southern blot 杂交
southernblot知识
一、Southern杂交问题1：电泳后发现凝胶中DNA扩散，导致结果难以确定，如何解决这一问题？解决方案：（1）在操作上：电泳时隔孔上样，电泳后要对凝胶及时处理使凝胶干燥；（2）琼脂糖的质量应该较好，尤其是不应含有内切酶，否则有时将使低拷贝数基因的杂交结果难以解释。
问题2：传统方法中转膜不完全的问题如何克服？解决方案：经典的向上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至24小时以上,也不能使大分子DNA良好地转移出去,因此,转膜不完全。
向下转膜法由于不需在吸水纸上增加重量,凝胶基本不变形；加之吸水纸的吸力与水受到的重力方向一致,故可以良好地完成DNA的转移,它不需要特殊的仪器,转移速度较快,转移效率高。
利用地高辛标记探针进行 Southern 杂交时，对于大于15kb的 DNA片断，转膜之前用盐酸进行脱嘌呤可以促进转膜效率, 但脱嘌呤过度可导致分子量相对较小的 DNA 被打断成过小的片段而难以和尼龙膜结合。
如果实验转膜过程中同时含有大于 15kb的DNA(通常为基因组)和小片段DNA(通常是基因组酶切产物)，那么在转移的过程中倾斜容器，仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸，这样既可以提高大片断 DNA 的转移效率，又不会打碎小片段DNA。
另外，等采用琼指糖凝胶直接杂交的方法，来解决这一难题：以转基因鼠的检测为例，实验步骤如下：1.转基因鼠的建立：以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’调控区指导人G-CSF 基因为构件，建立转基因小鼠。
转基因小鼠的检测采用剪取鼠尾DNA做Southern进行鉴定。
2.琼脂糖凝胶直接杂交:(l)用BanHI(150U)对由假孕鼠产生的仔鼠剪尾提取基因组DNA10μg酶切过液，取少量电泳检查酶切完全后，上样电泳8小时，(2)将电泳槽板连同凝胶置50℃放置3小时，用镊子轻轻揭起凝胶，放于变性液(0.5MNaOH，0.5MNaCl)20分钟，转置中和液(0.5MTrisHCl，0.15MNaCl)20分钟，将胶放于玻璃板上沥干液体，室温放置30分钟。
实验十一 Southern杂交分析
的转移。
固定操作：将DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：
如果你想采用 紫外交联的方法
（尼龙膜）
，烘烤（尼龙膜） ，烘烤（尼龙膜）
那么 将刚转好的湿润的尼龙膜DNA面向上放到保鲜膜上。 用紫外交联仪交联这块湿润的膜，DNA面向上。
DNA转移和固定 紫外光盒 或者商业化可用于紫外交联的其他设备
试剂 灭菌的双蒸水 pH8.0 灭菌的EDTA 地高辛洗涤和封阻缓冲组合*或者TE 缓冲液 洗涤缓冲液；马来酸缓冲液 检测缓冲液；TE缓冲液
2×SSC 或者20×SSC
杂交
尼龙膜，带正电荷 杂交袋或杂交管， 注意：当用地高辛杂 交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。
注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的。
充分混合DIG-High Prime（1号管），并取4μL加入到变性DNA中， 混合并简单离心。
孵育1小时或者过夜。
注 意 ： 较 长 的 孵 育 时 间 （ 最 高 达 20 小 时 ） 能 够 提 高 地 高 辛 标 记 DNA的产量。
加入2 μL 0.2 M EDTA（pH 8.0）和/或 65℃加热10分钟终止反应。 注意：采用地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可 以从200 bp到1000 bp甚至更长，这主要取决于原始模板DNA的长 度。
杂交工作溶液的制备
分两次小心的将64mL无菌双蒸水加入到地高辛杂交颗粒瓶（7号瓶）中，然后 立即在37℃条件下搅拌5分钟进行溶解。
杂交温度
适宜的杂交温度是根据GC含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的，具体 的公式如下：Tm =49.82+0.41(%G+C)-(600/I) {I=能够杂交上的片段的长度 ，以碱基对进行计算} Topt.= Tm -（20～25℃） 这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得 到的。 用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度Topt. 要比计算出的Tm低20-25℃。 Topt. 可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有18%的错配。当 你的探针与靶序列的相似度低于80%时，你应该相应的降低Topt（大约每1%的错 配要降低1.4℃），同时相应的调整严谨洗涤步骤（即提高SSC浓度和降低洗涤 温度）。
蛋白核酸杂交转印膜(PVDF膜和尼龙膜)介绍
蛋白、核酸杂交转印膜（PVDF、尼龙膜）技术介绍转印膜：用于蛋白质和核酸的转移和检验过程的微孔膜。
Southern blot：又称Southern 印迹杂交，是研究DNA 图谱的基本技术。
Northern blot：又称Northern 印迹杂交，与Southern blot 方法类似，是检测RNA的基本技术。
Western blot：又称Western 印迹杂交，与Southern blot 方法类似，是蛋白质检测分析的基本技术。
转印膜在蛋白质和核酸的转移和检测过程中应用广泛，不同的转印膜规格和参数不同，选择正确、均一稳定的转印膜对达到最佳的实验结果起到关键性的作用。
常用的转印膜对比：常用的三种转印膜：硝酸纤维素膜（NC 膜）、带正电的尼龙膜（N66膜）、聚偏氟乙烯膜（PVDF膜）。
