蒽酮比色法测定酵母菌中海藻糖含量实验报告
酶_DNS比色法测定酵母海藻糖的研究
第32卷第2期 2002年6月工业微生物Industrial M icrobiologyVol.32No.2June 2002*天津市自然科学基金资助项目(编号:013609711)酶 DNS 比色法测定酵母海藻糖的研究*王 兰, 肖冬光, 张 正(天津轻工业学院,天津300222)摘 要 确定了以酶 DNS 比色法定量测定酵母海藻糖的方法,并对可能影响测定的因素进行了研究。
结果表明,酶 DNS 比色法无设备条件要求限制,且快速、准确、特异性强。
关键词:海藻糖; 酶法分析; DNS 比色法; 酵母 海藻糖是一种广泛存在于自然界的由二个葡萄糖分子经a,a 1,1糖苷键结合而成的非还原性双糖,它的结构稳定,化学惰性,无毒性。
因它对膜及蛋白质具有独特的保护作用而引起了人们的高度重视,目前已在医药、食品、化妆品、农业等方面具有广泛的应用价值,成为了一项极有应用和开发前景的产品[1~3]。
目前最普遍采用的海藻糖分析方法是蒽酮比色法,它有费用低、操作简便等优点,但由于极易受到能同蒽酮反应的物质的干扰,所以其测定结果往往重现性不好易产生波动[4]。
近几年来又发展起了酶法及H PLC 法。
酶法即是利用海藻糖特异性的分解酶对海藻糖进行分解,使其转化为二分子葡萄糖,然后再利用葡萄糖氧化酶及过氧化物酶测定所产生的葡萄糖[5~7]。
这种方法虽然比蒽酮法精确,但使用酶类及影响因素较多,不易控制。
HPLC 法是目前最为精确的海藻糖定性、定量方法[4],但这种方法的推广不仅会受到设备条件的限制,而且因对样品的纯度要求高,无法对提取过程中的中间试样进行测定,给研究工作带来了一定的困难。
因此,找到一种既准确又简便的海藻糖测定方法已成为目前研究工作的当务之急。
本实验首先利用对海藻糖具有特异性分解作用的海藻糖分解酶将一分子海藻糖分解成二分子葡萄糖[8],然后再利用二硝基水杨酸法测定所产生的葡萄糖,从而定量测定海藻糖。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种面包酵母BY 11(本实验室保存)1.1.2 主要试剂标准海藻糖(Sig ma 公司生产),TREHALASE (Sigma 公司生产),3,5-二硝基水杨酸。
实验一总糖的测定-蒽酮比色法
实验一总糖的测定-蒽酮比色法一、实验目的（1）学习蒽酮比色定糖法的原理和方法。
（2）学习723型分光光度计的原理和操作方法。
二、实验原理总糖是指样品中的还原糖及在本法测定条件下水解成还原单糖的蔗糖、麦芽糖和可部分水解为葡萄糖的淀粉。
蒽酮比色法是测定样品中总糖量的一个灵敏、快速、简便的方法。
其原理是糖类在较高温度下被硫酸作用脱水生成糠醛或糠醛衍生物后与蒽酮（C14H10O）缩合成蓝色化合物。
溶液含糖量在每毫升150微克以内，与蒽酮反应生成的颜色深浅与糖量成正比。
蒽酮不仅能与单糖也能与双糖、糊精、淀粉等直接起作用，样品不必经过水解。
三、实验材料、器材与试剂1、材料白薯。
2、器材（1）试管（或具塞试管）及试管架；（2）吸量管；（3）沸水浴；（4）冰浴；（5）723型分光光度计。
2、试剂（1）蒽酮试剂：称取100mg蒽酮溶于100mL98%硫酸溶液（A.R）中，用时配制。
（2）葡萄糖标准溶液（100μg/mL）:精确称取100mg干燥葡萄糖，用蒸馏水定容至1000mL。
（3）样品溶液：称取500g市售白薯，洗净切碎后用多功能食品加工机磨成浆，4层纱布压滤、弃滤液留渣，将渣放入烘箱内80℃～85℃烘干后，再用植物粉碎机（微型）研细，过筛区100目筛下物为待测样品。
（也可用市售红薯面粉代替）取样品在烘箱内150烘干，恒重后，精确称取1～5g，置于锥形瓶中，加入80mL沸蒸馏水，放入沸水浴。
不时摇动，提取半小时。
取出立即过滤，残渣用沸蒸馏水反复洗涤并过滤，合并滤液。
冷却至室温，用蒸馏水定容至100mL。
四、实验方法(1)制作标准曲线取7支干燥洁净的试管，编号后按下表操作。
每管加入葡萄糖标准液和谁后立即混匀，迅速置于冰浴中，待各管都加入蒽酮试剂后，同时置于沸水浴中，准确加热7分钟，立即取出置于冰浴中迅速冷却。
待各管溶液达室温后，用1cm厚度的比色皿，以第一管为空白，在620nm处迅速测其余各管的光吸收值。
然后以第2～7管溶液含糖量μg数为横坐标，吸光度（A620nm）为纵坐标，画出含糖量与A620nm 的相关标准曲线。
蒽酮法测还原糖
总糖的含量的测定（蒽酮法）一、实验目的掌握蒽酮比色法测定糖的原理与方法。
二、实验原理蒽酮比色法是一个快速而简便的测定糖方法。
