组化染色
心梗免疫组化染色
心梗免疫组化染色
心梗免疫组化染色是一种用于研究心肌梗死过程中免疫反应机制的实验方法。
通过这种方法，研究人员可以观察到心肌细胞、淋巴细胞、内皮细胞等在不同阶段的心梗过程中的表达特征，进而揭示心梗发生、发展及修复过程中的免疫调控机制。
心梗免疫组化染色主要涉及以下几个方面：
1. 心肌细胞损伤标志物：如心肌肌钙蛋白I（cTnI）和心肌肌钙蛋白T（cTnT）。
在
心梗发生后，这些标志物会释放到血液中，可以通过免疫组化染色方法检测到。
2. 炎症细胞浸润：心梗过程中，炎症细胞（如淋巴细胞、巨噬细胞等）会参与心肌损伤和修复过程。
通过免疫组化染色，可以观察到这些炎症细胞在不同阶段的心梗组织中的浸润情况。
3. 血管新生：心梗修复过程中，血管新生起着关键作用。
通过免疫组化染色，可以检测到与血管新生相关的因子，如血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素（Ang）等。
4. 免疫抑制微环境：心梗发生后，免疫抑制微环境的建立有助于限制自身免疫反应，促进心脏修复。
通过免疫组化染色，可以观察到与免疫抑制相关的细胞因子和转录因子的表达情况，如转化生长因子-β（TGF-β）和Foxp3等。
心梗免疫组化染色有助于研究人员深入了解心梗发生、发展和修复过程中的免疫调控机制，为寻找新的治疗策略和干预措施提供理论依据。
冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片免疫组化染色步骤一、前言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。
本文将详细介绍这些步骤。
二、样品处理1. 采集样品首先需要采集需要检测的样品。
比较常见的样品包括动物或人类组织、细胞培养物等。
2. 固定样品采集好的组织或细胞需要进行固定处理，保证其形态和结构不受损伤。
固定处理一般使用4%多聚甲醛或4%乙醛进行。
3. 脱水处理为了使样品更易于切割，需要对其进行脱水处理。
脱水处理可以通过将固定好的组织或细胞分别浸泡在70%、80%和95%乙醇中进行。
4. 包埋处理最后，将脱水后的样品进行包埋处理，即将其置于石蜡中，并逐渐加热至60℃以上，直到石蜡完全浸透到样品中。
三、切片1. 制备切片将包埋好的样品切成5-10微米厚的切片。
这一步需要使用专业的冰冻切片机进行，确保切片质量。
2. 将切片悬浮在载玻片上将制备好的切片悬浮在载玻片上，并进行干燥处理。
这一步需要注意，避免样品受到外界污染。
四、抗体染色1. 抗原修复为了提高抗体的结合效率，需要对样品进行抗原修复处理。
这一步可以通过加热或酶解等方式实现。
2. 阻断非特异性结合为了避免非特异性结合，需要在抗体染色前对样品进行阻断处理。
常用的阻断剂包括牛血清白蛋白和小鼠IgG等。
3. 抗体染色将已经稀释好的一抗和二抗依次加入到载玻片上，并进行孵育处理。
这一步需要注意控制反应时间和温度等因素。
4. 显色与荧光显微镜观察最后，通过加入显色剂或荧光染料实现蛋白质的可视化。
观察过程需要使用荧光显微镜进行。
五、总结冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。
在实验过程中，需要注意控制反应时间和温度等因素，以确保实验结果的准确性。
免 疫 组 化 染 色 步 骤
免疫组化染色步骤1.石蜡切片脱蜡和水化。
二甲苯I（10min），二甲苯II（10min），二甲苯&酒精1:1（10min），100%酒精（5min），95%酒精（5min），75%酒精（5min），50%酒精（5min），用PBS洗三次，每次3分钟（3x3`）。
2.抗原修复（微波炉P-100 4-5min煮沸，P-40 维持15min，每隔4-5 min加一次柠檬酸缓冲液，不能烧干片）。
静置缓慢冷却至室温，组化笔画圈将组织圈起来（离组织边缘1-2mm），用PBS洗三次，每次3分钟（3x3`）。
3.封闭内源性过氧化物酶。
每张切片加适量的3%H2O2（将组织块儿覆盖即可），室温孵育15min（湿盒内，防干片），阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗3x3`。
4.封闭。
每张切片加适量的5% 血清或者脱脂牛奶（PBS配，组织块儿覆盖即可），孵育15分钟（湿盒内），以阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗3x3`。
5.除去封闭液，每张切片加适量一抗，室温下孵育60分钟或4℃过夜。
6.PBS冲洗3x5`。
除去PBS液，每张切片加1滴或50μl放大剂(试剂A)，室温孵育10-15分钟。
PBS冲洗3x3`。
7.除去PBS液，每张切片加1滴或50μl多聚酶结合物（试剂B），室温孵育10-15分钟。
PBS冲洗3x3`。
8.除去PBS液，每张切片加1滴或50μl新鲜配制的DAB或AEC溶液（详见DAB 或AEC使用说明书），显微镜下观察5-15分钟（DAB）或10分钟（AEC）。
9.自来水冲洗，苏木素复染（20-30s），自来水冲洗，PBS返蓝。