C ob e t t er三种转印膜结合DNA或RNA的能力：带正电尼龙膜>PVDF膜>硝酸纤维素膜。
三种转印膜机械强度比较：硝酸纤维素膜较脆，易破碎，不能重复使用；尼龙膜和PVDF 膜机械强度较高，可重复使用。
带正电的尼龙膜可结合短至10bp核酸片段，因此是最理想的核酸杂交转印膜。
PVDF膜机械强度高、耐高温，是蛋白印迹最理想的转印膜。
Cobetter专为蛋白核酸杂交研发了性能优良的转印膜，Cobetter杂交转印膜的种类如下：retteboC⏹N66尼龙转印膜⏹N66尼龙带正电荷转印膜⏹PVDF疏水转印膜⏹PVDF亲水转印膜Cobetter转印膜孔径有0.45um、0.22um 两种。
CobetterN66尼龙转印膜：相比起硝酸纤维素膜而言，其机械强度高，在经历多次杂交、洗脱和标记后不易产生破损和变形，可重复使用，非常适用于核酸检测。
制模过程中通过特殊的表面改性方法嫁接了亲水性的基团，使用过程中不需要再做预润湿处理。
通过在膜表面嫁接羟基基团，改变其表面电荷性能（正电），使得其能紧密结合DNA 而降低背景，快速结合DNA。
SouthernBlot印记杂交常见问题解析
Southern Blot印记杂交常见问题解析1、针对不同的实验材料，southern杂交实验难度有差异么？答：不同的实验材料，在进行试验过程中难度差异很大，例如玉米、小麦、葡萄的Southern杂交检测难度要比普通的材料要大。
(1)、物种本身的基因组较大（例如小麦），检测操作难度大(2)、材料本身含有高糖多酚（例如葡萄）严重影响酶切操作(3)、物种品系复杂（例如玉米），在基因组信息研究层面还不透彻。
2、核酸质量对southern杂交实验的影响答：核酸质量对实验的影响是直接的，既要求客户提供的总量足够——实验消耗（上样量），又要求保证质量——按要求准备材料。
上样量指的是基因组DNA酶切消化后，回收后的DNA片段的量。
根据不同物种的基因组大小不同，上样量也有所区别。
基因组越大，上样量越多。
例如，拟南芥大概需要3ug ，酵母3ug，人8ug，小麦15ug。
酶切消化之后不能直接上样，需要回收纯化。
回收会有损失，最多能损失一半，所以需要客户提供足够量的样品，一般要求至少20 ug的基因组DNA。
（以上上样量均为一个泳道）DNA 样品一般对 OD 值和浓度有如下要求：OD260/280=1.8～2.0，OD260/230＞2.0，浓度≥100 ng/ul 。
同时，需要对 DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示该 DNA 样品无蛋白质和 RNA 等物质污染，无降解弥散，条带清晰。
（如图所示）3、探针设计是怎么回事，有哪些原则？答：探针就是与待测目的基因序列同源的一段地高辛标记的DNA序列，可以和酶切后的基因组片段特异性的结合。
探针设计有如下几个原则: (1)、长度适中。
探针的片段长度一般控制在300-1000bp，探针太长时会导致非特异性结合的概率增加，探针太短时，探针结合的地高辛标记物太少，会导致发光信号减弱。
(2)、特异性强。
最佳的探针序列是仅与目的基因同源，与整个基因组序列的同源片段低于30%。
southern印迹杂交名词解释
southern印迹杂交名词解释Southern印迹杂交是生物学中一个重要的术语，它来源于美国生物学家Edwin Southern所发明的南方杂交技术。
这种技术通常用于DNA分子的检测与分析，在生命科学研究领域具有重要的应用价值。
1.什么是Southern印迹？Southern印迹，又称Southern blot，是一种通过琼脂糖凝胶电泳和酶解技术，将筛选出的DNA样本在膜上进行定向转移，并与特定探针杂交的技术，可以用于检测和分析目标DNA序列。
2.什么是杂交？杂交是指在DNA的两条链之间发生的配对作用。
它是生物学中基本的遗传现象，决定了每个个体的基因型和表型。
3.什么是南方杂交技术？南方杂交技术是一种高效的分子生物学技术，广泛用于分析DNA序列、检测特定基因等方面。
它利用核酸探针与目标DNA的互补配对关系，识别目标DNA序列。
在使用Southern blot技术时，DNA样品首先通过电泳将不同长度的DNA分离出来，然后将其转移到琼脂膜上。
接着，利用探针特异性杂交，标记目标DNA的特定区段。
最后，利用探针上的标记（如酶或荧光）将目标DNA区段从杂交物质中分离出来并检测，以获取样品的DNA序列和长度信息。
4. Southern印迹与Northern印迹、Western印迹有什么不同？Southern印迹用于检测已知DNA序列，与之对应的Northern印迹用于检测RNA序列，而Western印迹则是用来检测蛋白质。
三种印迹技术都是利用探针与目标分子的互补配对关系，识别目标分子，并将其从杂交物质中分离出来以便检测。
5. Southern印迹技术的应用Southern印迹技术具有广泛的应用价值。
它可以用于检测和鉴定病菌、遗传疾病、肿瘤等疾病相关基因，进行生物工程和基因工程的基因克隆和筛选，进行DNA序列测定和鉴定等。
不仅如此，该技术也可以应用于无机化学、有机化学、分析化学等领域。
总之，Southern印迹技术的出现和发展，促进了生命科学、医学和生物工程等领域的发展，也推动了DNA以及其他分子的检测和分析研究。
southern杂交
Southern流程示意 Southern流程示意
基因组DNA 基因组DNA
限制性酶切
DNA限制片段 DNA限制片段
琼脂糖凝胶电泳
转 膜
转移缓冲液
பைடு நூலகம்与标记探针杂交 检测
盖子 两层长滤纸 三层湿滤纸 凝胶 n+ 尼龙膜 三层湿滤纸 十层干滤纸 10cm吸水纸 10cm吸水纸
转膜
