时间分辨荧光CRP-poct试纸条的设计
一种检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810553516.7(22)申请日 2018.06.01(71)申请人 北京勤邦生物技术有限公司地址 102206 北京市昌平区回龙观国际信息产业基地高新四街8号(72)发明人 何方洋 万宇平 李旭 宋灏 吴小胜 王琳琛 冯才伟 王兆芹 韩光耀 周苑 (51)Int.Cl.G01N 33/68(2006.01)G01N 33/577(2006.01)(54)发明名称一种检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。
该试纸条包括试纸和微孔试剂，所述试纸包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品吸收垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区喷涂有四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物，所述质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体，所述微孔试剂中冻干有荧光微球标记的四环素类药物单克隆抗体。
本发明还提供了该试纸条的制备方法及应用上述试纸条检测样品中四环素类药物的方法。
本发明提供的试纸条和检测方法具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低的优点，能够实现对大批量样品中四环素类药物的快速检测和现场监控。
权利要求书1页 说明书8页 附图1页CN 108508215 A 2018.09.07C N 108508215A1.一种检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条，包括试纸和微孔试剂，所述试纸包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品吸收垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于：所述微孔试剂中冻干有荧光微球标记的四环素类药物单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区喷涂有四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物，所述质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体；所述四环素类药物单克隆抗体是以四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物是由四环素类药物半抗原与载体蛋白偶联得到，所述四环素类药物半抗原是由四环素与N -(4-氨苯基)马来酰亚胺反应得到，其分子结构式为：2.根据权利要求1所述的检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：所述荧光微球是直径为100～300nm的用聚苯乙烯包裹荧光物质的微球，其表面连接有—COOH基团。
时间分辨荧光免疫层析技术简介
• 测向流层析 • 垂直流层析（渗滤法）
免疫层析技术原理
侧向流层析
• 固定相：固定有检测线和控制线的纤维层析材料（NC膜） • 流动相：测试液 • 移动：毛细作用 • 结合：游离态待测物在固相捕获线处发生特异性免疫反应
图1 典型侧向流免疫层析试纸条构造（来源：Merck Estapor）
时间分辨荧光免疫层析技术简介
主要内容
1
免疫层析技术原理
2
免工疫作问标题记机材解决料方介案绍
3
时间分辨荧光分析法
4
应用实例
免疫层析技术原理
免疫层析技术是建立在层析技术和抗原-抗体特异性免疫反应基础上的一 项新兴免疫检测技术。
发展阶段：
• 初期：定性检测 • 新阶段：半定量、定量检测（信号放大、信号转换）
• 荧光寿命(Fluorescence lifetime)：荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度所用的 时间。
• 荧光猝灭(Fluorescence quenching)：荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、高温、 某些硝基化合物、重氮化合物、重金属、卤素阴离子等）的作用下，激发态分子的电子不能 回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射，从而导致荧光减弱甚至消退的现象。引 起荧光猝灭的物质称为猝灭剂，常用于消除不需要的荧光。
表1 几种常见的荧光物质
荧光物质
最大吸收光谱
异硫氰酸荧光素 (FITC)
490～495nm
四乙基罗丹明 (RB200) 四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC) 藻红蛋白（PE） 7-氨基-4-甲基香豆素
570～575nm 550nm 490-560nm 354nm
Alexa Fluor、CF Dye等新一代荧光染料系列 多种区段供选
时间分辨免疫荧光层析试纸条-推荐课件
检测原理
阴 性
Y
样品垫 玻纤垫 NC膜
阳 性
Y
A
AAA
YYYYYYY
YYYYYYY
YYYYYYY
YYY
YYYYYYY
Y
T线 C线 吸水纸
试纸条工作原理图 8
时间分辨荧光层析法优势及现 状
时间分辨荧光层析法优势
方法学名称 标记物 标记方法 复合物稳定性 结果判断 灵敏度 抗干扰能力 信噪比 检测范围
D-二聚体、C反应蛋白(CRP)、降钙素原 (PCT)、心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)、 N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)、肌红蛋 白(MYO)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、 心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)
人甲胎蛋白和游离人绒毛膜促性腺激素 β亚基
10
11
镧系元素螯合物在紫外光源的激发下能发射特殊的荧 光
可消除普通荧光的干扰 提高检测的灵敏度
3
时间分辨免疫荧光层析技术
取代了第一代胶体金、彩色乳胶和第二代荧光微球技 术
实现了定性到定量的转变 提高了检测的稳定性和灵敏度 更广的应用前景
4
荧光标记物
稀土-镧系元素，常用的有Eu、Tb和Sm，而Eu（铕 元素）是在标记抗原抗体中应用最广的元素。
时间分辨免疫荧
光层析试纸条简 介
上海瑞亿技术有限公司 倪小琴
2016.3.11
目录
时间分辨免疫荧光层析技术 荧光标记物 检测原理 时间分辨荧光层析法优势及现状
