c e a e f r o m N e w Z e a l a n d h o s p i t a l s[J]．I n tJ A n t i m i c r o b A g e n t s,２０１２,３９(６):５２９Ｇ５３３．D O I:１０．１０１６/j．i j a n t i m i c a g．２０１２．０２．０１７[１７]W a n g X,L iH,Z h a oC,e t a l．N o v e lN D MＧ９m e t a l l oＧβＧl a c t aＧm a s e i d e n t i f i e d f r o maS T１０７K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e s t r a i n iＧs o l a t e d i nC h i n a[J]．I n t JA n t i m i c r o bA g e n t s,２０１４,４４:９０Ｇ９１．D O I:１０．１０１６/j．i j a n t i m i c a g．２０１４．０４．０１０[１８]L i nY C,K u r o d a M,S u z u k i S,e t a l．E m e r g e n c eo f a n E s c h eＧr i c h i a c o l i s t r a i n c oＧh a r b o u r i n g m c rＧ１a n db l a N D MＧ９f r o ma uＧr i n a r y t r a c t i n f e c t i o n i nT a i w a n[J]．JG l o bA n t i m i c r o bR e s i s t,２０１９,１６:２８６Ｇ２９０．D O I:１０．１０１６/j．j g a r．２０１８．１０．００３[１９]Q a m a rMU,W a l s hT R,T o l e m a nMA,e t a l．D i s s e m i n a t i o n o f g e n e t i c a l l y d i v e r s e N D MＧ１,Ｇ５,Ｇ７p r o d u c i n gＧG r a mＧn e g a t i v e p a t h o g e n s i s o l a t e d f r o m p e d i a t r i c p a t i e n t s i nP a k i s t a n[J]．F uＧt u r eM i c r o b i o l,２０１９,１４(１):６９１Ｇ７０４．D O I:１０．２２１７/f m bＧ２０１９Ｇ００１２[２０]P e i r a n oG,P i t o u t J D D．E x t e n d e dＧS p e c t r u mβＧL a c t a m a s eＧP r oＧd u c i n g E n t e r o b a c t e r i a c e a e:u p d a t eo n m o l e c u l a re p i d e m i o l o g y a n dt r e a t m e n to p t i o n s[J]．D r u g s,２０１９,７９(１４):１５２９Ｇ１５４１．D O I:１０．１００７/s４０２６５Ｇ０１９Ｇ０１１８０Ｇ３[２１]M i z u n oY,Y a m a g u c h iT,M a t s u m o t oT．Af i r s t c a s eo fN e wD e l h im e t a l l oＧβＧl a c t a m a s eＧ７i na nE s c h e r i c h i ac o l i S T６４８i s oＧl a t e i nJ a p a n[J]．J I n f e c tC h e m o t h e r,２０１４,２０(１２):８１４Ｇ８１６．D O I:１０．１０１６/j．j i a c．２０１４．０８．００９收稿日期:２０２０Ｇ０５Ｇ２２㊀编辑:张智芳(上接第５２页)[２９]S c h e y K L,W a n g Z,W e n k e J L,e t a l．A q u a p o r i n s i n t h e e y e: e x p r e s s i o n,f u n c t i o n,a n dr o l e s i no c u l a rd i s e a s e[J]．B i o c h i mB i o p h y sA c t a,２０１４,１８４０(５):１５１３Ｇ１５２３．D O I:１０．１０１６/j．b b a g e n．２０１３．１０．０３７[３０]H i b u s eT,M a e d aN,N a g a s a w aA,e t a l．A q u a p o r i n s a n d g l y cＧe r o lm e t a b o l i s m[J]．B i o c h i m B i o p h y sA c t a,２００６,１７５８(８):１００４Ｇ１０１１．D O I:１０．１０１６/j．b b a m e m．２００６．０１．００８[３１]A l v a r a d oM E,R u b i a n oC,Sán c h e zW,e t a l．C a l c i u mＧb i n d i n g p r o t e i n s t h a t a r e t y p e Bᵡr e g u l a t o r y s u b u n i t s o f p h o s p h a t a s e２A i n G i a r d i ai n t e s t i n a l i s[J]．P a r a s i t o lR e s,２０１８,１１７(１０):３２０５Ｇ３２１４．D O I:１０．１００７/s００４３６Ｇ０１８Ｇ６０１９Ｇz[３２]P r a s a dR,A t u l,S o n iA,e t a l．E x p r e s s i o n,c h a r a c t e r i z a t i o n, a n dc e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f k n o w p a i n s,p a p a i nＧl i k e c y s t e i n e p r oＧt e a s e s o f t h e P l a s m o d i u mk n o w l e s i m a l a r i a p a r a s i t e[J]．P L o S O n e,２０１２,７(１２):e５１６１９．D O I:１０．１３７１/j o u r n a l．p o n e．００５１６１９[３３]张佳凤,郝文波,肖斌,等．抗弓形虫水通道蛋白多肽抗体的制备及鉴定[J]．中国人兽共患病学报,２０１５,３１(１０):９０３Ｇ９０７．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００２Ｇ２６９４．２０１５．１０．００２[３４]钟亮尹,刘思敏,曾智华,等．弓形虫C D P K５基因多克隆抗血清的制备及功能鉴定[J]．重庆医学,２０１６,４５(１６):２１８２Ｇ２１８５．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１６７１Ｇ８３４８．２０１６．１６．００８[３５]冯宪敏,张宏梅,李瑶,等．蓝氏贾第鞭毛虫P P D K多肽抗体制备与定位研究[J]．中国病原生物学杂志,２０１５,１０(２):１４４Ｇ１４７．D O I:１０．１３３５０/j．c j p b．１５０２１０[３６]肖斌,陈瑜,李林海,等．兔抗弓形虫C o r A家族M g２＋转运蛋白多肽抗体的制备及鉴定[J]．生物技术通讯,２０１６,２７(６):７７８Ｇ７８２．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００９Ｇ０００２．２０１６．０６．００６[３７]C a o i l i S E．B e n c h m a r k i n g BＧc e l l e p i t o p e p r e d i c t i o nw i t h q u a n t iＧt a t i v ed o s eＧr e s p o n s ed a t ao na n t i p e p t i d ea n t i b o d i e s:t o w a r d s n o v e l p h a r m a c e u t i c a l p r o d u c td e v e l o p m e n t[J]．B i o m e d R e s I n t,２０１４,２０１４:８６７９０５．D O I:１０．１１５５/２０１４/８６７９０５[３８]W a n g F,Y eB．B i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i sa n dc o n s t r u c t i o no f p h y l o g e n e t i c t r e e o fA q u a p o r i n s f r o m E c h i n o c o c c u s g r a n u l o s u s [J]．P a r a s i t o lR e s,２０１６,１１５(９):３４９９Ｇ３５１１．D O I:１０．１００７/ s００４３６Ｇ０１６Ｇ５１１４Ｇ２收稿日期:２０２０Ｇ０４Ｇ２４㊀编辑:张智芳９５１期傅芬蕊,等:产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型。