蒽酮可以和游离的己糖或多糖中的己糖基、戊醛糖及己糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620 nm 处有最大吸收。
蒽酮可与其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。
当样品中存有含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈红色。
对于以上特定的糖类反应较稳定。
三、实验器材1.吸管2.试管3.分光光度计4.水浴锅5.电炉6.电子分析天平四、实验试剂1．蒽酮试剂：取2 g蒽酮溶于1000 ml体积分数为80 %的硫酸中，当时配制使用。
2．标准葡萄糖溶液（0.1 mg/ml）：100 mg葡萄糖溶于蒸馏水并稀释至1000 ml（可滴加几滴甲苯作防腐剂）。
3． 6 mol/l HCl溶液。
4．10 % NaOH溶液：称取10 g NaOH固体，溶于蒸馏水并稀释至100 ml。
五、实验操作1.制作标准曲线取干净试管7支，按下表进行操作。
表蒽酮比色法测定糖含量的标准曲线制作2.样品的处理（见实验四）取上述实验四的水解液，冷却后用10 % NaOH溶液中和至pH呈中性，然后用蒸馏水定容至100 ml，过滤，取滤液10 ml，用蒸馏水定容于100 ml成稀释1000倍的总糖水解液，用于糖含量的测定。
测定时取1 ml总糖水解液测定还原糖的含量（同标准曲线）。
样品中糖含量的计算：w —糖的质量分数（%）；C —从标准曲线上查出的糖质量浓度(mg/ml)； V —样品稀释后的体积（ml ）；m —样品的质量（mg ）。
ｗ＝ CVｍ ×100%。
实验十蒽酮比色法测定植物组织中总糖和可溶性糖的含量
实验十蒽酮比色法测定植物组织中总糖和可溶性糖的含量一、实验目的掌握蒽酮法测定总糖和可溶性糖含量的原理和方法。
二、实验原理蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。
酸可使糖类（如已糖基，戊醛糖及已糖醛酸）脱水生成糠醛，生成的糠醛或烃甲基糖醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，该物质在620nm处有最大光吸收值。
在10~100ug范围内其他颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。
蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。
当存在含有较多色氨酸蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。
而对于上述特定的糖类物质，反映较稳定。
多糖和寡糖可用酸水解成单塘和蒽酮试剂反应，因此利用蒽酮法可测组织中总糖和可溶性糖。
这一种方法具有很高的灵敏度，糖含量在30ug左右时就能进行测定，所以可作为微量测糖之用。
一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。
三、仪器，试剂和材料1．仪器（1）分光光度计；（6）漏斗，漏斗架个6个（2）电子天平；（7）容量瓶：50ml2个；（3）三角瓶：50ml2个（8）移液管；（4）刻度具塞试管；10ml13支；（9）水浴锅。
（5）试管架，试管夹各2个；2．试剂（1）葡萄糖标准液：100ug/ml；（2）浓硫酸；（3）蒽酮试剂：0.2g蒽酮，溶于100ml浓流酸中，现当日配制使用。
3．材料小麦幼苗分蕖节或其植物的幼嫩组织（大白菜心）。
四、操作步骤1．葡萄糖标准曲线的制作取7支试管，按下表配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液；管号1234567葡萄糖标准液/mL00.10.20.30.40.50.6蒸馏水/mL 1.00.90.80.70.60.70.8葡萄糖含量/ug0102030405060在每支试管中，加入蒽酮试剂4.0ml，迅速浸入冰水浴中冷却。
各加完后一起浸入沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。
自水浴重新煮沸起，准确煮沸10min取出，用流水冷却，室温放置10min，在620nm波长下比色。
以标准葡萄糖含量（ug）做横坐标，以吸光值作纵坐标，做出标准曲线。
总糖的测定蒽酮比色方法
总糖测定——蒽酮比色法一、原理：单糖类遇浓硫酸时，脱水生成糠醛衍生物，后者可与蒽酮缩合成蓝绿色的化合物，当含糖量在20～200mg/L范围内时，其呈色强度与溶液中糖的含量成正比，故可比色定量。