即将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上。而此过 程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不变。DNA是沿与凝胶 平面垂直的方向移出并转移到膜上，因此，凝胶中的DNA片段虽 然在碱变性过程已经变性成单链并已断裂，转移后各个DNA片段 在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样，故而称为印 迹（blotting）。用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素 膜（NC膜）、尼龙（Nylon）膜、化学活化膜和滤纸等，转膜时 可根据不同需要选择不同的固相支持物用于杂交。其中常用的是 NC膜和Nylon膜。各种膜的性能和使用情况比较见各种尼龙膜性 能及使用情况比较表。
与标记分子杂交
• （一）原理 • 转印后的滤膜在预杂交液中温育4-6h，即可加入标记的探针 转印后的滤膜在预杂交液中温育 ， DNA（探针 预先经加热变性成为单链DAN分子），即可进行杂 分子）， （探针DNA预先经加热变性成为单链 预先经加热变性成为单链 分子），即可进行杂 交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜， 交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜， 然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高， 然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高，杂交的 严格程度越高，也就是说， 严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源 性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。 性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。 • （二） 步骤 • 1.将标记的 将标记的DNA探针置沸水浴 探针置沸水浴10min，迅速置冰上冷却1-2min， ，迅速置冰上冷却 ， 将标记的 探针置沸水浴 变性。 使DNA变性。 变性 • 2.从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋，剪开一角，将变 从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋， 从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋 剪开一角， 性的DNA探针加到预杂交液中。 探针加到预杂交液中。 性的 探针加到预杂交液中 • 3.尽可能除取袋中的空气，封住袋口，滞留在袋中的气泡要尽可 尽可能除取袋中的空气， 尽可能除取袋中的空气 封住袋口， 能地少，为避免同位素污染水浴， 能地少，为避免同位素污染水浴，将封好的杂交袋再封入另一个未污 染的塑料袋内。 染的塑料袋内。 • 4.置42℃水浴温育过夜（至少 置 ℃水浴温育过夜（至少18h）。 ）。
生物化学实验southwestern blotting实验步骤 -回复
生物化学实验southwestern blotting实验步骤-回复生物化学实验：southwestern blotting实验步骤南方杂交（southwestern blotting）是一种用于检测DNA结合蛋白的实验技术。
在这项实验中，我们可以确定哪些蛋白与DNA结合，进而揭示它们在基因调控和细胞功能方面的作用。
下面将详细介绍southwestern blotting实验的步骤。
步骤一：制备RNA和DNA探针在进行southernwestern blotting实验之前，首先需要制备两个探针：一个用于检测特定DNA序列的DNA探针，另一个用于检测DNA结合蛋白的RNA探针。
DNA探针可以通过PCR扩增特定的DNA片段，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
RNA探针则需要用逆转录酶将RNA反转录成cDNA，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
步骤二：制备细胞核提取物1. 收集细胞：收集含有目标蛋白的细胞样品。
可以根据需要使用贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞。
2. 细胞裂解：将细胞悬液离心后，将细胞沉淀洗涤一次，然后用细胞裂解液裂解。
细胞裂解液可以根据实验要求自制，也可以购买商业提供的细胞裂解液。
3. 离心：将细胞裂解液离心，将上清转移至新离心管中。
4. 蛋白浓度检测：使用BCA或其他蛋白浓度检测试剂盒对离心上清中的蛋白质进行定量。
步骤三：SDS-PAGE凝胶电泳分离1. 准备SDS-PAGE凝胶：根据需要制备聚丙烯酰胺凝胶。
根据样品量的不同，选择不同的均聚丙烯酰胺百分比凝胶。
2. 添加样品和分子量标记物：向凝胶槽中加载约10-50微克的蛋白样品，并加入适当的分子量标记物。
3. 开始电泳：将凝胶槽放入电泳槽中，并加入足够的电泳缓冲液。
启动电泳仪，并根据需要调整电压和电流。
4. 疏水处理：电泳结束后，将凝胶浸入缓冲液中，使凝胶疏水。
步骤四：转移蛋白到NC膜1. 混合转移缓冲液：根据实验需要制备转移缓冲液。
Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介
Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介姜永均 (江苏省如东高级中学 226400)摘 要 Southern印迹杂交(Southern b l ot)是分子生物学领域中最常用的技术方法之一,该技术是1975年英国爱丁堡大学的E. M.Sou t h ern首创的,Sou t h ern印迹杂交故因此而得名。
后来相继出现了三个原理、过程相似,但是操作对象不同的印迹方法,缘于学界前辈的幽默分别将其称为N ort h ern b l ot、W estern blot和Eastern b l ot,这些技术的命名与发明人姓氏并没有关系。