金属β-内酰胺酶表型检测进展

ＩＭＰ敏感，临界值菌株易漏检。选择多种药物（如Ｉ、ＡＺ美洛培南）多个抑制物（ＥＡ、ＭＰＣ、和如ＤＴ巯基丙酸ＭＰ可提高实验的敏感性。Ａ）ｊ
表型检测包括微量稀释法（ｃｏｉｔｎｔｓ）Ｍｉｄｌｉｅｔ，ｒｕｏ
维普资讯
ＪｕｎｌｆＱｉｉａｅｃｌＣｏｌｇ，０７，．８，．ｏｒａｑｈｒＭｄｉａｌｅ２０Ｖｏ１２Ｎｏ８ｏｅ
金属ｌ内酰胺酶表型检测进展３一
于志军周杰１前言
ａｓｙＥＭ）。ｓａ，Ｉ等
为活性中心的Ｂ一内酰胺酶，其活性可被金属螯合剂所抑制。按功能分类Ｂｓｕｈ将其定为第３组，按分子生物学分类Ａｍｂｅ将其定为Ｂ类酶。自１８ｌｒ９０年Ａｍｂｅ首次将一内酰胺酶分为金属一内酰胺酶ｌｒ与丝氨酸Ｂ内酰胺酶以来，一已陆续发现了５类金属
阳性。该方法的优点在于结果判读简单，定量，于易
１。其中Ｉ型有２ＭＰ３种，Ｉ型１ＶＭ４种（新更新最
２００７年１月３日）ｈｔ：／（ｔ／ｗｗｗ．ａｅ．ｒ／ｔｄｐｓ由于能够水解碳青霉烯类ｅｏｈｒｓｍ）ｓＬ药物而备受关注。目前，青霉烯类药物是治疗耐碳头孢类、青霉素类药物引起的严重感染的最佳选择，
Ｅ— ｔｓ，良的Ｈｏｇｅｔ改ｄｅ试验，纸片协同试验双