10.如果用DAB显色，则切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂（详见迈新产品AEC-0038）封片。
可能出现的问题及解决办法:1. 脱蜡不彻底，容易出现非特异性背景染色，建议免疫组化切片脱蜡与常规HE脱蜡分开。
免疫组化染色分类
免疫组化染色分类
免疫组化染色分类，即免疫组织化学染色分析，在肿瘤学领域是一种
对肿瘤病理诊断带来积极意义的技术。
免疫组化染色利用特异性抗体
与肿瘤细胞的表面蛋白进行特异性结合，从而标记出肿瘤细胞的特征，使得医生能够更加精确地制定诊疗方案。
免疫组化染色分类按照抗体种类不同，可以分为多种类型。
其中，常
见的免疫组化染色分类包括：
1. 细胞角蛋白分类：细胞角蛋白属于一类在细胞层和皮肤表面具有重
要生物学功能的蛋白质。
肿瘤的恶性程度与其对细胞角蛋白的表达水
平有着密切关系，在免疫组化染色分类中，医生通常会用抗细胞角蛋
白抗体对肿瘤细胞进行染色，并根据染色结果判断癌细胞的类型。
2. 内皮细胞标记分类：内皮细胞标记分类，是指利用免疫组化染色技
术来检测肿瘤内皮细胞的表面标记，从而帮助医生鉴别肿瘤的恶性程
度及其类型。
3. 酪氨酸激酶分类：酪氨酸激酶分类是一种比较常见的免疫组化染色
分类方法，它通常用于判断癌细胞在生长及转移过程中所表现出来的
特征。
4. 雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）分类：ER和PR是乳腺癌发生的关键因素之一，在免疫组化染色分类中，医生通常会使用免疫组化染色技术来判断肿瘤细胞对雌激素和孕激素的反应能力，从而确定最佳的治疗方案。
总之，免疫组化染色分类技术在肿瘤学领域发挥着非常重要的作用。
通过对不同类型的免疫组化染色分类技术的应用和研究，医生可以更加准确地判断肿瘤的类型和恶化程度，从而制定出更加科学合理的治疗方案，提高治疗效果。
免疫组化染色结果
免疫组化染色结果1. 什么是免疫组化染色？免疫组化染色（Immunohistochemistry, IHC）是一种常用的实验技术，用于检测组织或细胞中特定蛋白质的表达和分布情况。
通过使用特异性抗体与目标蛋白质结合，并使用染色试剂对该结合进行可视化，可以在显微镜下观察到目标蛋白质的位置和数量。
2. 免疫组化染色的原理免疫组化染色基于抗原-抗体反应原理。
首先，需要选择适当的抗体来识别目标蛋白质。
抗体可以是单克隆或多克隆，具有高度特异性和亲和力。
在进行染色之前，需要对样本进行预处理。
通常包括固定、脱水、切片和去蜡等步骤。
这些步骤旨在保持细胞或组织形态学结构并提高抗体与目标蛋白质的结合效率。
接下来，将待测样本与特异性抗体孵育。
如果目标蛋白质存在于样本中，抗体将与其结合形成免疫复合物。
然后，使用染色试剂对免疫复合物进行可视化。
3. 免疫组化染色的应用免疫组化染色在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
它可以用于：•检测肿瘤标志物：通过检测肿瘤特异性抗原的表达情况，可以帮助鉴别不同类型的肿瘤，并评估其预后和治疗反应。
•研究蛋白质功能：通过观察目标蛋白质在细胞或组织中的分布和表达水平，可以了解其在生理和病理过程中的功能。
•诊断和分类肿瘤：根据不同肿瘤细胞表面或内部蛋白质的表达情况，可以帮助确定肿瘤类型、分级和分期。
•评估治疗反应：通过观察治疗前后目标蛋白质的变化，可以评估患者对特定治疗方案的反应。
4. 免疫组化染色结果的解读免疫组化染色结果的解读需要考虑以下几个因素：4.1 阳性与阴性控制在解读结果之前，需要对阳性和阴性控制进行评估。
阳性控制应呈现明亮的染色，而阴性控制则不应出现染色。
4.2 染色强度染色强度可以分为四个级别：无染色（0级）、轻度染色（1级）、中度染色（2级）和重度染色（3级）。
根据目标蛋白质的表达水平，可以对样本进行定量评估。
4.3 细胞或组织分布观察目标蛋白质在细胞或组织中的分布情况。
它可以是细胞膜、细胞质、核内或核外等位置。
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
常用免疫组织化学染色方法
常用免疫组织化学染色方法免疫组织化学染色是通过将抗原与抗体结合来检测组织中特定蛋白质的染色方法。
它是现代生物医学中常用的一种技术，可以用于研究分子生物学、细胞生物学、病理学等领域。
以下是一些常用的免疫组织化学染色方法介绍：1. 免疫组化染色(Immunohistochemistry, IHC)：免疫组化染色是免疫组织化学中最常用的方法之一、其基本原理是使用一种与目标抗原特异性结合的抗体，将抗原与抗体结合，然后通过染色方法将表达该抗原的细胞或组织可视化。
常用的染色剂包括多聚酶、酶标、荧光素和放射性同位素。
IHC可以用于检测细胞表面抗原、细胞器中的抗原以及胞内蛋白质的定位。
2. 免疫荧光染色(Immunofluorescence, IF)：免疫荧光染色利用荧光标记的抗体来检测特定抗原。
它可以提供高度特异性和灵敏度的探测，可以用于研究蛋白质的亚细胞定位、蛋白质相互作用等。
利用该方法可以用于检测多种类型的标记（单标记、双标记、复合标记等），从而实现多重染色或共定位染色。
3. 免疫电镜染色(Immunoelectron microscopy, IEM)：免疫电镜染色是一种将金粒标记的抗体用于电子显微镜下观察并定位特定抗原的方法。
