southern blot 杂交

Sourthern 杂交

（1）DIG-DNA标记：a）取1 μg的模板DNA加入灭菌双蒸水至16 μL体积；b）将16 μL的模板DNA置于100℃水浴变性10 min，之后迅速置于冰上冷却；c）加入4 μL混匀后的DIG-High Primer，混合均匀后离心，置于37℃水浴20 h 以上；d）65℃水浴10 min终止反应。

（2）基因组DNA的酶切消化、电泳以及变性：a）用限制性内切酶酶切基因组DNA（30~60 μg），点样跑胶以较低的电压3 v/cm电泳酶切样品；c）将凝胶转移至含1.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L NaOH的变性液中，室温轻轻振荡30 min，使凝胶中的基因组DNA变性（注意中间可以换液1次）；d）倒去变性液，用去离子水清洗3次，然后加入0.5 mol/L Tris-HCl，1mol/L NaCl（pH8.0）的中和液室温轻轻摇动洗涤30 min。

（3）DNA转膜：a）将带电荷的尼龙膜漂浮于含去离子水的平皿中，直至尼龙膜完全浸湿，然后转移至碱性转膜缓冲液（0.4M NaOH, 1M NaCl）中浸没5 min；b）在水平玻璃板放一张厚的滤纸（20 cm × 20 cm）作为滤纸条，待完全湿润后，用玻璃棒轻轻滑动以赶走气泡；c）从转膜缓冲液中取出浸泡过的凝胶，置于滤纸条的中央，用玻璃棒轻轻滑动，使得凝胶与滤纸条之间没有气泡；d）用塑料薄膜封闭凝胶的边缘，确保尼龙膜的边缘不能与滤纸条接触，然后吸取转膜缓冲液将凝胶表明湿润，再将尼龙膜置于凝胶上面，确保尼龙膜与凝胶之间无气泡；e）再取两张与尼龙膜同等大小的厚的滤纸置于尼龙膜的上面，用玻璃棒轻轻滑动赶走气泡；f）剪取一叠同等大小的纸巾置于两张滤纸上，再在上面平放一玻璃板，用400 g砝码压平稳，静置转移约12~24 h，期间需要频繁更换纸巾数次；h）弃纸巾、凝胶以及滤纸，在尼龙膜上用铅笔标记加样孔的位置以及方向，然后浸没于中和缓冲液（0.5M Tris-HCl, 1M NaCl）中，达30min，注意中间换洗1次，然后在10× SSC溶液中浸泡5min；i）将尼龙膜置于1张干净的滤纸上，自然风干；j）将尼龙膜置于紫外交联仪（70000 μJ/cm2）照射，正面朝上，使得DNA 固定交联到尼龙膜上。

（4）探针杂交过程：a）将含有靶DNA的尼龙膜浸于盛有6× SSC的平皿中，直至尼龙膜自上而下完全浸湿，浸泡2 min；b）用镊子将尼龙膜放入杂交管中，确

保尼龙膜与杂交管之间无气泡；c）将适量体积的预杂交液（DIG Easy Hyb，10 mL/100cm2尼龙膜）预加热到杂交温度（37℃~42℃），然后轻轻沿着杂交管壁倒入杂交管中，拧紧管盖，放入杂交炉中（37℃~42℃）预杂交30 min(预杂交时间可以延长至2h，预杂交延长有利于降低背景)；d）预杂交结束后，将DIG标记的DNA探针（约25 ng/μL DIG Easy Hyb）在沸水浴中变性5 min，并迅速放到冰上冷却；e）将变性的探针加入预热的DIG Easy Hyb（3.5 mL/100 cm2尼龙膜）中混匀，并避免泡沫形成；f）倒掉预杂交液并加入探针/杂交液混合液，于42℃温浴过夜；g）含有DIG标记的DNA探针的DIG Easy Hyb保存于-20℃，可以重复使用几次，但在使用之前必须置于68℃条件下变性10 min；h）杂交结束后，在42℃下，用足量的2× SSC，0.2% SDS混合液洗膜2次，每次5 min；i）在68℃下，用68℃预热过的0.5× SSC，0.1% SDS混合液洗膜2次，每次15 min。（5）免疫显色：a）15~25℃，转移至100 mL Washing buffer中，摇动温浴l~5 min；b）15~25 ℃，浸没于l00 mL Blocking solution 中，摇动温浴30 min；c）15~25℃，浸没于20 mL Antibody solution 中，摇动温浴30 min；d）15~25 ℃，用l00 mL Washing buffer 洗膜2 次，每次15 min；e）15~25℃，浸于20 mL Deteetion buffer中平衡2~5 min；f）将膜表面的水分吸干后，在膜的正面加入1 ml CSPD（via 5），并使液体均匀覆盖膜的表面，之后用保鲜膜包裹，尽量避免气泡，在黑暗孵育10 分钟，用LAS4000 化学发光成像系统自动曝光并保

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