β-内酰胺酶研究进展

β-内酰胺酶研究进展摘要：青霉素于40年代初首次用于临床，几年后就从链球菌中分离到了青霉素酶，以后随着β-内酰胺类抗生素的不断开发和广泛应用，特别是近几十年来超广谱新品种的大量应用，β-内酰胺酶的种类、底物谱和耐药程度均以惊人的速度在发展，不能不引起格外的重视。

关键词：细菌，β-内酰胺酶，耐药任何生物都试图适应周围环境并生存下去，细菌个体小，易变异,拥有耐药能力，这是自然界的法则。

科学界有一种理论叫“中性突变漂变学说”，以“中性突变”为基础的分子进化学已逐渐形成。

这个学说认为，在分子水平上看，大部分基因突变对于生命体的生存既不产生有利效应，也不酿成不利后果，因此，这类突变在自然选择中是“中性”的。

在亿万年中，生物体内的基因不断产生中性突变，他们不受自然选择的支配，而是通过随机的偶然过程（即遗传漂变）在群体中固定下来或是被淘汰，结果就造成了基因和蛋白质分子的多样性，实现了分子的进化。

在药物选择性压力下，产β-内酰胺酶的细菌被筛选出来，得以泛滥。

为了对β-内酰胺酶有一个教深入了解，现将β-内酰胺酶的研究综述如下。

1 β-内酰胺类药物作用机理肽聚糖合成的最后一步是被称为青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，即PBPs）的转肽酶形成的。

β内酰胺类抗生素与D-丙氨酰-D-丙氨酸结构上的相似使得它们与青霉素结合蛋白结合（图一）。

β-内酰胺核不可逆地与青霉素结合蛋白的Ser403单元结合，使其失活，从而抑制细菌细胞壁的形成。

此外这个结合可能还激活细胞壁中的自溶酶。

图1 青霉素与青霉素结合蛋白结合使酶失活2 β-内酰胺酶起源β-内酰胺酶是指能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基头孢烷酸(7-ACA)及其N-酰基衍生物分子中β-内酰胺环酰胺键的灭活酶。

β-内酰胺酶来源于细菌细胞壁合成酶(即PBPs)，是由于细菌合成PBPs的过程中的基因的变异而造成的（图2）。

β-内酰胺类药物在这类酶的作用下，使β-内酰胺环水解开环，而β-内酰胺环是与PBPs结合的活性功能部位，因此β-内酰胺环的破坏使其失去了干扰细菌细胞壁合成的功能。