通过将金粒结合到抗原-抗体复合物上，可以在电子显微镜下清晰地观察到抗原的位置和分布。
这种方法具有高分辨率和高特异性的优点，广泛应用于超微结构的研究。
4. 免疫酶标染色(Immunoenzyme staining, IES)：免疫酶标染色是使用酶作为标记物，通过化学反应将抗原与酶标记的抗体结合，从而显示出特定抗原的位置和分布。
常用的标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等。
在检测抗原时，标记物可以与染色底物产生反应生成可见色素，形成染色，以显示抗原的位置和分布。
5. 免疫组织化学原位杂交(Immunohistochemical in situ hybridization, IHC-IS)：免疫组化原位杂交技术是一种结合了原位杂交和免疫组化技术的方法。
免疫组化染色步骤
免疫组化染色步骤：（两步法）第一天下午一、备片1、5微米厚组织涂有APES的胶片，干燥切片烤片：60℃、60-90min。
至蜡融化组织贴在玻片上。
2、二甲苯脱蜡：15minX3。
至蜡消失。
可第一缸时间较长，第二三缸较快。
需上下提洗，加快速度。
3、水化：梯度酒精水化（100%，90%，80%）入自来水。
如未洗净，则片子看上去有油腻感。
洗至看上去非常干净。
也宜上下提洗。
二、免疫组化染色1、3%双氧水封闭10-15min。
（注：现用现配，30%双氧水用蒸馏水稀释1：10）；蒸馏水洗一次，冲一下即可。
2、依据抗体说明热修复，高火每盒3min，然后低火12min。
过夜。
一些抗体比较特殊：CD68、Vimentin、S－100水化后胰酶消化15min，用TBS冲干净后，放入缓冲液中过夜；Kappa、Lambda需修复两次，即低火12min两次；第二天上午3、擦干背面及组织周围的水（注意：分清正反不要擦掉组织）；加1XTBS稀释后一抗30-50微升/张（注：一般为1：50；多抗1：100；可依据抗体说明书摸索）室温40min，TBS洗5min×3次；4、加A液（聚合物增强剂）20min，TBS洗3min×3次；5、加B液（二抗即酶标抗鼠/兔聚合物）30min，TBS洗3min×3次；6、DAB显色（A液B液15μl/1000μl，现配现用）3-10min。
7、显微镜下观察显色满意后自来水终止显色。
8、用Mayer’s苏木素复染核（新配1－2min），分化（盐酸酒精），返蓝（自来水）。
三、脱水（80%，90%，100%酒精）；透明（纯二甲苯3X5min）；封片。
免疫组化配液一、1XTBS：(5000ml，1XTris-NaCl，PH=7.6)二、修复液1、0.01M枸橼酸盐缓冲液：（1000ml，PH=6.0）配置前摇匀，配后摇匀测PH值。
2、10XTris-EDTA抗原修复液：（500ml，PH=9.0）用前稀释10倍3、Mayer’s苏木素甲液：苏木精1g，无水酒精20ml。
免疫组化染色原理
免疫组化染色原理免疫组化染色（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用抗体与抗原间的特异性反应，通过对组织切片进行染色来检测和定位特定分子的方法。
它在病理学和生物医学研究中广泛应用。
免疫组化染色的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
首先将待检测的组织切片进行固定和脱水处理，使得细胞结构的完整性得以保存。
然后，对切片进行抗原修复，以使被检测的抗原重新展开和暴露，以增强抗体的结合。
接下来，将特异性抗体加入样品中，并在恰当的温度和时间下进行孵育，使抗体与待检测的抗原发生结合。
为了检测抗原-抗体结合的位置，可以利用荧光染料或酶标记技术，使配体与抗体结合后的阳性信号得以观察。
在免疫组化染色中，常用的抗体标记方法包括酶标记、免疫荧光、金标记等。
酶标记法的原理是将酶标记的二抗与抗原-一抗复合物结合，然后通过染色底物使酶呈色，形成可见的颜色反应产物。
免疫荧光法则是使用荧光标记的二抗与抗原-一抗复合物结合，然后利用荧光显微镜观察荧光信号的分布，从而实现对抗原位置的定位。
金标记法则是将金标记的二抗与抗原-一抗复合物结合，然后使用增强剂，使金颗粒在光学显微镜下可见。
免疫组化染色可以用于检测和定位多种分子，例如细胞膜蛋白、核蛋白、细胞因子等。
它在病理诊断领域中被广泛应用，可以用于判断肿瘤类型、分子亚型和分级，以及评估免疫治疗的效果。
此外，免疫组化染色也在生命科学研究中发挥重要作用，帮助揭示细胞和组织的分子机制，探究疾病发生发展的机理。
总而言之，免疫组化染色利用抗体与抗原的特异性结合原理，通过染色方法可检测和定位特定分子在组织中的存在和分布。
它在病理学和生物医学研究中的广泛应用，为疾病诊断和相关研究提供了重要的实验手段。
免疫组化染色操作步骤
免疫组化染色操作步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种在组织学上，通过对细胞和组织中一些免疫反应物的特异性染色来研究蛋白质表达和分布的方法。
免疫组化染色操作步骤一般包括以下几个主要步骤：组织固定、切片、抗原修复、抗原阻断、一抗和二抗染色、显色反应和染色质反应控制。