二、试剂：1、10～100ppm葡萄糖系列标准溶液：称取1.0000g葡萄糖，用水定容至1000ml，从中吸取1、2、4、6、8、10ml分别移入100ml容量瓶中，用水定容，即得浓度为10、20、40、60、80、100ppm（ug/ml）葡萄糖系列标准溶液。
2、0.1%蒽酮溶液：称取0.1g蒽酮，溶于100ml72%硫酸中，贮存于棕色瓶中，于0～4℃下存放。
3、72%硫酸溶液。
三、测定方法：（一）样品处理：称取适量样品，用100ml水转移至250ml容量瓶，慢慢加入5ml乙酸锌和5ml亚铁氰化钾，沸水浴5～10min，定容，静置至上清，过滤。
根据估计含糖量，去滤液进行稀释，使糖含量在20～80mg/L范围内。
（二）测定吸取系列标准溶液、样品溶液（含糖20～80ppm）、蒸馏水（空白）各2ml，分别加入具塞比色管中，沿管壁各加入蒽酮试剂10ml，立即摇匀，放入沸水浴中准确加热10min，取出，迅速冷却至室温，在暗处放置10min，用1cm比色杯，以零管调仪器零点，在620nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
根据样品溶液的吸光度查标准曲线，得糖含量。
四、结果计算：总糖（以葡萄糖计，%）=c×稀释倍数×10-4式中：c：从标准曲线查得的糖浓度，ppm（ug/ml）；10-4：将ppm换算为%的系数五、说明与讨论1、该法是微量法，适合于含微量碳水化合物的样品，具有灵敏度高，试剂用量少等优点。
2、该法按操作的不同可分为几种，主要差别于蒽酮试剂中硫酸的浓度（66～95%），取样量（1～5ml）、蒽酮试剂用量（5～20ml）、沸水浴中反应时间（6～15min）和显色时间（10～30min）。
这几个操作条件之间是有联系的，不能随意改变其中任何一个，否则将影响分析结果。
蒽酮法实验报告
一、实验目的1. 熟悉蒽酮法检测还原糖的基本原理和方法。
2. 掌握蒽酮试剂的配制和操作步骤。
3. 通过实验，学会运用蒽酮法检测还原糖含量。
二、实验原理蒽酮法是一种检测还原糖的经典方法。
其原理是还原糖在酸性条件下，能与蒽酮发生显色反应，生成红色化合物。
根据溶液颜色的深浅，可以计算出还原糖的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 标准葡萄糖溶液- 样品溶液- 蒽酮试剂- 醋酸- 硫酸- 水浴锅- 移液管- 比色皿- 分光光度计2. 实验仪器：- 实验台- 电子天平- 移液器- 烧杯- 滴定管- 玻璃棒四、实验步骤1. 配制蒽酮试剂：- 称取0.1g蒽酮，加入100mL醋酸溶液，溶解后转移至1000mL容量瓶中，用醋酸溶液定容至刻度。
2. 标准曲线的制作：- 分别吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL标准葡萄糖溶液于6个试管中，依次加入5mL蒽酮试剂，混匀后放入水浴锅中加热10分钟。
- 取出试管，冷却至室温，用蒸馏水定容至10mL。
- 使用分光光度计在波长620nm处测定吸光度。
- 以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3. 样品溶液的制备：- 称取一定量的样品，加入适量的蒸馏水，溶解后定容至100mL。
4. 样品溶液的测定：- 分别吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL样品溶液于6个试管中，依次加入5mL蒽酮试剂，混匀后放入水浴锅中加热10分钟。
- 取出试管，冷却至室温，用蒸馏水定容至10mL。
- 使用分光光度计在波长620nm处测定吸光度。
5. 还原糖含量的计算：- 根据样品溶液的吸光度，从标准曲线中查得相应的葡萄糖浓度。
- 根据样品溶液的体积和浓度，计算还原糖含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线的制作：- 标准曲线的线性范围为0.5～2.5mg/mL。
2. 样品溶液的测定：- 样品溶液的吸光度在标准曲线的线性范围内。
3. 还原糖含量的计算：- 样品溶液的还原糖含量为（计算值）mg/mL。
平菇中海藻糖的提取与含量测定
平菇中海藻糖的提取与含量测定作者：李仁茂黄健华来源：《安徽农业科学》2014年第11期摘要 [目的]对平菇中的海藻糖进行定性和定量分析。
[方法]以平菇为试验材料，以热乙醇为抽提液，用纸层析进行定性分析，以蒽酮比色法进行定量测定。