金属β-内酰胺酶的研究进展

金属β-内酰胺酶的研究进展陈照强;刘一方;朱宁;陈姣;郑珩【摘要】金属β-内酰胺类酶是一类需要金属离子协助才能发挥催化活性的一类广谱β-内酰胺酶,它能水解包括碳青霉烯在内的几乎所有的β-内酰胺类抗生素,且不被临床所用的β-内酰胺类抗生素所抑制.由于该酶位于质粒(整合子)上,极易在细菌中扩散,近期发现的携带NDM-1金属β-内酰胺酶超级细菌证实了这一担忧.因此,本文从分类、结构、催化机制以及进化等方面对金属β-内酰胺酶的研究进展进行了综述,希望对抗菌治疗的研究提供帮助.【期刊名称】《国外医药（抗生素分册）》【年(卷),期】2011(032)003【总页数】5页(P111-115)【关键词】金属β-内酰胺酶;耐药性;作用机制;进化【作者】陈照强;刘一方;朱宁;陈姣;郑珩【作者单位】中国药科大学生命科学与技术学院,南京,210009;中国药科大学生命科学与技术学院,南京,210009;中国药科大学生命科学与技术学院,南京,210009;中国药科大学生命科学与技术学院,南京,210009;中国药科大学生命科学与技术学院,南京,210009【正文语种】中文【中图分类】Q814β-内酰胺类抗生素在临床及农业上的广泛使用，使得细菌对之耐药性不断增强并广泛传播，其中产生β-内酰胺酶是细菌耐药的重要机制之一。

Ambler[1]将β-内酰胺酶分为了A,B,C和D四类，其中A,C,D是丝氨酸β-内酰胺酶，它们活性位点有一个丝氨酸残基，帮助催化水解；金属酶属于B类β-内酰胺酶，它们发挥催化活性需要一个或两个金属离子的协助。

金属β-内酰胺酶具有稳定且高效的碳青霉烯类（丝氨酸酶不能将其水解）的水解活性，可以催化水解除了单环外几乎所有的β-内酰胺类抗生素。

另外金属β-内酰胺酶不能被临床上的现有β-内酰胺酶抑制剂所抑制。

目前为止，MBLs（metallo β-lactamases）已经在多种菌株中分离出，如脆弱拟杆菌，铜绿假单胞菌，气单胞菌，黏质沙雷菌，金黄杆菌等。

金属β-内酰胺酶研究进展

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金属Ｂ内酰胺酶研究进展－
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NDM-1型金属-β-内酰胺酶及其抑制剂研究进展

NDM-1型金属-β-内酰胺酶及其抑制剂研究进展孙影;周紫薇;冯迪;刘湲;郑珩【摘要】金属β-内酰胺酶(MBLs)尤其是NDM-1型金属酶介导的细菌耐药性在全球范围内不断扩散,给人类健康带来日益严重的威胁.虽然使用抑制剂阻止酶的水解作用是临床上应对产β-内酰胺酶耐药菌的重要手段,并已成功上市了奥格门汀等药物,但临床所用抑制剂仅对丝氨酸β-内酰胺酶有效,对MBLs尤其是NDM-1没有效果.本综述概述了近年来NDM-1抑制剂的研究进展,介绍了MBLs抑制剂筛选新方法,以期为研究者们提供新的思路,更有效地设计或筛选出活性较好的MBLs抑制剂.【期刊名称】《国外医药（抗生素分册）》【年(卷),期】2018(039)002【总页数】8页(P91-98)【关键词】金属酶;NDM-1;抑制剂;筛选方法【作者】孙影;周紫薇;冯迪;刘湲;郑珩【作者单位】中国药科大学生命科学与技术学院,南京210009;中国药科大学生命科学与技术学院,南京210009;中国药科大学生命科学与技术学院,南京210009;中国药科大学生命科学与技术学院,南京210009;中国药科大学生命科学与技术学院,南京210009【正文语种】中文【中图分类】R9781 引言β-内酰胺类抗生素是目前临床应用较广、用量较大的一类抗菌抗感染药物。

自1940年青霉素首次应用于临床以来，该类抗生素在控制与治疗细菌感染性疾病方面发挥着重要作用[1]。

然而随着抗生素的乱用与滥用，细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药现象日益严重，并且机制多种多样，其中β-内酰胺酶的产生被认为是最重要的原因，尤其是近年来造成严重细菌耐药性的金属-β-内酰胺酶(MBLs)，威胁最大的莫过于B1类的新德里金属-β-内酰胺酶(NDM-1)。

NDM-1最初是从一名2008年在印度的新德里做过选择性外科手术的瑞典病人身上的肺炎克雷伯杆菌中分离得到，该菌株能分解除替加环素和多黏菌素之外的所有抗生素，故被称为“超级细菌”[2]。