下面将详细介绍每个步骤。
一、组织固定组织固定是将新鲜组织固定在组织学玻片上以保持其形态和结构。
常用的固定剂有甲醛和乙酸（酒精）。
固定剂的选择应根据研究目的和检测的抗原选择合适的固定剂。
甲醛固定对细胞膜蛋白质有较好的保护作用，适用于一些膜蛋白的免疫染色；而乙酸（酒精）固定可以在较短时间内固定组织，适用于快速染色的情况。
二、切片固定好的组织需要进行切片处理，将其切割成5-10微米厚的切片。
常用的器械有冰冻刀、滑刀等。
冰冻刀用于切割冰冻组织，滑刀用于切割固定组织。
切割好的组织切片需要进行干燥处理。
三、抗原修复抗原修复是为了恢复组织中被固定剂破坏的抗原形态。
抗原修复的方法一般有热诱导抗原修复和酶诱导抗原修复两种。
热诱导抗原修复是将切片浸泡在高温的缓冲液中进行加热处理，常用的缓冲液有PBS、Tris等。
酶诱导抗原修复是通过加入蛋白酶K等酶来修复抗原。
四、抗原阻断抗原阻断是为了阻止非特异性的结合，减少假阳性结果。
一般是通过加入牛血清白蛋白（BSA）或小鼠IgG等蛋白质来阻断非特异性结合位点。
五、一抗和二抗染色一抗是指充分体内或体外免疫后所制备的单克隆或多克隆抗体。
在进行一抗染色前，需要对切片进行预处理，如使用过氧化氢或金胶子等对内源性酶进行体外灭活。
一抗的稀释倍数需要根据标示规定，也可以进行实验室优化。
一般在4℃下孵育过夜。
第二天，用PBS进行洗涤后加入二抗。
二抗是对一抗的特异性抗体，通常是兔抗小鼠或小鼠抗兔的抗体。
加入二抗后，需要进行适当时间的孵育，一般是30分钟到1小时，然后用PBS进行洗涤。
六、显色反应显色反应是为了检测所免疫染色的反应物。
免疫组化染色原理
免疫组化染⾊原理⼀、项⽬介绍免疫组织化学IHC。
肿瘤⼀般流程，做HE常规染⾊，确认后进⾏针对性IHC检测分析。
不同项⽬的染⾊位置不同，分为：核染，膜染和浆染。
⼆、乳腺癌案例三种成因，对应三种检测对象：1.Her2，可采⽤罗⽒靶向治疗药物赫塞丁针对性治疗。
2.ER，主要因激素等原因导致的乳腺癌，术后通过调节内分泌有效治疗⽅法。
3.PR，主要因激素等原因导致的乳腺癌，术后通过调节内分泌有效治疗⽅法。
4. 三阴，以上三种测试结果均为阴性的肿瘤，原因不详，可能与转移有关，严重程度⾼。
三、检测流程1. 术后标本⾸先通过甲醛浸泡脱⽔，两⽅⾯：1.1 防⽌细菌滋⽣使标本腐烂1.2 防⽌组织细胞内酶渗透出细胞壁，破坏细胞形态。
2. 包埋，将标本⽤蜡包埋，便于保存和切割。
3. 切⽚，将组织切⽚，2~3微⽶，⽤于测试。
3.1 切⽚机包含⼿动和⾃动，⼿动切⽚机内部通过钢丝绕线，⼿动转动过程进⾏拉伸。
提供2~5微⽶调节旋钮。
3.2 ⾃动切⽚机，原理不详，不排除齿轮⽅案。
只提供特定厚度切换。
4. 上机脱蜡，由于蜡侵⼊组织，反应试剂⽆法进⼊，因此必须先脱蜡后才能反应。
4.1 设置温度80度。
4.2 4分钟清洗⼀次，清洗过程为：加-吹-加。
4.3 由于溶解蜡的液体性能⼀般，需要多次清洗。
5. 抗原修复，甲醛固定时会将位点粘连，导致⽆法与⼀抗结合，因此需要将位点打开，使⽤抗原修复液⾼温修复。
5.1 ⾼压锅⽅案温度达到121度左右，⼿⼯常规⽅式。
5.2 ⼀般采⽤三种⽅式修复：化学⽅法，微波⽅法和加热⽅法。
设备采⽤化学（抗原修复液和加热组合⽅式）5.3 上机95摄⽒度⽅案同121度⽅案偏差不⼤。
5.4 ⼲⽚问题，如果出现⼲⽚，容易导致组织皱缩，影响最后的组织观察。
5.5 ER种类包括三种：PBS（缓冲液，ph7，磷酸盐成分，容易结晶且难以去除，可使⽤84消毒液或冰⼄酸溶解，容易使长菌，5天左右可出现蓝-藻类、深⾊半点-霉菌）、CBS（ER1，ph6）、EDTA（ER2，ph9）6. 添加ER过程中需要补液，由于抗原修复液中含有⽔和特殊物质，⽔沸点低，补液过程特殊物质浓度逐渐增加且残留在玻⽚上，因此需要pbs进⾏单独清洗。
免疫组化染色操作步骤
免疫组化染色操作步骤
1.准备染色：将需要染色的组织切片用4%-10％的甲醛溶液处理，然后放入0.2%的甲醛溶液中浸泡10-15分钟，除去水分后，用石蜡或玻璃滑片冰冻干燥后备用；
2.细胞选择：将滑片放在温度为60℃的预处理室内，经过5分钟的预处理，清除细胞的表面活性物质；
3.免疫化学染色：选择适宜的免疫染色培养液，将其放入干燥的滑片上，放入正常培养的锅炉内，温度在37℃；持续室温处理60min，以停止免疫反应；
4.洗涤：将染色滑片放入PBS洗涤3次，每次洗涤10min，使抗体与反应物完全稳定，以避免多余的洗涤对结果的干扰；
5.染色：将抗体连接到细胞上，使用应用适当的洗涤液将染色滑片淋洗；然后使用适当的染料进行染色，建议使用DAPI染色，因为其能够在高度细胞存在下染色，或者使用其他染色方法，比如无铁紫藤染色，铜绿假单胞菌染色等；
6.滤过：将染色滑片分批放在滤纸上，进行滤过，以减少染料在细胞上积累的可能性；
7.拍摄：使用荧光显微镜拍摄染色细胞，绘制免疫组化染色的结果图片，为最终研究结果的分析提供数据支持。
骨髓片组化染色
2.２滴H2Ｏ２＋５ｍｌH2O（蒸馏水），混匀后直接加于上步玻片上（１：１比例），混匀，５ｍｉｎ后水洗
3.９５％乙醇脱色１０ｍｉｎ，水洗，干燥
4.瑞氏染色３０ｍｉｎ，水洗，干燥
结果判读：