本文简要介绍了Sou t hern印迹杂交及其相关生物技术。
关键词 Sou t hern印迹杂交 Northern印迹杂交 W estern印迹杂交 Eastern印迹杂交在近年的一些省、市中学生生物奥赛试卷中常涉及到Southern印迹、N outhern印迹、W este m印迹等分子生物学技术。
本文将Sout hern印迹杂交及其相关生物技术作一个简单介绍。
Souther n印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法,是研究DNA图谱的基本技术,在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。
Souther n印迹杂交技术1975年由英国人埃德温 迈勒 萨瑟恩(Ed w i n M ellor Southern)创建。
1977年詹姆斯 艾尔文(Ja mes A l w ine)等把此方法应用到RNA的研究方面,称作Northern印迹法。
1979年乔治 斯塔克(G eor ge Stark)等则把该方法扩展应用到单向电泳后的蛋白质分子的分析方面,被称作W estern印迹法。
1982年Re i nhart报道双向电泳后蛋白质分子的印迹分析,称之为Eastern印迹法。
目前,有人把Sou hern、Nort hern、W esther印迹法分别称作DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法。
Southern blot杂交鉴定(cross identification)
Southern blot杂交鉴定（cross identification）1）取10ul待测DNA，于一定浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳。
(20mL,1.0%凝胶,) 2) 凝胶用溴化乙锭染色，切掉凝胶四周多余部分，并在凝胶的一角作一记号, 拍照记录电泳结果(拍照时, 凝胶旁放一尺子)。
3) 杂交用胶的制备 (做以下步骤两组合一)A.将凝胶浸没入30mL 0.25mol/L HCl溶液中15min，使DNA脱嘌呤。
B.用蒸馏水短暂洗凝胶2次。
C.将凝胶浸没入30mL变性液中30min, 使凝胶变性。
D.将凝胶浸没入30mL中和液中15min使它被中和。
重复D一次。
在制备杂交用胶时准备转移的平台、膜、滤纸等(4、5)。
4) 准备DNA从凝胶向膜转移的平台5) 将1张待用尼龙膜和3张厚滤纸切成与待转移胶相同大小，并在尼龙膜一角做一标记。
另1张厚滤纸切成与凝胶相同宽度，长度(约18cm)足以达到转移液盒子的底部。
准备10 X SSC 转移液。
将待用尼龙膜用蒸馏水浸湿后，再浸入10 X SSC 转移液中。
6）安装毛细管转移装置A.将长的滤纸放在转移平台的顶部，滤纸两端达到转移盒的底部，做成虹吸桥。
B.将8 0mL转移液倒入转移盒内，并湿润滤纸。
C.将凝胶背面朝上置于滤纸搭成的桥上，凝胶与滤纸间避免有气泡。
D.用保鲜纸封住凝胶四边。
E.将浸湿的转移膜置于凝胶的上部，凝胶与膜间避免有气泡。
F.将剩下的3张滤纸小心的放在转移膜的上面，并放一叠吸水纸搭在滤纸上，再放一玻璃板，其上压一重物。
G.转移几小时或过夜(至少4小时)注意：勿使转移液干枯。
7)已转移的DNA与膜交联A.将膜放在浸有10 X SSC的厚滤纸上，有DNA的一面朝上。
B.将膜置于UV crosslinker 中，在紫外光下自动交联。
C.用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜，空气中干燥。
此膜可在4℃长期保存。
8)DNA探针的制备(略过)参照生产商提供的实验方法合成地高辛标记的探针。
southern_杂交实验流程
SOUTHERN BLOTTING实验操作流程A.小麦基因组DNA的提取1)采集5g鲜嫩的小麦幼苗，将其剪成2cm左右的片段，用液氮冷冻后在研钵中将其研成粉末（研磨15min左右）。
2)将研磨好的样品转移到预冷的50ml离心管中，加入20ml预热的S buffer，颠倒混匀。
S Buffer成分100mM Tris.Cl pH8.5100mM NaCl50mM EDTA pH8.02％ SDS3)于65℃水浴锅中温育1-2h，并不时轻柔混匀。
4)加入20ml（等体积的）酚/氯仿，轻柔地颠倒混匀，直至呈乳状（注意：保证混匀。
为有效除去蛋白，此步可以重复）。
5)用水平转子离心机以2000rpm的转速离心20-30min。
6)加入等体积的氯仿，轻柔地颠倒混匀，2000rpm离心20min。
7)转移上清到1个灭菌的50ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置一段时间，用玻璃勾将DNA钩出。
8)用70％的乙醇清洗DNA 2-3次后，将其挑在玻璃钩上晾干，然后溶解在5ml 1×TE中。
9)待DNA完全溶解后接入10μl RNase，于37℃恒温箱中温育1h。
10)加入等体积的酚/氯仿，轻柔颠倒混匀，以2000rpm的转速离心15min。
11)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，以2000rpm的转速离心15min。
12)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入1/10 体积 3M pH 5.0的乙酸钠（终浓度为0.3M），混匀后再加入2倍体积95％的乙醇，混匀。
13)用玻璃勾将DNA钩出，然后用70％的乙醇清洗2-3次，晾干后加入1.8-2ml 1×TE溶解。
14)待DNA完全溶解后，取1μL DNA电泳，检测DNA的浓度和完整性。
15)DNA样品可以放在4℃保存备用。
B.小麦基因组DNA的酶切1）通常情况下采用下列酶进行谷类作物DNA分析。