IMP型金属β-内酰胺酶的研究进展

ＩＭＰ型金属β－内酰胺酶的研究进展金属β-内酰胺酶又称金属酶，属Bush功能分类中的第三组，Ambler分子结构分类中的B类。

这类酶能够水解几乎所有的β-内酰胺类抗生素，但对单环类抗生素敏感，其活性不被β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦和三唑巴坦抑制，但可被金属螯合物如乙二胺四乙酸（EDTA）及巯基化合物等所抑制。

现对IMP 型MBLs的研究情况做一综述。

1 IMP型MBLs的特点、功能及传播机制IMP家族多数由IMP-1突变产生，与其同源性较高，但各亚型对底物的水解活性不尽相同，这主要与各自的结构特点有关。

IMP-1是第一个被发现的获得性MBL，水解底物谱较广，包括广谱头孢菌素类及碳青霉烯类抗生素；blaIMP-1基因位于质粒介导的I类整合子上，并已在肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌及其他非发酵革兰阴性杆菌中广泛传播[1]。

1995年，Arakawa等[2]发现blaIMP-1基因盒位于一个新的大质粒介导的整合子样元件上，后来将这种新的元件命名为Ⅲ类整合子。

IMP-3与IMP-1相比，仅有2个氨基酸替代，而其中196位丝氨酸（Ser）残基被甘氨酸(Gly)残基取代，导致其不能水解青霉素、氨苄西林、亚胺培南和头孢他定，与之对应的，存在blaIMP-3基因核苷酸序列640位鸟嘌呤代替腺嘌呤，这表明由于点突变使IMP-1的作用底物谱增宽，由此认为IMP-3可能是IMP-1的祖先。

blaIMP-6基因的核苷酸序列也存在着相同的碱基转换，导致196位Gly 替代Ser，这种点突变使IMP-6对帕尼培南，尤其是美罗培南的水解活性明显强于亚胺培南，这与IMP－1相反，表明IMP-6具有更广的底物谱。

但其抗青霉素G、哌拉西林的活性显著降低[3]。

进一步研究显示，blaIMP-4位于I类整合子上，其下游还存在其余3个耐药基因盒qacG2、aacA4及catB3，分别编码对季胺化合物、氨基糖甙类及氯霉素耐药性[4]。

IMP-5与IMP-1、IMP-3及IMP-4的同源性大于IMP-2，分别为93%、92%、91%和87%，其PI为9.3，表现为对青霉素类、广谱头孢菌素类及氨曲南高度耐药，但对氨苄西林/舒巴坦、氨基糖甙类和喹诺酮类抗生素敏感；blaIMP-5基因单独位于I类整合子上[5]。

多重耐药的革兰氏阴性菌尿路感染的治疗

多重耐药的革兰氏阴性菌尿路感染的治疗多药耐药（MDR）革兰氏阴性菌引起的感染很难治疗，因为治疗选择有限，而且使用较少的抗感染药物可能会产生副作用。

在过去的几年里，已经有几种新的抗多药革兰氏阴性的抗菌药物问世。

这篇综述的重点是由耐多药革兰氏阴性引起的复杂尿路感染（cUTIs）的治疗方案。

最近的发现新的组合，β内酰胺或碳青霉烯和β内酰胺酶抑制剂，头孢他啶/阿维巴坦和美罗培南/瓦波巴坦，对由产生KPC碳青霉烯酶的病原体引起的感染有效。

亚胺培南/乐巴坦，另一种碳青霉烯/β-内酰胺酶抑制剂组合，已被批准用于治疗cUTI。

然而，亚胺培南/乐巴坦对碳青霉烯类耐药病原体的疗效数据仍然有限。

头孢洛桑/他唑巴坦主要用于治疗耐多药铜绿假单胞菌感染。

对于由产超广谱β内酰胺酶的肠杆菌引起的cUTI 的治疗，应考虑氨基糖苷类或静脉注射磷霉素。

介绍耐多药（MDR）革兰氏阴性菌的出现和全球传播仍然是一个主要的公共卫生问题。

世界卫生组织列为研发重点目标的所有四种“第一优先病原体”均为革兰氏阴性菌：产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）肠杆菌、碳青霉烯耐药肠杆菌、耐碳青霉素鲍曼不动杆菌和耐碳青霉素铜绿假单胞菌。