（-）无棕黑色颗粒
（+/-）散在稀疏的小颗粒
（+）颗粒较粗，局部分布
（+/-）少量红色颗粒1-3个
（+）少量红色颗粒4-10个
（++）红色颗粒>10个
（+++）暗红色粗大颗粒
（++++）紫红色粗大颗粒
附：
原单：胞浆边缘或伪足呈颗粒状
原粒：胞质内均匀弥散细小颗粒
原淋：粗大颗粒（核周）
阳性程度：粒<单<淋，M7 PAS最强。（异常早幼粒，内浆弥散状，外浆细小颗粒）
ＰＯＸ（过氧化物酶）：
⑷、复染苏木素复染１０ｍｉｎ，水洗，干燥
附：CE缓冲液配制（PH7.6）Na2HPO4 87ml+KH2PO4 13ml混匀
AE（非特异性酯酶）：
⑴、固定玻片先用甲醛固定10min,水洗，干燥
⑵、Ａ液0.005gAE萘酚0.5ml丙酮（先加）0.5ml丙二酮（再加）
B液取锥形瓶，加入PH7.0AE缓冲液20ml
⑶、用吸管吸取A液慢慢滴加入B瓶内，边加边摇晃锥形瓶
⑷、加入坚固兰0.02g充分混匀后再分为a,b两管。a管10ml插入AE玻片，
b管加入0.015gNAF，插入+NAF玻片，37℃水浴1h,放在流水下冲洗10min，待干
5复染苏木素复染5min,水洗，干燥
免疫组化染色
免疫组化染色一．石蜡切片免疫组化染色实验步骤：1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置60℃1小时）。
（1）二甲苯I、II,各10分钟。
（2）梯度酒精：100%，2分钟→ 95%，2分钟→ 80%，2分钟→ 70%2分钟。
（3）蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。
2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温10分钟（避光）。
3．蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。
4．抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。
附：抗原修复液（10mM pH 6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制（1）储备液的配制：A液：枸橼酸三钠-2H2O 29.41g + 蒸馏水1000mlB液：枸橼酸21g + 蒸馏水1000ml（2）工作液的配制：A液82ml + B液18ml + 蒸馏水900ml抗原修复的方法：（1）高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH6.0）,淹没切片,盖上锅盖，高压锅内煮沸,上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。
（2）微波处理技术:用塑料切片架,置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸钠缓冲液淹没切片，选择中高或高档,5分钟;取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再选择中高或高档,5分钟.（最佳温度为92~95℃）（3）酶消化处理：此略。
抗原修复的注意事项：（1）组织不能干。
（2）选择抗原修复方法要因抗体而异。
（3）该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。
（4）抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。
5．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
6．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态）,滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。
附：正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制)按1:20比例,用PBS配制,每张切片需要量按50μl+5μl (10%抛洒量)计算。
7．滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃2小时（也可置于4℃冰箱过夜）。
免疫组化染色流程和作用
免疫组化染色流程和作用
免疫组化染色是一种利用抗原抗体特异性结合原理，对组织或细胞内的抗原进行定位、定性及相对定量的实验手段。
以下是免疫组化染色的基本流程和作用：
1. 切片制备：将组织样本制作成切片，以便后续处理。
2. 脱蜡：将切片在脱蜡液中浸泡，以去除石蜡包埋剂。
3. 抗原修复：使用抗原修复液对切片进行加热，以暴露抗原。
4. 阻断：加入阻断液，以抑制内源性过氧化物酶的活性，减少背景染色。
5. 加一抗：将一抗加到切片上，使其与抗原特异性结合。
一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
6. 加二抗：将二抗加到切片上，与一抗结合，进一步放大信号。
二抗可以是荧光标记、酶标记或金属离子标记等。
