大肠杆菌检测方法的研究

大肠杆菌检测方法的研究

大肠杆菌是人和动物肠道中的常居菌，在食品卫生质量的评价和控制中，通常将其作为指示菌来评价食品粪源性污染的程度。本文简述了大肠杆菌的传统检测方法-滤膜法、多管发酵法、平板计数法等技术，以及一些快速方法-酶底物法、聚合酶技术，这些方法应用缩短了检测流程和时间，为在大工业生产中微生物控制提供了具有时效性的检测技术。

标签：大肠杆菌检测技术食品安全

0 引言

大肠杆菌又称大肠埃希氏菌（Escherichia coli），在1885年由德国细菌学家Theodor Escherich分离出来的，其属于细菌域、变形菌门、γ—变形菌纲，能够在人和动物的肠道中正常寄居，随着人和动物的粪便排出体外。其中五种肠毒素性大肠杆菌与人类疾病相关：肠毒素性、致病性、出血性、侵袭性和粘附性大肠杆菌。乳品中大肠杆菌一旦被检测出，就意味着其受到直接或间接的污染。因此，该菌很早就已经被用作食品粪源性污染的卫生学指标，并相应的出现了大量的检测方法。本研究介绍以往采用的传统方法，及目前所使用的新检测技术。

1 大肠杆菌的生物学特性及其致病性

1.1 生物学特性

大肠杆菌体积约为0.6-0.7μm3两端钝圆的短杆菌，有时会近似球状菌。有些菌株有荚膜或微荚膜，无芽孢，含有4-6根鞭毛，会游动，长有菌毛。该类菌是需氧或兼性厌氧性菌，最适生长温度为37摄氏度。属于单细胞微生物，其结构特点为：细胞壁、细胞膜、细胞质和核质。细胞壁的内测是细胞膜，细胞壁主要由肤聚糖和外部膜结构组成，具有坚韧而富有弹性的膜状结构；细胞膜主要是由磷脂及蛋白质组成；细胞质是细菌进行新陈代谢的场所，含有蛋白质、脂类、水、核酸等物质成份。

1.2 致病性

大肠杆菌一般没有致病性，但当大肠杆菌的菌落数超过人体自身的承受能力时就可能产生疾病隐患。婴儿感染大肠杆菌可能引起新生儿脑膜炎，老人以及免疫力低下的人群可能会引起败血症等疾患；肠道感染时会出现如水泻、带血腹泻、腹绞痛、发烧、呕吐等，严重时，可并发急性肾炎；如果肠道以外的器官被大肠杆菌感染，则可能引起人体肠胃炎、尿道炎、膀胱炎、阑尾炎等。

2 测定方法

传统检测方法：多管发酵法、比浊法、稀释平板计数法等；其特点：不具时

效性，耗力费时，操作繁复，其检测周期难以适应当前快速判断污染源的要求。近年来，随着食品卫生和安全控制要求的不断深化，科学技术（生物化学、遗传学、免疫学、分子生物学等学科）的不断发展，新的快速诊断检测大肠杆菌污染的方法已被国内外研究人员开发出来，如酶底物法、聚合酶链反光法、免疫技术、荧光分析法等。

2.1 传统方法

2.1.1 多管发酵法

多管发酵法是根据该类细菌能够使乳糖发酵产酸产气，镜检无芽孢、呈钝圆杆状，革兰氏染色后呈阴性等特征。因为以上特性，因此用此种方法检测水样中大肠菌群。。根据大肠杆菌产生的β—葡萄糖醛酸酶能够分解荧光底物释放出荧光产物的特性，将大肠杆菌接种在含有荧光底物培养基，放在44.5摄氏度的恒温培养箱中培养24小时，观察在紫外光下是否产生荧光。

2.1.2 平板计数法

平板计数法是统计活菌数的有效方法，其原理是将待测活菌稀释为单个的细胞，将单个的细胞培养成肉眼看得见的单个菌落，再根据稀释倍数推测菌数。具体做法是将大肠杆菌样品用LB培养液溶解，稀释至107或108倍，分别取0.lmL 大肠杆菌在37℃条件下培养48h后，计算每个稀释液于6个固体培养基的平皿中单个菌落数，并根据平皿中的稀释倍数测算出待测样品的菌数。单菌落的生产可能不止一个细胞产生的，因此采用平板计数法，其测量结果低于实际的菌数。

2.1.3 滤膜法检测水中大肠菌群

濾膜检测技术是目前最为普遍采用的微生物检测方法，也是国外普测技术。采用大肠菌群的滤膜法，首先用微孔滤膜（孔径为0.45pm）过滤水样，经过抽滤细菌则被留在滤膜上，剪下贴在含有乳糖的培养基上在37摄氏度下培养24h。通过计算滤膜上显现的紫红色菌落来确定菌数。

2.2 大肠杆菌新的测定方法

2.2.1 酶底物法

酶底物法的基本原理是大肠杆菌在含有乳糖的培养基上会产生β—半乳糖苷酶，这种物质可以分解色原底物释放出“色原体”，改变培养基颜色。酶底物法结果准确、无培养基干扰又可减少杂菌干扰，且假阳性与假阴性反应低，出具结果快（18-24小时出具报告），具有容易判操、方法简便等特点，因此入选国家标准GBT5750.12—2006。

2.2.2 聚合酶链反应

聚合酶链反应是一种新技术，是利用DNA聚合酶物质模拟天然DNA复制过程，在实验室条件下特异性扩增DNA（或RNA）片段，同时体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。2～4分钟即可完成一个新周期由高温变性、低温退火、适温延伸等几步反应扩增的循环，待扩增目的基因扩增几百万倍，只需要2～3小时。

2.3 免疫检测

通过检测反应物上的指示物，以抗原和抗体间的特异性反应为基理，对抗原或抗体进行定性或定量，检测的快速高效方法。目前快速检测技术普遍采用的方法有：ELISA、反向被动乳胶凝集法、乳胶凝集法、酶联荧光分析法、免疫沉淀法、免疫血清法、抗体印迹法等。

2.4 化学法

化学发光法是一种化学分析方法。主要是利用物质在进行化学反应时会伴随有光辐射的现象的原理，此方法可以检测到极低细菌浓度，但需要足够长的培养时间，最低可以检测到食品中的几个菌落。科学研究者利用对大肠杆菌的渗透可以减低胞内酶的扩散障碍，加速基底向酶的传递这一特性来提高检测信号。

3 小结

传统检测需要时间较长，检验效率相对低，但检测方法仍然被广泛的应用于食品卫生控制技术，并被纳入国家检测标准，被政府相关检测机构及企业长期采用。随着科学技术和微生物控制技术的发展，快速检测大大的提高了检测效率，对食品安全微生物控制起到了关键性的成效。

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