这些细菌构成了医疗保健相关感染的常见原因，包括血液感染（BSI）、医院内肺炎和尿路感染（UTI）。

多种细菌可导致复杂的尿路感染（cUTIs）。

该谱比无并发症的尿路感染大得多，细菌更有可能对抗生素产生耐药性，包括耐多药革兰氏阴性。

耐多药病原体引起的感染很难治疗，因为治疗选择有限，而且使用频率较低的抗感染药物（如粘菌素）可能会产生副作用。

此外，治疗需要个性化，考虑患者的合并症、疾病严重程度和细菌耐药性的潜在机制。

这篇综述的目的是提供由MDR革兰氏阴性引起的尿路感染的治疗选择的最新情况，重点是cUTI的确切治疗。

怀疑多重耐药病原体时并发或不并发菌血症的复杂尿路感染的经验治疗一项对20项研究的系统综述评估了因肺炎克雷伯菌或大肠杆菌菌血症而住院的患者延迟适当的抗菌治疗与死亡率之间的关系。

β-内酰胺酶的分类及检测

Bush-J-M分类策略 3组金属酶头孢菌素酶 1组酶EDTA 2e组 2a组 2d组青霉素酶 2c 组 2f组非金属酶 4 组 2be 组广谱酶 2b 2br组
表2 β-内酰胺酶的结构和功能分类分子结构功能举例最适底物抑制剂 (Ambler) (Bush) PEN CARB OX CR CTX ATM IPM CLAV CLOX EDTA 丝氨酸酶 A 2a PC1，LEN-1 卅十－土－－－卄－－ 2b SHV-1,TEM-1 卅十十卄－－－卄－－ 2be K1,TEM-3, 卅十十卄卄卄－卄－－ SHV-2,PER-1 2br TEM-31 卅十十十－－－－－－ 2C PSE-1,BRO-1 卄卅十十－－－十－－ 2e 卄卄－卄卄卄－卄－－ 2f Sme-1,NMC-A 卄十 ? 十十卄卄十－－ IMI-1 C 1 AmpC 卄十－卅十－－－卄－ D 2d OXA-1 卄十卅十－－－ V －－未定 4 AVS-1 卄卄卄 V V －－－－－金属酶 B 3 IMP-1 卄卄卄卄卄－卄－－卄嗜麦芽L-1
A类β-内酰胺酶 1。 A类β-内酰胺酶：广谱酶2b组
A
B
A 大肠埃希菌TEM-1型酶结构；B 肺炎克雷伯菌的SHV-1型酶结构
超广谱β-内酰胺酶(2be) 经典超广谱β-内酰胺酶 TEM型ESBLs SHV型ESBLs SHV-2型ESBLs 、SHV-5 型ESBLs SHVΩ环突变型ESBLs 其他超广谱β-内酰胺酶 CTX-M-型酶可为分4个小组 PER-1及其相关ESBL PER-1、-2 、VEB-1、2 CME-1 TLA-1 特殊的非典型ESBL SFO-1 、GES-1