识别6碱基序列的酶识别4碱基序列的酶Apa I Hind III Bam HI Alu I Mbo I Hha ISal I Bgl I Sst I Dde I Msp I Taq IDra I Pvu II Eco RV Hae III Rsa I Hinf IEco RI Xba I2）如果一次酶切DNA的量在10μg左右，一般采用30μL反应体系。
southern印记杂交
实验步骤
基因组DNA经酶切成小片段（EcoR I或 Hind III） 电泳分开各片段（1％琼脂糖凝胶电泳） 变性（双链经碱变性解开成两条单链） 转膜及固定（DNA经毛细管作用转移到尼龙膜上， 紫外交联固定） 预杂交（减少标记探针的非特异性结合， 小分子鲑精DNA为竞争性封闭剂） 杂交（靶DNA单链与DIG标记的c-myc探针之间以 碱基互补的原则进行杂交） 洗膜（洗去未与靶DNA结合的探针） 检测（杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色）
体积越小,杂交动力学越高;
DNA/DNA杂交适宜的复性温度为比Tm低20～25℃;
温度↓非特异性↑; 温度↑敏感性↓
影响杂交的因素
4）杂交液的离子强度
低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率增加(Na+ 的作用) 高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行序列不完 全同源的杂交时,必须维持杂交液与洗膜液中较高的盐 浓度;
Southern杂交技术原理
Southern杂交技术是由Edward M. Southern在 1975年首先发明的用于检测DNA的一种核酸杂交 技术，并因此而得名 根据毛细管作用的原理，将在电泳凝胶中分离的 DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过 与标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用，检测 这些被转移的DNA片段。
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实验步骤
二. 1％琼脂糖电泳
两组共用一块凝胶，共7个样 1.基因组DNA10 mg 2.酶切样品（1） 3.酶切样品（2） 4.阳性对照（pSV-c-myc重组质粒经BamH I 酶切后的8.5 kb线性片段，10pg/ml, 10ml) 5.酶切样品（1） 6.酶切样品（2） 7.基因组DNA10 mg
Southern杂交检测样本收集注意事项
Southern杂交检测样本收集注意事项
1. 新鲜组织：
用解剖刀等迅速切成小碎块，约30-100 mg，放入2.0 mL离心管中，开盖液氮速冻15 min，-80℃保存，干冰运输。
每个southern blot泳道提供2-3管样品。
注：(1) 解剖刀处理组织的时间尽量控制在1 min以内。
(2) 液氮速冻时必须开盖，以防炸裂。
(3) 对于较难提取的植物组织，如苎麻、榨菜、枣子、鱼、甘蔗、大署等，1-2 g样品用铝箔纸包好，液氮速冻15 min，-80℃保存，干冰运输。
2. 细胞样品：
悬浮细胞 1000-1500 rpm，5 min，常温离心收集细胞。
贴壁细胞用胰蛋白酶消化后，吹打收集，PBS洗涤细胞，去除多余培养基和胰蛋白酶。
开盖液氮速冻15 min， -80℃保存，干冰运输。
一般情况下，细胞培养的6孔板，每孔细胞数量约为0.5~2×106个。
每个离心管中的细胞数量控制在5×106个左右！每个southern blot泳道提供2-3管样品。
3. DNA样品（双蒸水水溶解）：
2-8℃短期保存，-20℃长期保存；加冰块低温运输。
质量检测
取1-2 μL的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，无蛋白质和RNA等物质污染，无降解弥散，条带清晰。
纯度、浓度检测
OD260/280=1.8~2.0，OD260/280＞2.0；浓度≥100 ng/μL。
southern blot
实验名称：Southern 印迹杂交一、实验目的核酸杂交是分子生物学的一个重要手段，它应用于克隆鉴定，同源性分析，以及癌症、遗传疾病和致病细菌、病毒和寄生虫的分子诊断。
通过本实验了解和掌握Southern杂交的基本原理和操作。
二、实验原理根据DNA变性和复性发展的一种实验技术，就是分子杂交（hybridization)。
指两条来源不同但具有同源性的核酸单链在一定条件下，根据碱基互补的原则缔结成双链分子。
Southern杂交是指一种利用标记的探针与膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。
其主要步骤包括：⑴基因组DNA的限制性酶切；⑵DNA酶切片段的电泳分离和转移；⑶杂交及检测。
基因组DNA采用实验五中制备的HL-60细胞基因组DNA，接着是将DNA进行限制性酶切；本实验检测的靶DNA为原癌基因c-myc，c-myc的致癌机理包括染色体异位和病毒基因组的插入突变而导致c-myc基因的过度表达。
基因的变化可通过Southern杂交检测。
c-myc基因的酶切位点有EcorI、ClaI、HindIII等，基因组DNA首先经限制内切酶酶切成较短的片段，经电泳分开，然后再经碱变性使DNA成为单链，有利于结合于膜上和进行下一步杂交。
转移是根据毛细管作用原理进行的。
单链DNA经高温烘烤定于膜上。
杂交是根据靶DNA单链与探针之间的碱基互补的原则进行。
本实验采用的探针为1.4kb的ClaI和EcorI酶切片段，对应于c-myc的第3个外显子的部分片段。
探针用非放射性标记物地高辛（DIG）标记。
杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色。