2
时间分辨免疫荧光层析技术
用稀土-镧系元素标记抗原或抗体，使抗原抗体在膜 上反应，并呈现出一定的颜色，通过信号强度来分析 待测物浓度的简便和快速的方法。
时间分辨荧光免疫分析法检测C反应蛋白方法的建立及应用
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中 图分 类 号 ： ３２ ３ Ｒ ９ ． 文 献标 志码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０２２ ６ ２ １ ）３０ ２ －３ １０ －６ Ｘ（００ ２ －０６０
本研究成功制备 Ｃ Ｐ多克 Ｒ
隆抗体一 Ｃ Ｄ — ｕ Ｂ Ｐ Ａ Ｅ ”荧光标记物并建立 了 Ｔ ＦＡ检测 Ｃ Ｐ的方法 ， 为临床检测 Ｃ Ｐ提供 了新的思路 ， ＲＩ Ｒ 此 Ｒ 亦为 Ｔ － Ｒ
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C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条[实用新型专利]
![C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条[实用新型专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/cd5708f7b7360b4c2f3f648e.png)
专利名称：C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条专利类型：实用新型专利
发明人：石晓强,马顺华,吴茜,王海蛟,赵卫国
申请号：CN201120160566.2
申请日：20110519
公开号：CN202149903U
公开日：
20120222
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本实用新型涉及一种C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条。
该试纸条包括Fusion5膜、硝酸纤维素膜和吸水纸三部分，硝酸纤维素膜位于中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，Fusion5膜上设有加样区和微球区；硝酸纤维素膜上设有包被有C反应蛋白抗体的检测线（T线）和包被有亲和素或链霉亲和素的质控线（C线）。
本实用新型的C反应蛋白试纸条灵敏度高，批内差及批间差小，有较好的重复性，可同时检测全血、血清、血浆、尿液样本，对C 反应蛋白（CRP）进行快速定量检测，极具实用价值。
申请人：博阳生物科技(上海)有限公司
地址：201210 上海市浦东新区张江高科技园蔡伦路88号二号楼五楼东
国籍：CN
代理机构：上海光华专利事务所
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C-反应蛋白上转发光免疫层析试纸条的研制
C-反应蛋白上转发光免疫层析试纸条的研制周明泽【摘要】[目的]研制C-反应蛋白上转发光免疫层析试纸条.[方法]在上转发光技术平台上,通过抗体筛选、反应条件的选择来确定C-反应蛋白的测定条件.[结果]通过抗体配对筛选,3C8标记和3B11包被可以实现一个较优组合,2 mg/ml的包被浓度及反应时间在15min时,能保证T/C值,线性和灵敏度较好.[结论]该检测方法具有反应时间短,灵敏度高,特异性、准确性、稳定性好,无环境污染和放射危害的特点.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(043)032【总页数】2页(P211,240)【关键词】C-反应蛋白(CRP);免疫层析试纸条;炎症;上转发光【作者】周明泽【作者单位】北京热景生物技术有限公司,北京100076【正文语种】中文【中图分类】S188上转磷光技术(UPT)是近年来发展起来的一种具有高灵敏度，基于上转磷光体UCP 的新型生物检测技术［1］。
其中，上转磷光颗粒是纳米级的晶体颗粒，它由包埋于氧化硫等惰性材料中的稀土镧系元素组成。
其特性可由红外线激发，而发射红、蓝、绿等不同波长的可见光［2］。
磷光信号可由改进的落射显微镜进行观察，并可用计算机系统进行检测和分析，达到定性、定量检测生物活性分子的目的［3］。
UCP具有高度的灵敏性、稳定性、简易性、灵活性、安全性等独特光学特性，使其作为新型标记物在生物检测领域将发挥巨大的潜能。
迄今为止，上转磷光技术已被应用于免疫标记分析、免疫层析分析等多种标记检测技术中。
近年来发现C-反应蛋白浓度甚至在正常范围内的轻度升高都与心血管疾病发生的危险性增加有关，可以推测心肌梗死事件发生的可能性。
超敏C-反应蛋白是心脑血管疾病中的一项独立风险预测指标，可以敏感地预测糖尿病合并心脑血管事件的危险发生率［4］。
所以CRP的定量测定至关重要。
CRP是一种能与肺炎链球菌C多糖体反应的急性时相蛋白，在组织损伤、感染等刺激下，被激活的单核细胞释放白细胞介素1(IL．1)，刺激肝细胞加速合成CRP，对炎症感染的发生发展存在很大的相关［5－6］。
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时间分辨荧光CRP-POCT 试纸条的设计
本试剂条内部采用侧向流免疫层析的三明治方法，装置包括一个样品垫、一个结合物释放垫、一个反应膜和一个吸收垫（图1）。
其中样品垫用于加样（血清或全血）；结合物释放垫中含过量的CRP 抗体A 和Eu 的复合物(α-CRPA-Eu)；反应膜上有两道线：检测线，又称T 线:，含过量的CRP 抗体B(α-CRPB)；对照线，又称C 线，含定量的CRP 抗体A 的抗体（α-α-CRPA ）。
在测试中，血清样品在试纸条的毛细管
作用带动下流经结合物释放垫，血清中的
CRP 在此与CRP 抗体A-Eu 复合物结合，形
成CRP-抗体A-Eu 复合物（图2-A ），并在
流经反应膜上的捕获线时被捕获分子（CRP
抗体B ）结合，形成抗体B-CRP-抗体A-Eu
的三明治复合物，产生T 线信号（图2-B ）。
而结合物释放垫中过量的CRP 抗体A-Eu 复合物在流经反应膜上的捕获线时不能被捕获分子捕获，越过捕获线继续前行。
当到达对照线（C 线）时，被其抗体捕获，产生C 线信号（图2-C ）。
将T 、C 线进行整合，去除信噪比后，即可判定血清中CRP 的含量（图3）。
图1 ：CRP-POCT 试纸条的结构 1=样品垫，2=结合物释放垫，3=检测线，4=反应膜， 5=对照线，6=吸收垫
图2：铕标记的CRP 抗体与CRP 及本身抗体的结合
A. CRP 抗体A 与CRP 在结合物释放垫上结合；
B. CRP 抗体A 与CRP 的结合物在T 线处与CRP 的另一抗体B
结合，被捕获于T 线；
C. CRP 抗体A 与其本身的抗体被捕获于C 线 图3：时间分辨荧光CRP-POCT 试纸 条的检测结果。