金属β-内酰胺酶催化机制的研究进展

ｃｎａｎｄｆｅｅｔｉｃｌａｄ．ｈｘｃｌｓｏｔｅｍｅａ．ｎｒｍａｎｃｎｒｖｒｉ１ＴｅｒｃｎｄａｃｅｒｓａｃｏｔｉｉｒｎｎｉｎｓＴｅｅａｔｏｅｆｈｔ１ｏｅｉｏｔｏｅｓａ．ｈｅｅｔｖｎｅｉｔｅｅｒｈｆｚｇｒｉａｎｈ
ｏｔｌｔｃａｉｏｔｌ —— ｃａｓｓａｒｓｎｅｉＰｐｒｆａａｉｍｅｈｎｓｆａｌＤｌｔｃｙｃｍｍｅｏａｍａｅｓｅｅｔｄｉｔｓａｅ．ｗｐｎｈ
Ｋｅｏｄ：Ｍｅｌ — — ｃａｓｓＭＢｓ；ａａｔｃａｉａｔｉｔｓｔｃ；ｉｃｉｓｉｄｎｔｓｙｗｒｓｔｌｌｔａｏａｍａｅ（Ｌ）ｃｔｌｉｍｅｈｎｓｎｉｏｉｒｉａｅｚｎｎｎｉｇｓｅｙｃｍ；ｂｃｅｓｎｏｂｉ
床上还没有有效的抑制剂出现，所以在面对细菌对抗生素的耐药作用时，人们显得束手无策。金属１一３内酰胺酶催化水解包括青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类和头霉素类抗生素时，都需要有锌离子的参与。金属酶在金属离子结合位点都拥有不同数量的锌离子配体，但是金属离子的确切作用仍然是有争议的。本文结合近几年国内外文献，简述了金属１一３内酰胺酶催化机制的研
近年来Ｂ内酰胺类抗生素的大量使用加速了细一
Ｂ内酰胺酶（一ＭＢＬ）。丝氨酸依赖的金属酶的催化ｓ
机制已经被很好的确立了，但是对于ＭＢｓＬ的催化机

β-内酰胺酶及其抑制剂简介

β-内酰胺酶及其抑制剂简介抗菌药是指能抑制或杀灭细菌，用于预防和治疗细菌性感染的药物。

抗菌药包括人工合成抗菌药（喹诺酮类等）和抗生素。

抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。

现临床常用的抗生素有微生物培养液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。

随着抗生素药物使用的大量普及，抗生素耐药形势也日趋严峻。

抗生素耐药的主要机制为产生β-内酰胺酶。

β-内酰胺酶依据分子结构中氨基酸序列差异可主要分为两类，分别是以丝氨酸为活性位点的A、C、D类，还有以金属离子为活性位点的B（金属酶）类。

病原菌产生β-内酰胺酶，致使一些药物β-内酰胺环水解而失活，是病原菌对一些常见的β-内酰胺类抗生素（青霉素类、头孢菌素类）耐药的主要方式。

随着β-内酰胺酶的泛滥，一些β-内酰胺酶抑制剂应运而生。

β-内酰胺酶抑制剂是一类β-内酰胺类药物，可与β-内酰胺酶发生牢固的结合而使酶失活，和其他抗生素联用可增强其抗菌活性，减少其用量。

在治疗微生物感染时，常将β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂联用，治疗效果显著。

本文将对β-内酰胺酶及当前常用的抑制剂(克拉维酸钾、舒巴坦、他唑巴坦)的作用特点作简要介绍，以便于临床医生在应用这类药物时的选择β-内酰胺酶分类根据Bush2-Jacoby-Medeiros的分类法, β-内酰胺酶以底物谱和抑制剂不同分为4组,按各自的氨基酸和核苷酸序列属于A、B、C、D 4 类(表1) 。

第1组是不被克拉维酸抑制的头孢菌素酶,分子类别属于C类,本组酶大部分由染色体介导,也可由质粒介导。

第 2 组β-内酰胺酶数目最多,可被克拉维酸抑制,多由质粒介导。

本组酶根据对青霉素、头孢菌素、肟类β-内酰胺抗生素,邻氯西林、羧苄西林和碳青霉烯类的水解活性分属2a 、2b 、2be 、2c 、2d 、2e 6 个亚组,最近发现的不能被克拉维酸抑制的TEM 型酶和染色体介导的A 类碳青霉烯酶分别属于2br 和2f个亚组,除2d的分子类别为D类,其余各亚组均为类。