为了降低背景，减少标记探针的非特异性结合，一般先行预杂交，用牛血清白蛋白（BSA）、葡聚糖（Ficoll）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及去污剂SDS和十二烷基磺酸钠封闭膜上非特异结合位点，还在杂交液中加入小分子鲑精DNA作为竞争性封闭剂。
杂交一般在5或6xSSC和封闭剂的溶液中进行，水溶液中杂交温度为Tm-25°（65-70°）。
Southern blot基本概述
Southern blot基本概述一、目的学习Southern blot技术及其应用二、概述1975年E.Southern发明了将DNA切开，电泳分离，再变性，印迹到硝酸纤维（NC）滤膜上，用探针进行杂交，检测DNA的方法。
自显影或显色用于DNA分析。
以32P标记放射性探针为例，放射自显影观察结果。
互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。
杂交过程是高度特异性的，可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。
杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。
该检测对象可以是克隆化的基因组DNA，也可以是细胞总DNA 或总RNA。
根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。
分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性或非放射性标记的探针与被固定的模板杂交，经显影或现色后检测出目的DNA 或RNA 分子所处的位置。
根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类： Southern 杂交、Northern 杂交、点杂交、缝隙及原位杂交。
核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。
因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用，而且在临床诊断上的应用也日趋增多。
Southern 杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA 片段中是否存在与探针同源的序列。
本实验包括基因组DNA 限制性内切酶切，DNA电泳及转膜，杂交及检测三部分。
三、基因组DNA限制性内切酶酶切（一）、试剂及材料1.EcoRl内切酶及反应buffer2.基因组DNA或PCR产物等样品3.去离子水4.eppendorf管及Tip头5.PCR仪6.标记笔、无粉手套等（二）、操作步骤：1.设置50ul反应体系，在200ulEP管中加入：10ug基因组DNA x ul去离子水49-xul10×buffer 5 ulEcoRl 4 ul2.充分混匀，离心20S。
southern blot原理
southern blot原理Southern blot是一种分子生物学技术，用于检测DNA序列的特定位置。
它是由爱德华·南部（Edward M. Southern）于1975年发明的，因而得名。
Southern blot技术的原理是基于DNA的亲和性杂交和电泳分离。
需要提取待检测的DNA样本，并在实验室条件下将其切割成片段。
然后，将这些DNA片段通过电泳分离。
电泳是一种利用电场将带电粒子（如DNA片段）分离的技术。
通过电泳，DNA片段根据其大小被分离成不同的带状图案。
接下来，将DNA片段转移到固体支持介质上，通常是一张特殊的纸或膜，如尼龙膜。
这个步骤通常称为转移。
转移可以通过将介质浸泡在缓冲液中，然后将电场应用于系统中来完成。
DNA片段通过电泳的方式从凝胶中转移到膜上，并形成与凝胶中的DNA带状图案相对应的DNA带状图案。
在转移完成后，膜上的DNA被固定在那里，并需要进行固定。
这通常通过使用紫外线照射或加热等方法来实现。
固定DNA片段后，可以开始进行亲和性杂交。
亲和性杂交是Southern blot技术的关键步骤之一。
在这一步骤中，需要准备一个DNA探针，它是一个与待检测DNA序列互补的DNA片段。
DNA探针可以通过合成或从其他来源获得。
然后，将DNA探针标记上标记物，以便在后续步骤中进行检测。
标记物可以是放射性同位素、荧光染料或酶等。
在亲和性杂交过程中，将标记的DNA探针加入含有被固定DNA片段的膜的溶液中。
DNA探针与被固定的DNA片段发生亲和性结合，形成DNA双链。
接下来，需要洗去未结合的DNA探针。
这可以通过多次用高盐浓度的缓冲液洗涤膜来实现。
洗涤过程中，未与固定的DNA片段结合的DNA探针会被洗掉，而与固定的DNA片段结合的DNA探针会保留在膜上。
将膜进行检测，并得到目标DNA序列的信息。
检测可以使用放射性探针的放射线显像、荧光探针的荧光显像或酶标记物的化学发光等方法。
通过检测，可以确定在膜上的哪些位置存在目标DNA序列。
Southern_blot实验方法与步骤
实验名称： Southern blot一、实验目的1．学习核酸杂交的基本过程和操作。
二、实验原理将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
三、试剂与仪器（一）器材：糖瓷盘，台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪，摇床，X线胶片。