[结果]平菇（含水量为85%）中含有海藻糖，其含量为2.06%，干燥平菇中海藻糖含量则为13.7%。
[结论]该研究可为海藻糖的提取和开发提供依据。
关键词平菇；海藻糖；提取；含量；测定中图分类号 S646.1+4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03369-03Abstract [Objective] To make qualitative and quantitative analysis of trehalose in Pleurotus Ostreatus. [Method] The qualitative analysis was performed by paper chromatography， and the quantitative determination was conducted by anthrone spectrophotometry using Pleurotus Ostreatus as experiment material， hot alcohol as extracting reagent. [Results] The results showed that there is trehalose in Pleurotus Ostreatus which contain 85% water， in which the content of trehalose is2.06%， while its content in dry Pleurotus Ostreatus is 13.7%. [Conclusion] This study will provide certain basis for extraction and development of trehalose.Key words Pleurotus Ostreatus； Trehalose； Extraction； Content； Determination海藻糖是蔗糖的同分异构体，基本性质同其他双糖，但海藻糖还有其他不同的功能。
蒽酮比色法[宝典]
![蒽酮比色法[宝典]](https://img.taocdn.com/s3/m/4776734776232f60ddccda38376baf1ffc4fe367.png)
蒽酮比色法蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。
蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。
本法多用于测定糖原的含量，也可用于测定葡萄糖的含量。
蒽酮比色法测糖试验蒽酮比色法测定多糖含量1、蒽酮比色法测糖试验一实验目的掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法二实验原理蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。
三实验器材及试剂马铃薯干粉可调试移液器或移液管可见分光光度计（723型）电子分析天平水浴锅电炉子蒽酮试剂：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，当日配制使用。
标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中，定容到1000ml 备用。
四、操作1.制作标准曲线取7支干燥洁净的试管，按表1顺序加入试剂，进行测定。
以吸光度值为纵坐标，各标准溶液浓度（mg/ml ）为横坐标作图得标准曲线。
表1 蒽酮比色法定糖——标准曲线的制作沸水浴中准确煮沸10min，取出用流水冷却，室温放10min,于620nm处比色葡萄糖浓度（mg/ml）2.样品含量的测定样品液的制作：精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min（不时摇动）—→取出，3000rpm离心10min（或过滤）—→反复洗涤残渣2次—→合并滤液—→冷却至室温—→定容到50ml的锥形瓶中—→再从中取出1ml，再定容到10ml的容量瓶中样品液的测定：（1）取4支试管，按照表2加样（加蒽酮时需要冰水浴5min冷却）表2 蒽酮比色法定糖——样品的测定（2）加样冷却完成后置沸水中煮沸10min，取出流水冷却放置10min，620nm 处比色测量各管OD值。
（3）以1号试管作为调零管，2、3、4号管的OD值取平均后从标准曲线上查出样品液相应的含糖量。