7. 显色：根据所用标记物的不同，选择适当的显色液进行染色。
常用的显色液有DAB、APAAP等。
8. 复染：用苏木素或其他染料对切片进行复染，以便更好地观察组织结构。
9. 封片：将染色好的切片用中性树胶封片，防止褪色和脱落。
10. 观察：在显微镜下观察染色结果，记录阳性或阴性反应，并进行定量或定性分析。
免疫组化染色的作用包括：
1. 确定组织来源：通过免疫组化染色可以检测组织中特定抗原的表达，从而确定组织来源。
2. 鉴别肿瘤类型：免疫组化染色可以用于鉴别不同类型的肿瘤，如腺癌、鳞状细胞癌、神经内分泌肿瘤等。
3. 分化程度评估：免疫组化染色可以检测肿瘤细胞的分化程度，评估其恶性程度。
4. 寻找肿瘤转移灶：通过检测特定抗原的表达，可以寻找肿瘤转移灶。
5. 协助病理诊断：免疫组化染色可以为病理医生提供更多信息，协助其做出更准确的诊断。
常用免疫组化染色要点
常用免疫组化染色要点1、取材对于活检或手术切除标本应在2小时内取材或固定，避免组织自溶及抗原变性等影响免疫组化结果。
取材时为避免挤压组织，尽量使用锋利刀片，并且避开坏死组织。
取有代表性的肿瘤组织。
2、固定标本用10%中性缓冲福马林固定液 (甲醛10ml + 0.01M ph7.4 PBS 90ml)固定12-18小时，不超过24小时。
有些单位采用先固定标本后取材的工作程序。
此时要注意，比较大的肿瘤应该切开固定，避免肿瘤中心部分固定不及时。
3、脱水．透明、浸蜡、包埋、切片等按照常规方法用自动脱水机脱水、透明、浸蜡。
注意温度不要超过60℃。
玻片处理：彻底清洗，烤干后1:10多聚赖氨酸涂抹玻片，风干。
组织切片厚度4-5微米。
烤片50-60℃，2-3小时以上。
常规脱蜡入水。
4、常用检测系统选择SP三步法：敏感度大于EnVision、EliVision约1-2倍，但不宜用于富含亲生物素物质的组织，尤其对肝、肾组织很容易造成非特异性着色。
EnVision、EliVision两步法：特异性强，可以避免生物素非特异性结合。
5、免疫组化步骤抗原修复高温高压pH6.0柠檬酸盐缓冲液修复，适用于绝大多数抗原。
需要用95℃热水浴EDTA（pH9.0）修复20分钟。
适合于：CD10、CD138、Bcl-6、MuM1、VEGF、CD31、CD117、CD30、Cyclin D1、TdT、ALK。
不需要修复的抗体：GST-π等。
需要胃蛋白酶消化的抗体：EGFR，EBV。
在此后整个染色过程中，切片不能干燥，否则会造成非特异着色。
pH7.4 0.01M PBS（或者TBS）缓冲液浸洗切片5分钟×3次（下同）。
室温下将切片浸入 3% H2O2溶液10分钟，以阻断内源性过氧化物酶作用（显色后红细胞如果着色，说明H2O2 浓度不够，不能抑制内源性酶）。
PBS洗后拭去组织周围多余的水分，离组织切片周围约2mm处以防渗笔圈定。
注意细节: 组织切面上水分不要过多；抗体液量适当；液体不能流离到组织外，玻片平置，等。
组化染色结果解释
铁染色结果解释8.1正常人细胞外铁：＋～＋＋。
幼红细胞染为鲜红色，胞浆成淡黄红色，铁粒呈蓝绿色，定位于胞浆中含铁的部位。
8.2 缺铁性贫血时，骨髓细胞外铁和内铁显著减少或消失，铁粒幼红细胞阳性率为0～16%，平均为4%，铁颗粒极少并着色浅，以Ⅰ型为主，Ⅱ型者极少，Ⅲ型以上者不见。
8.3 溶血性贫血，巨幼红细胞贫血，脾亢，AA，AL，慢性肾炎伴尿毒症和多次输血等病人的细胞外铁可以增高，细胞内铁以Ⅰ型和Ⅱ型为主，可以见到Ⅲ型，不见Ⅳ型。
因此有助于鉴别IDA与非IDA。
8.4是诊断铁粒幼红细胞贫血的重要依据，能发现数量不等的环状铁粒幼红细胞，并且多见粗颗粒的Ⅲ型和Ⅳ型铁粒幼红细胞。
8.5骨髓增生异常综合征时，细胞外铁丰富。
铁粒幼红细胞的百分比增高，常见环状铁粒幼红细胞。
在铁粒幼细胞性难治性贫血中，环状铁粒幼红细胞≥15%时，对诊断有重要意义。
POX结果解释8.1. 过氧化物酶的阳性颗粒呈蓝色或蓝黑色，定位于胞浆中。
8.2.原粒细胞通常是过氧化物酶阳性，而淋巴细胞是阴性。
8.3. 不仅粒细胞和单核细胞嗜酸和嗜碱细胞也是阳性。
Auer rods也为过氧化物酶阳性。
8.5. 原粒细胞的过氧化酶阳性颗粒较多较粗；单核细胞的颗粒细小弥散。
然而大多数的原单核细胞过氧化物酶呈阴性反应。
8.6. 已证实一些骨髓增生异常综合征的病人和遗传性过氧化酶缺乏的病人，其中性粒细胞的过氧化物酶为阴性。
AKP结果解释8.1. AKP染色时，细胞核染淡绿色，阳性颗粒呈红色或棕红色，定位于胞浆中。
8.2.AKP的参考值各地的报道差异极大，一般认为成人阳性率为10～40%，积分为13～80之间，小儿稍高，60岁以上老年人较低。
8.3.AKP只存在于成熟的中性粒细胞中，特别是中性分叶细胞。
网状细胞，骨髓基质也会出现阳性。
8.4.AKP升高：在化脓性感染，类白血病反应，骨纤，PR，ALL，CML-BT，MM，神经母细胞瘤，AA，ITP，淋巴瘤，妊娠期，垂体-肾上腺皮质功能亢进和应用肾上腺皮质激素时AKP积分值均升高。
肿瘤成纤维细胞组化染色
肿瘤成纤维细胞组化染色
肿瘤成纤维细胞组化染色是一种常见的肿瘤病理学技术，通过染色方法可以对肿瘤组织中的成纤维细胞进行检测和鉴定。
成纤维细胞是一种重要的组织细胞，它们在肿瘤的形成和发展中起着重要的作用。