（二）试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl）中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）,转印迹液SSC（3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0）标记探针，20×SSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）2×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS)1×缓冲洗液（0.1M马来酸0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）1×封阻液[1％(W/V)封阻剂溶于]1×马来酸溶液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.51×检测液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5）抗－地高辛－碱性磷酸酶。
四、实验步骤1、制备DNA分子（PCR）2.琼脂糖凝胶电泳分离DNA3电泳结束后，将胶小心从电泳槽中取出，用手术刀将胶中没有DNA样品的四周部分略做修剪，然后将胶放入0.25 N HCl中脱嘌呤，当胶中的溴酚蓝变为黄色取出4将胶从HCl溶液中取出，用ddH2O涮洗两次，然后放入碱变性液（0.5 M NaOH）中处理45 min，使胶中的ds-DNA变为SS-DNA。
Southernblotting实验方法
Southernblotting实验⽅法Southern 杂交的实验⽅法Southern 杂交是分⼦⽣物学的经典实验⽅法。
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进⾏杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显⽰出杂交信号。
通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的⽚段以及该⽚段的长度。
该项技术⼴泛被应⽤在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。
但由于该技术的操作⽐较烦琐、费时，所以现在有⼀些其他的⽅法可以代替Southern 杂交。
但该技术也有它的独特之处，是⽬前其他⽅法所不能替代的，如限制性酶切⽚段的多态性(RFLP)的检测等。
⼀、基因组DNA的制备（前述）⼆、基因组DNA的限制酶切根据实验⽬的决定酶切DNA的量。
⼀般Southern杂交每⼀个电泳通道需要10-30µg的DNA。
购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品⽬录上查到最佳消化温度。
为保证消化完全，⼀般⽤2-4U的酶消化1µg 的DNA。
消化的DNA浓度不宜太⾼，以0.5µg /µl 为好。
由于内切酶是保存在50%⽢油内的，⽽酶只有在⽢油浓度<5%的条件下才能发挥正常作⽤，所以加⼊反应体系的酶体积不能超过1/10。
具体操作如下：在1.5ml离⼼管中依次加⼊DNA（1µg /µl） 20 µg10×酶切buffer 4.0 µl限制性内切酶（10U/µl） 5.0 µl加ddH2O ⾄ 500 µl在最适温度下消化1-3hr。
消化结束时可取5µl电泳检测消化效果。
如果消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6hr已没有必要。
或者放⼤反应体积，或者补充酶再消化。
如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活⼒下降。
Southern印迹杂交作业指导书
Southern印迹杂交作业指导书实验目的学习和掌握Southern印迹杂交技术，检测重组DNA分子中是否含有目的基因片段。
实验原理具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异性的。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上，即印迹(blotting)；二是固定于膜上的核酸同同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
这种技术是E．M．Southern l975年首创的，因此称Southern印迹杂交。
Southern印迹的印迹方法有毛细管法、电转法、真空转移法，滤膜有尼龙膜、化学活化膜(如ABM、APT纤维素膜)等。
这里主要介绍目前常用的电转法。
电转法是利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，是近年来发展起来的一种简单、迅速、高效的DNA转移法。
一般只需2～3h，对于用毛细管法不理想的大片段DNA的转移较为适宜。
常用的电转仪有铂金丝电极和石墨电极。
实验内容材料和试剂印迹试剂l．待测样品，适当的限制性内切酶、琼脂糖。
2．变性液 1.5mol／L NaCl，0.5mol／LNaOH，高压灭菌。
3．中和液1mol／L Tris·HC1(pH8.0)，1.5mol／L NaCl，高压灭菌。
4．电泳液和转移液1×TBE或TAE。
5．尼龙膜、铂金丝电极电转仪。
杂交试剂1．预杂交液5×Denhardt试液，50mmol／L磷酸缓冲液(pH7.0)，0．2％SDS，500μg／m1变性的鲑精DNA片断，50％甲酰胺(也可不用)。
2．20×SSC，3mol／L NaCl 0.3mol／L柠檬酸钠。
3．2×SSC，0.1％SDS 溶液。
4．0.1×SSC，0.1％SDS溶液。
5．0.1×SSC溶液。
southern杂交实验方法和步骤