3．结果计算：C×Vw = ————×100%m，式中w：糖的质量分数（%）C：从标准曲线中查出的糖质量分数（mg/ml）V：样品稀释后的体积（ml）m：样品的质量（ml）2、蒽酮比色法测定多糖含量一试验原理植物在个体发育的各个时期，代谢活动也发生相应的变化，碳水化合物的代谢也不例外，其含量也随之发生变化。
植物生理学实验：实验四 植物可溶性糖含量的测定(蒽酮比色法)
作业
得出实验结果后，根据标准曲线算出的含糖量 ，写于实验报告上。（之前问题）
管号
0
1
2
345
Hale Waihona Puke 100mg/L葡萄糖标准液（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
水（mL）
2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0
蔗糖含量（μg）
0 20 40 60 80 100
（2）在每支试管中立即加入蒽酮乙酸乙酯试剂0.5mL和
5mL浓硫酸，用玻棒混匀，沸水浴中准确保温1min取
实验结果计算与分析
从标准曲线查得的糖含量（μg）
植物样品含糖量（％）＝
(C× VT× N) × 100
(Vs× W× 106)
C-从标准曲线查得的糖含量（μg）
VT-提取液体积（ml） VS-吸取样品液体积（ml） N-稀释倍数（根据实际情况）
W-样品重（g）
注意事项
加浓硫酸时应缓慢，以免产生大量 热量而爆沸，灼伤皮肤，如出现上 述情况，应擦干后迅速用自来水冲 洗。
出，自然冷却至室温，在630nm波长下比色。以标准蔗
糖含量作横坐标，以吸光值作纵坐标作标准曲线。
实验步骤
2. 植物样品中可溶性糖的提取（其他组做，数据共享） 将植物叶片剪碎混匀，准确称取0.3g3份，加入研钵中，
再加入2-3mL水和少量石英砂，研磨后转入试管中，用 水再洗涤2次，均转入试管中。将试管置于沸水浴中提取 30min，提取液过滤至25mL容量瓶，反复冲洗试管及 残渣，定容至刻度。 3. 显色测定（同上）： 吸取0.5mL提取液于试管中，加水1.5mL，蒽酮乙酸乙酯 试剂0.5mL和5mL浓硫酸，混匀，沸水浴中准确保温 1min取出，自然冷却至室温，在630nm波长下比色。
蒽酮比色法测定酵母菌中海藻糖含量实验报告
2.1 酵母菌中海藻糖→TCAaq
2.2 海藻糖→葡萄糖→糖醛
2.3 糖醛+蒽酮→蓝绿色复合物→分光光度计测量
3. 试剂与仪器
1） 化学试剂
2g/L 蒽酮试剂：称取 0.10g 蒽酮溶于 50ml80%（体积分数）H2SO4 中，0.1g/L 标准葡萄 糖溶液，5g/L 三氯乙酸水溶液（TCA）。
2） 测量仪器
沸水浴、冰水浴、53WB 分光光度计、离心机
4. 实验步骤
准备试剂与仪器
↓ 称量 30mg 干酵母
↓ 加入 3mlTCAaq
↓ 离心，取上清液稀释 40 倍
↓ 配制蒽酮溶液
↓
1
实验 4 蒽酮比色法测定酵母菌中海藻糖含量
取 5 支编号试管，加如下溶液
↓ 表一、溶液配制组成
编号
1
2
3
4
葡萄糖/ml
0
0.3
4）使用离心机要注意哪几个问题？
两侧必须配平，注意安全。
5）53WB 分光光度计的原理及操作注意事项是什么？ 原理：
分光光度计测量的是分子内电子跃迁产生的带状吸收光谱。根据不同的特征峰可以进行
定性测量，根据朗伯比尔定律可以进行定量测量。
注意事项：
溶液必须为均匀溶液，拿放石英皿要轻拿轻放，注意透光侧的光洁。
四、自评
这次实验在张老师的带领下收获颇多。首先在实验中老师反复强调了安全的重要性，这
让我加强了自己的安全意识。在实验流程的书写、数据处理的规范上老师也让我了解了正确
的做法，这些均对于我以后的科研生活有着很大的帮助，希望能够在以后的实验中越做越好。
五、参考文献
[1]王保国，化工过程综合实验（第 2 版），清华大学出版社，北京，2009 年 10 月。
实验8 植物组织中可溶性糖含量的测定(蒽酮比色法)
实验七植物体内可溶性糖含量的测定（蒽酮法）一、实验目的了解蒽酮法测定可溶性糖含量的原理；掌握分光光度计的使用二、实验原理糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。
不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。
因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。
蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法，在强酸性条件下，蒽酮可以与游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（还原性和非还原性）作用生成蓝绿色的糖醛衍生物，其颜色的深浅与糖的含量在一定范围内成正比。
蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。
当存在含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。
上述特定的糖类物质，反应较稳定。
该法特点：灵敏度高，测定量少，快速方便。
三、材料、仪器及试剂1.材料：植物种子、白菜叶、柑桔2.仪器：分光光度计；恒温水箱； 20ml具塞刻度试管（3支）漏斗；100ml容量瓶；刻度试管；试管架；剪刀；研钵3.试剂（1）200μg/ml标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至500ml。
（2）蒽酮试剂：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光处贮藏；（3）浓硫酸四、实验方法1.葡萄糖标准曲线的制作取6支20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。
在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml浓H2SO4，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值（OD），以标准葡称取1克白菜叶，剪碎，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆，然后转入20ml刻度试管中，用10ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。
置沸水浴中加盖煮沸10分钟，冷却后过滤，滤液收集于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。
3.糖含量测定用移液管吸收1ml提取液于20ml具塞刻度试管中，加1ml水和0.5ml 蒽酮试剂。
总糖的测定蒽酮比色法
植物组织中总糖和还原糖含量的测定（蒽酮比色法）2010-5-24一、实验目的掌握蒽酮比色法测定总糖和还原糖含量的原理和方法，学会正确使用分光光度计。
二、实验原理游离的己糖或多糖中的己糖基、戊糠醛及己糖醛酸在浓硫酸的作用下脱水生成糠醛衍生物，糠醛衍生物与蒽酮缩合成蓝色的化合物，在620nm处有最大吸收，在一定糖浓度范围内（200ug/ml），溶液吸光度值与糖溶液的浓度成线性关系。
用酸将植物组织中没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，或直接提取植物组织中的还原糖，即可对植物组织中的总糖和还原糖进行定量测定。
三、实验材料1．可见分光光度计、电子天平(1/100)、粉碎机、水浴锅、电炉。
2．研钵、量筒、三角烧瓶、烧杯、容量瓶、玻璃漏斗、试管1.5cm×15cm、刻度吸管、胶头滴管、pH试纸、坐标纸。
3．植物原料，如银耳、木耳、菜叶等。
四、实验试剂1．蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于l000ml体积分数为80％的硫酸中，当日配制使用。
2．标准葡萄糖溶液(0.1mg／m1)：称取100mg葡萄糖，溶于蒸馏水并稀释至1 000ml（可滴加几滴甲苯作防腐剂）。
3．6mol／L HCl溶液：50ml盐酸，加水至100ml。
4．10％NaOH溶液：称取10g NaOH固体，溶于蒸馏水并稀释至100ml。
五、操作步骤1．葡萄糖标准曲线的绘制取干净试管6支，按下表进行操作。
以吸光度为纵坐标，各标准液浓度(mg／m1)为横坐标做图。
2．样品中还原糖的提取和测定称取植物原料干粉0.1～0.5g，加水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30ml的蒸馏水冲洗研钵2～3次，洗出液也转入三角烧瓶中。
于50℃水浴中保温半小时（使还原糖浸出），取出，冷却后定容至100ml。
过滤，取lml滤液进行还原糖的测定：吸取lml总糖类溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中准确加热10min，取出用自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。
蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量
蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量一. 实验原理糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后，与蒽酮(C14H10O)脱水缩合，形成糠醛的衍生物呈蓝绿色。
该物质在620 nm处有最大吸收，在150 µg/mL范围内，其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。
该法有很高的灵敏度，糖含量在30 µg左右就能进行测定。
二. 试剂器材蒽酮试剂：精密称取0.1g蒽酮，加80%浓H2SO4100 mL使溶解，摇匀。
当日配制使用；葡萄糖标准液：将无水葡萄糖置于五氧化二磷干燥器中，12hr后精密称取100mg，用蒸馏水定容至100ml；其他器材：分析天平、分光光度计、容量瓶(100ml、50ml、10ml)、烧杯、具塞试管、移液器、移液器吸头、涡旋振荡器和废液缸等。
三. 操作步骤葡萄糖标准曲线的制作取7支具塞试管，按下表数据精密配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液，每个浓度做2-3个重复：管号0 1 2 3 4 5 6 标准葡萄糖溶液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2蒸馏水/mL 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 在每支试管中立即加入蒽酮试剂6m L，振荡混匀，各管加完后一起置于沸水浴中加热15min。
取出，迅速浸于冰水浴中冷却15min。
在625nm波长下以第1管为空白，迅速测定其余各管吸光值。
以标准葡萄糖含量( g)为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
样品的测定将样品溶液糖浓度调整到测定范围，精确吸取2m L置于干燥洁净试管中，在每支试管中立即加入蒽酮试剂6m L，振荡混匀，各管加完后一起置于沸水浴中加热15min。
取出，迅速浸于冰水浴中冷却15min，每个浓度做2-3个重复。
在625nm波长下迅速测定各管吸光值。
活性污泥海藻糖含量的测定方法与设计方案
本技术涉及一种活性污泥海藻糖含量的测定方法，属于环境工程学科中的污水生物处理技术领域。
为了实现海藻糖在污水生物处理技术领域内的应用，本技术以蒽酮比色法为基础，对活性污泥微生物细胞内的海藻糖进行三氯乙酸-超声联合提取，海藻糖遇浓硫酸脱水生成糠醛及其衍生物，该衍生物与蒽酮发生反应，反应后溶液呈蓝绿色，在610nm处比色测定活性污泥中海藻糖的含量。
本技术的积极效果是该法安全可靠、简单易行，成本较低，测定精度高，可实现活性污泥中海藻糖的准确快速测定。
技术要求1.本技术的使用特征是：活性污泥海藻糖含量的测定过程中，取0.8mL的活性污泥混合液置于离心机中离心，用蒸馏水冲洗、搅拌离心所得活性污泥再离心，去掉上清液后加入三氯乙酸溶液，通过超声处理后离心，取其上清液加入蒽酮试剂，冷却后置于沸水浴中6min，再冷却，用1cm比色皿在610nm波长下测定吸光度，最后根据吸光度和污泥称重结果计算活性污泥细胞内海藻糖含量。
技术说明书一种活性污泥海藻糖含量的测定方法技术领域本技术属于环境工程学科中的污水生物处理技术领域，具体涉及一种活性污泥海藻糖含量的测定方法。
背景技术海藻糖(Trehalose)是一种非还原性二糖，由2个葡萄糖分子以α，α，1，1-糖苷键连接而成，分子式为C12H22O11·2H2O，相对分子量为378.33，白色结晶，化学性质极其稳定，无毒无害，不会焦糖化。
研究表明，海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是生物体应对外界环境刺激的一种重要代谢产物。
生物体在恶劣环境下表现出的抗逆耐受力与它们体内存在的海藻糖含量密切相关，生物体可以通过调节合成体内海藻糖来抵御外界伤害。
目前，生物体海藻糖分析测定技术已广泛应用于食品、医药、化妆品等产业领域，但在环境工程领域内至今没有得到应用。
由于在实际运行的污水生物处理系统中活性污泥时刻承受着因负荷变化、环境温度变化、pH值变化等带来的冲击，这种冲击也会反映在污水生物处理工艺中活性污泥的海藻糖含量水平上，因此通过分析测定活性污泥微生物细胞内海藻糖含量，可以准确地表征出活性污泥受到外界环境刺激的程度，并可寻找利用外援海藻糖强化活性污泥应激能力的技术方法。