成纤维细胞是一种间质细胞，主要存在于结缔组织中。
在肿瘤中，成纤维细胞的数量和活性通常会增加，它们可以合成和分泌胶原蛋白、纤维连接蛋白等基质分子，从而形成肿瘤的基质支架。
此外，成纤维细胞还可以分泌多种生长因子和细胞因子，如TGF-β、VEGF 等，这些因子能够促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。
肿瘤成纤维细胞组化染色通常使用免疫组化染色技术，通过特异性抗体与成纤维细胞表面的标志物结合，从而实现对成纤维细胞的检测。
常用的标志物包括胶原蛋白、纤维连接蛋白、α-SMA等。
这些标志物可以在光镜下显示为棕色或紫色的颗粒或颜色。
通过肿瘤成纤维细胞组化染色，可以对肿瘤的侵袭性和预后进行评估。
一些研究发现，肿瘤中成纤维细胞的数量和活性与肿瘤的恶性程度和预后密切相关。
高数量和活性的成纤维细胞往往与肿瘤的侵袭性增强和预后较差相关。
肿瘤成纤维细胞组化染色是一种重要的肿瘤病理学技术，通过对成纤维细胞的检测和鉴定，可以评估肿瘤的侵袭性和预后。
这一技术
对于肿瘤的诊断、治疗和预后评估具有重要的临床意义。
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单核系：原单阴性，幼单及成熟单弱阳性，阳性 颗粒少，细小，大小不均，弥漫分布不均。
幼红、淋巴细胞、浆细胞、巨核细胞：阴性
【临床意义】
1、帮助鉴别急白类型 首选
1） 急白类型鉴别
急性淋巴细胞白血病其阳性率<3%。
急粒阳性。
【临床意义】
3）急性早幼粒细胞白血病（强阳）与急性单
核细胞白血病的鉴别。 4）急性单核细胞白血病与组织细胞白血病或 恶组鉴别：急单时幼单和单核细胞呈弱阳性， 异常组织细胞阴性。
【正常血细胞染色反应】
•单核细胞系：各阶段均可呈阳性
•粒细胞系：各阶段细胞呈阴性，少部分弱阳 性 •巨核细胞：阳性 •淋巴细胞：各阶段呈阴性，少数可呈弱阳性 •幼红细胞：多为阴性，少数可呈弱阳性反应
仅单核细胞的阳性反应可被NaF抑制。
【临床意义】
1．鉴别急白类型：
•急性单核细胞白血病：白血病细胞呈强阳性 此反应可被NaF抑制 •急性粒细胞白血病：可呈弱阳性反应， 不被NaF抑制 •急性粒单核细胞白血病：具有以上两型白血病染 色反应特征 •急性淋巴细胞白血病：可呈阳性，不被NNaF抑制
【临 床 意 义】
有助于慢粒和类白的鉴别和进一步明确慢性粒 细胞白血病的诊断。
慢性粒细胞白血病和慢性中性粒细胞白血病的 鉴别：前者慢性期时积分明显降低，后者明显 增加。 初步鉴别感染类型：细菌性感染时明显增加， 病毒性感染时常无明显变化。
【临 床 意 义】
PNH和再生障碍性贫血（AA）的鉴别：前者 积分减低，后者积分增高。 急白类型的初步鉴别：急粒时积分减低，急淋 时积分一般增高。 其他：恶性淋巴瘤与恶性组织细胞病；恶性组 织细胞病与反应性组织细胞增多症；真性红细 胞增多症与继发性红细胞增多症；原发性血小 板增多症与继发性血小板增多症。
【临床意义】
2、成熟中性粒细胞POX活性变化 活性增高：再障、感染、急淋、慢淋 活性减低：急粒、慢粒、急单、骨髓增生异 常综合征（MDS）、放射病、退化性中性粒 细胞。
苏丹黑染色
SB 与POX基本一致。可用陈旧涂片染色。
（三）酯酶染色
酯酶：能够水解有机或无机酸醇酯的酶。 水解长链脂肪酸的酶称特异性酯酶SE。
【临床意义】
2．红血病、红白血病： 异常幼红细胞呈阳
性，阳性反应不被NaF抑制。
（四）过碘酸-雪夫反应 （periodic acid-Schiff reaction， PAS）（糖原染色）
【原 理】
含 乙 二 醇 基 （ -CHOH-CHOH- ） 的 糖 类 （含糖原、粘多糖、糖蛋白、糖酯等）被过 碘酸（氧化剂）氧化，生成二醛基(CHOCHO)，与雪夫试剂反应，使雪夫试剂中无 色品红变为紫红色沉淀，定位于含有多糖类 的胞浆中。
【临床意义】
3、其他：
高雪氏细胞和尼曼-匹克细胞：前者强阳性，后者 弱阳性，且空泡处为阴性。
不典型巨核细胞与R-S细胞：前者强阳性，后者 弱阳/阴性。
（五）中性粒细胞碱性磷酸酶染色 （neutrophilic alkaline phosphatase,NAP）
【原
理】
方法：钙-钴法（置换反应）
4、非缺铁性贫血
•如溶贫、巨幼贫、再障、地贫、白血病，内/外铁正 常/升高。 •长期慢性感染引起的贫血、继发性贫血：内铁可减 低，外铁不少。
四种常见类型白血病的细胞化学染色结果 M3
POX染色 NAS-DCE α-NAE染色 α-NAE染色+NaF PAS 强阳性 强阳性 强阳性 不抑制 强阳性
急粒
–Ⅲ型（3分）：胞浆内含6-10个铁小粒，或1-4个粗 大铁粒。 –Ⅳ型（4分）：胞浆内含11个以上铁小粒，或5个以 上粗大颗粒。
–环形铁粒幼细胞指细胞内有铁粒的幼红细胞所含铁 粒>6个（含6个），围绕核周1/2以上及环核排布者
–细胞内铁：阴性
参考值：
正常人以Ⅰ型为主，少量Ⅱ型，无Ⅲ、Ⅳ型、环 形铁粒幼细胞。
第三章
常用的细胞化学染色方法
一、概述 定义：细胞化学染色是细胞学和化学相结合而 形成的一门科学。它以细胞形态学为基础， 结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种 化学物质作定性、定位、半定量分析的方法。 基本要求：原位显示细胞成分与结构