NDM-1型金属β-内酰胺酶的生物信息学分析

NDM-1型金属β-内酰胺酶的生物信息学分析叶皓;周永君;黄国娇;殷建华【摘要】目的了解新德里金属β-内酰胺酶1(NDM-1)的氨基酸组成、理化性质、二三级结构和系统进化等,为进一步研究其作用机制和生物学功能奠定基础.方法利用Compute pI/MW、ProtParam、SOPMA等生物信息学方法,对NDM-1进行分析.结果NDM-1的等电点为5.07,疏水性GRAVY值为0.107;二级结构存在螺旋、折叠和转角等,没有信号肽和跨膜区域;三级结构由3个α-螺旋和4个β-折叠片组成;属于Family Lactamase_B (PF00753)蛋白质家族;其基因序列与海洋细菌(Erythrobacter litoralis) HTCC2594的β-内酰胺酶Ⅱ基因同源性最近.结论NDM-1可能起源于环境,通过基因水平转移被传递给临床致病菌,并在抗生素的选择压力下,成为威胁人类健康的全球性问题.%Objective understand the amino acid composition, physico - chemical property, the secondary and tertiary structures, and the phyletic evolution of New Delhi metallo - beta - lactamase 1 ( NDM - 1 ), and to establish the basis for further research on its mechanism of action and biological function. Methods The structureand function of NDM - 1 were analyzed by bioinformatic methods, such as Compute pI/MW, ProtParam, and SOPMA, etc. Results The isoelectric point of NDM - 1 was 5. 07, and the hydrophobicity GRAVY value was 0. 107. There were helix, folding, and reverse turn in the secondary structure, and there were no signal peptide and transmembrane area existed in this structure. The tertiary structure consisted of three a - helixes and four β- sheets. It belonged to the protein family of Lactamase B ( PF00753 ). The gene sequence of NDM - 1 had the closest homology with the β-lactamase II gene of the marine bacterium Erythrobacter litoralisHTCC2594. Conclusion NDM - 1 may probably originate in environmental microbes and be transmitted to clinical pathogenic bacteria through horizontal gene transfer. Furthermore under the selection pressure of antibiotics, it may become a global problem threatening the health of human being.【期刊名称】《西南国防医药》【年(卷),期】2012(022)011【总页数】3页(P1161-1163)【关键词】新德里金属β-内酰胺酶1;生物信息学;同源序列;结构预测【作者】叶皓;周永君;黄国娇;殷建华【作者单位】610083,成都,成都医学院病原生物学教研室;610083,成都,成都医学院病原生物学教研室;610083,成都,成都医学院病原生物学教研室;610083,成都,成都医学院病原生物学教研室【正文语种】中文【中图分类】Q556β-内酰胺酶(β-lactamase)是细菌产生的能够催化水解β-内酰胺环的一类蛋白酶。

金属β—内酰胺酶——抗感染治疗面临的新挑战

膜孔蛋白（ｒ时，菌对亚胺培南耐药，美洛培ＯｐＤ）细对
８年代初期日本从嗜麦芽寡养单胞菌中鉴定出第二０种锌依赖青霉素酶Ｌ型酶，随后又从嗜水气单胞菌和脆弱拟杆菌中鉴定出多种能水解亚胺培南的金属酶。这些酶都由染色体基因编码。该类金属酶分布在蜡样
大的一群能水解碳青霉烯的酶，目前为止至少已发到
现了２８种。本文将综述金属酶及其研究进展。
１金属酶的发现和分布
地治疗产超广谱Ｇ内酰胺酶（Ｓ）一ＥＢ和持续高产Ｃ类头孢菌素酶（ａｍｐＣ酶）的革兰氏阴性杆菌感染 … 。但近年来革兰氏阴性杆菌对碳青霉烯类抗生素的
乎所有的革兰氏阴性病原细菌的生长；别是能有效特
Ａ类酶中的ＧＳ１型酶＿和２群酶Ｉ —、Ｅ－４ＪｆＭＩＩＮｍｃＡ、
Ｓ一… ；类酶中的ＯＸ３２［；金属酶是最ｍｅ１ＤＡ２～７，而
关键词：金属ｐ内酰胺酶；碳青霉烯；革兰氏阴性杆菌
中图分类号：４．３Ｑ３４１文献标识码：Ａ
碳青霉烯类抗生素（包括亚胺培南和美洛培南等）是当今抗菌谱最广的Ｇ内酰胺类抗生素，有效抑制一能（细胞壁缺陷细菌、数非发酵菌和气单胞菌外）除少几
金属．内酰胺酶 —— 抗感染治疗面临的新挑战