southern杂交实验方法和步骤一、主要仪器：离心机恒温水浴锅Orbital shaker 恒温摇床Poner PAC300核酸电泳仪VersaDoc凝胶成像系统水平摇床HL-2000 Hybrilinker分子杂交仪烘箱二、主要材料whatman 3mm滤纸尼龙膜吸水纸玻璃板玻璃棒废旧胶片方形果盘平板三、主要试剂RNase A真菌基因组提取试剂盒DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit IDNA MakerNaOH，NaCl，浓盐酸，Tris碱，柠檬酸钠，马来酸四、试剂准备变性液：0.5 mol/L NaOH，1.5 mol/L NaCl；Southern blot中和液：0.5 mol/L Tris-HCl（pH=7.5），1.5 mol/L NaCl；20×SSC：3 mol/L NaCl，0.3 mol/L 柠檬酸钠，浓盐酸调节pH至7.0；2×SSC：取100 mL 20×SSC溶液，灭菌去离子水定容至1L；2×SSC+0.01%SDS：取100 mL 20×SSC溶液，10 mL 10% SDS，灭菌去离子水定容至1L；0.5×SSC0.01%SDS：取25 mL 20×SSC溶液，10 mL 10% SDS，灭菌去离子水定容至1L；洗涤缓冲液：0.1 M马来酸，0.15 M NaCl，pH 7.5，0.3% （v/v）Tween 20；马来酸缓冲液：0.1 M马来酸，0.15 M NaCl，用NaOH（固体）调节pH值至7.5；检测缓冲液：0.1 Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 9.5；封阻溶液：将DIG试剂盒内的6号瓶置于37℃水浴锅中预热，充分溶解后，取12mL，与108mL马来酸缓冲液混匀备用（新鲜配制，立即使用）；抗体溶液：将DIG试剂盒内的4号管10000rpm高速离心5min，取4µL上清，加入20mL封阻溶液中，备用；底物显色液：取20mL检测缓冲液，避光加入400µL DIG试剂盒内的5号管。
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Sourthern 杂交
（1）DIG-DNA标记：a）取1 μg的模板DNA加入灭菌双蒸水至16 μL体积；b）将16 μL的模板DNA置于100℃水浴变性10 min，之后迅速置于冰上冷却；c）加入4 μL混匀后的DIG-High Primer，混合均匀后离心，置于37℃水浴20 h 以上；d）65℃水浴10 min终止反应。
（2）基因组DNA的酶切消化、电泳以及变性：a）用限制性内切酶酶切基因组DNA（30~60 μg），点样跑胶以较低的电压3 v/cm电泳酶切样品；c）将凝胶转移至含1.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L NaOH的变性液中，室温轻轻振荡30 min，使凝胶中的基因组DNA变性（注意中间可以换液1次）；d）倒去变性液，用去离子水清洗3次，然后加入0.5 mol/L Tris-HCl，1mol/L NaCl（pH8.0）的中和液室温轻轻摇动洗涤30 min。
（3）DNA转膜：a）将带电荷的尼龙膜漂浮于含去离子水的平皿中，直至尼龙膜完全浸湿，然后转移至碱性转膜缓冲液（0.4M NaOH, 1M NaCl）中浸没5 min；b）在水平玻璃板放一张厚的滤纸（20 cm × 20 cm）作为滤纸条，待完全湿润后，用玻璃棒轻轻滑动以赶走气泡；c）从转膜缓冲液中取出浸泡过的凝胶，置于滤纸条的中央，用玻璃棒轻轻滑动，使得凝胶与滤纸条之间没有气泡；d）用塑料薄膜封闭凝胶的边缘，确保尼龙膜的边缘不能与滤纸条接触，然后吸取转膜缓冲液将凝胶表明湿润，再将尼龙膜置于凝胶上面，确保尼龙膜与凝胶之间无气泡；e）再取两张与尼龙膜同等大小的厚的滤纸置于尼龙膜的上面，用玻璃棒轻轻滑动赶走气泡；f）剪取一叠同等大小的纸巾置于两张滤纸上，再在上面平放一玻璃板，用400 g砝码压平稳，静置转移约12~24 h，期间需要频繁更换纸巾数次；h）弃纸巾、凝胶以及滤纸，在尼龙膜上用铅笔标记加样孔的位置以及方向，然后浸没于中和缓冲液（0.5M Tris-HCl, 1M NaCl）中，达30min，注意中间换洗1次，然后在10× SSC溶液中浸泡5min；i）将尼龙膜置于1张干净的滤纸上，自然风干；j）将尼龙膜置于紫外交联仪（70000 μJ/cm2）照射，正面朝上，使得DNA 固定交联到尼龙膜上。
（4）探针杂交过程：a）将含有靶DNA的尼龙膜浸于盛有6× SSC的平皿中，直至尼龙膜自上而下完全浸湿，浸泡2 min；b）用镊子将尼龙膜放入杂交管中，确
保尼龙膜与杂交管之间无气泡；c）将适量体积的预杂交液（DIG Easy Hyb，10 mL/100cm2尼龙膜）预加热到杂交温度（37℃~42℃），然后轻轻沿着杂交管壁倒入杂交管中，拧紧管盖，放入杂交炉中（37℃~42℃）预杂交30 min(预杂交时间可以延长至2h，预杂交延长有利于降低背景)；d）预杂交结束后，将DIG标记的DNA探针（约25 ng/μL DIG Easy Hyb）在沸水浴中变性5 min，并迅速放到冰上冷却；e）将变性的探针加入预热的DIG Easy Hyb（3.5 mL/100 cm2尼龙膜）中混匀，并避免泡沫形成；f）倒掉预杂交液并加入探针/杂交液混合液，于42℃温浴过夜；g）含有DIG标记的DNA探针的DIG Easy Hyb保存于-20℃，可以重复使用几次，但在使用之前必须置于68℃条件下变性10 min；h）杂交结束后，在42℃下，用足量的2× SSC，0.2% SDS混合液洗膜2次，每次5 min；i）在68℃下，用68℃预热过的0.5× SSC，0.1% SDS混合液洗膜2次，每次15 min。
（5）免疫显色：a）15~25℃，转移至100 mL Washing buffer中，摇动温浴l~5 min；b）15~25 ℃，浸没于l00 mL Blocking solution 中，摇动温浴30 min；c）15~25℃，浸没于20 mL Antibody solution 中，摇动温浴30 min；d）15~25 ℃，用l00 mL Washing buffer 洗膜2 次，每次15 min；e）15~25℃，浸于20 mL Deteetion buffer中平衡2~5 min；f）将膜表面的水分吸干后，在膜的正面加入1 ml CSPD（via 5），并使液体均匀覆盖膜的表面，之后用保鲜膜包裹，尽量避免气泡，在黑暗孵育10 分钟，用LAS4000 化学发光成像系统自动曝光并保
存照片。