二、细胞化学染色的基本步骤
固定
成色 复染
常用化学法固定，如甲醛、甲醇、乙 醇、丙酮等。
水解短链脂肪酸的酶称非特异性酯酶NSE。
【分布】
特异性酯酶分布较局限，主要存在于中
性粒细胞和肥大细胞浆中。
非特异性酯酶分布较广，以单核、淋巴
系最丰富，粒系亦有。
单核系的酯酶易被氟化钠所抑制，粒系的 则不能，借此可将粒、单区分。
[一]特异性酯酶染色 (specific esterase,SE)
阳性反应为蓝 色颗粒，定位 于胞浆中
【临床意义】
主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型。 急性粒细胞白血病：原粒阳性或阴性 急性早幼粒细胞白血病：白血病强阳性 急性单核细胞白血病：原单及幼单几乎为阴性 急性粒单细胞白血病：粒系呈阳性，单核系几乎呈 阴性 急性淋巴细胞白血病：白血病细胞呈阴性反应
形成有色沉淀，显示出被检测的化学物 质。反应种类：偶氮偶联、联苯胺、普 鲁士蓝、雪夫试剂、钙钴沉淀 核复染：苏木素、甲基绿、中性红、 核固红、沙黄 浆复染：伊红、亮绿
三
、
临
床
应
用
1、辅助判断急性白血病的细胞类型。 2、辅助血液系统疾病的诊断和鉴诊。 3、观察疾病疗效和预后。 4、发病机制的探讨。
（一）过氧化物酶染色（peroxidase,POX）
【临床意义】
1、红细胞系统疾病中的应用
红血病或红白血病、骨髓增生异常综合征，幼红可呈阳性。 某些红系良性疾病，如缺铁贫、地贫、铁粒幼细胞性贫血，幼 红可呈阳性。 巨幼贫、溶贫、再障时幼红呈阴性。
有助于巨幼贫与红白血病、再障与骨髓增生异常综合 征鉴别。
【临床意义】
2、三种白血病鉴别
急淋：白血病细胞阳性率增高，阳性物呈粗颗粒状或大块状。 急单：白血病细胞可呈阳性，阳性物小而多，弥散分布，胞 浆边缘处颗粒较粗大。 急粒：白血病原始粒细胞呈阴性或弱阳性，阳性物均匀分布、 细颗粒状或均匀红色。 恶性淋巴瘤：阳性率高、阳性强，呈块状或粗颗粒状。
理】
Fe4[Fe(CN)6] +12K+
【染色结果】
阳性反应为蓝 绿色颗粒。
【细胞内铁结果判断】
1、细胞内铁检查及分型标准
改用油镜，计数100个中、晚幼红细胞，并分型。
低倍镜下选择涂片体部较薄，细胞分布均匀的部位，
细胞内铁结果判断
–Ⅰ型（1分）：胞浆内含1-2个铁小粒。
–Ⅱ型（2分）：胞浆内含3-5个铁小粒。
【原 理】
POX
方法：二氨基联苯胺法
H2O2 H2O+[O]
二氨基联苯胺
-2H金黄色沉淀【染色应】阳性反应为蓝 黑色颗粒,分布 细胞的胞浆中。
【结果判断】
强阳性：颗粒粗大，密布于 整个胞浆 阳性：颗粒略粗，分布较密集
弱阳性：颗粒小，分布稀疏 阴性：无颗粒
【正常血细胞染色反应】
粒系：原粒Ⅰ型阴性，Ⅱ型阳性；早幼粒以下 均呈阳性，随着细胞成熟度阳性反应程度逐渐 加强。 嗜酸性分叶核粒细胞：阳性，颗粒更粗大。 嗜碱性分叶核粒细胞：阴性。
阳性或阴性 阴性或阳性 阴性或阳性 不抑制
急单
阴性或弱阳性 阴性或弱阳性 阳性或强阳性 抑制
急淋
阴性 阴性 阴性或阳性 不抑制 阳性，呈粗颗 粒状
阳性，呈均匀 阳性，呈细颗粒 红色 状
小结
细胞化学染色以细胞形态学为基础，结合运
用化学反应的原理对血细胞内的各种化学物 质作定性、定位、半定量分析的方法。
参考值：
正常人“+”-“2+”
报告方式：
细胞外铁：X+
【临床意义】
诊断缺铁性贫血
外铁明显减低或消失，内铁减低。
诊断铁粒幼细胞性贫血
铁粒幼细胞增多，出现较多环形铁粒幼 红细胞，铁粒粗大；外铁2+-3+。
【临床意义】
3、骨髓增生异常综合征中的应用 •伴环形铁粒幼红细胞增多的难治性贫血，其环形铁 粒幼红细胞大于15%，细胞外铁也常增加。
β甘油磷酸钠 NAP 甘油+磷酸钠 硝酸钙 磷酸钙 硝酸钴磷酸钴 硫化铵 硫化钴↓
偶氮偶联法为ICSH推荐，方法简单、快速、 稳定、反应步骤少；缺点是试剂不易得，较贵。
【染色反应】
阳性反应为灰黑 色沉淀。
【结果判断及分级】
（++++）4分：全部胞浆充满粗大棕 黑色颗粒而呈深黑色，黑色沉淀甚 至掩盖于胞核上。 （+++）3分：胞浆中已基本充满棕 黑色颗粒，但颗粒之间有空隙。
常用于白血病、贫血等血液系统疾病的诊断
和鉴别诊断。
小结
临床常用的细胞化学染色有：过氧化物
酶染色、中性粒细胞碱性磷酸酶染色、 酯酶染色、糖原染色、铁染色。
第四章 骨髓活检
（一）与骨穿相比有以下优点： 1. 能较全面了解、真实衡量造血组织增生程度。 2. 当骨髓干抽、血稀时，诊断困难，需要辅以骨 髓活检才能诊断。 3. 可观察重要的骨髓组织学变化，如骨髓纤维化、 骨髓坏死、骨髓肿瘤、淀粉样变。
【染色反应】
阳性反应为红 色沉淀，定位 于胞浆中
【正常血细胞染色反应】
粒系：原粒（-），随着粒系细胞的逐步成 熟，阳性反应的程度逐渐增强，出现弥漫性 红色胞浆和红色颗粒。 单核系：原单（-），幼单及成熟单（+）， 颗粒少、小，弥散，细砂状。 正常幼红：阴性 巨核细胞、血小板：阳性 淋巴细胞：阴性/阳性，阳性粗颗粒块状
氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色