实验二十一 可溶性总糖的测定(蒽酮比色法)
实验二十一可溶性总糖的测定（蒽酮比色法）一、目的掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法。
二、原理强酸可使糖类脱水生成糠醛，生成的糠醛或羟甲基糖醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，该物质在 620 nm 处有最大吸收 . 在 10 -100ug 范围内其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。
这一方法有很高的灵敏度，糖含量在 30ug 左右就能进行测定，所以可做为微量测糖之用。
一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。
三、仪器、试剂和材料1 .仪器（ 1) 分光光度计(2 ）电子顶载天平(3 ）三角瓶： 50m1 X 1（ 4 ）大试管： 9 支（ 5) 试管架，试管夹（ 6 ）漏斗，漏斗架（ 7 ）容量瓶： 50rnl X 2（ 8 ）刻度吸管： 1m1X3 ， 2m1X1 ， 5mlX1（ 9 ）水浴锅2 .试剂（ 1) 葡萄糖标准液： l00ug/ml(2 ）浓硫酸(3) 蒽酮试剂 :0.2g 蒽酮溶于 100 ml 浓 H2SO4 中当日配制使用。
3 .材料小麦分蘖节。
四、操作步骤1 .葡萄糖标准曲线的制作取 7 支大试管，按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液：管号 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖标准液（ ml ） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8蒸馏水（ ml ） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2葡萄糖含量（ ug ）0 10 20 30 40 60 80在每支试管中立即加入蒽酮试剂 4.0m1 ，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。
自水浴重新煮沸起，准确煮沸 l0min 取出，用流水冷却，室温放置 10min ，在 620 nm 波长下比色。
以标准葡萄糖含量（ ug) 作横坐标，以吸光值作纵坐标，作出标准曲线。
2 .植物样品中可溶性糖的提取将小麦分蘖节剪碎至 2mm 以下，准确称取 Ig, 放入 50m1 三角瓶中，加沸水 25m1 ，在水浴中加盖煮沸10min ，冷却后过滤，滤液收集在 50m1 容量瓶中，定容至刻度。
实验8可溶性总糖的测定蒽酮法
实验8-可溶性总糖的测定(蒽酮法) 蒽酮法是一种常用的测定可溶性总糖的方法，其基本原理是糖类在强酸环境中与蒽酮反应生成蓝色化合物，该化合物的吸光度与糖含量成正比，因此可以通过测定吸光度来计算糖含量。
下面我们来详细了解一下实验步骤和注意事项。
一、实验原理蒽酮法测定可溶性总糖的原理是糖类在强酸环境中与蒽酮反应生成蓝色化合物，该化合物的吸光度与糖含量成正比。
在一定的范围内，溶液的吸光度与糖含量成正比，因此可以通过测定吸光度来计算糖含量。
该方法的优点是灵敏度高、准确性好、操作简单、干扰因素少。
二、实验步骤1.准备试剂和仪器试剂：蒸馏水、葡萄糖标准溶液（已知浓度）、待测溶液、蒽酮、浓硫酸。
仪器：电子天平、电热恒温水浴锅、分光光度计、容量瓶、移液管、试管、滴管、冰块等。
2.配制工作曲线（1）用移液管吸取葡萄糖标准溶液100μL，将其加入10个试管中。
（2）用移液管分别吸取蒸馏水1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0mL，分别加入上述试管中，并加入蒸馏水至总体积为10mL。
（3）向每个试管中加入1.0mL蒽酮溶液，迅速混匀。
（4）向每个试管中加入浓硫酸5.0mL，迅速混匀。
（5）将试管放置在冰水浴中静置10min，使反应完全。
（6）从冰水浴中取出试管，在室温下放置10min，使溶液温度恢复到室温。
（7）用分光光度计测定各试管中溶液的吸光度（波长为625nm）。
（8）以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制工作曲线。
3.测定待测溶液的浓度（1）用移液管吸取待测溶液100μL，将其加入试管中。
（2）向试管中加入蒸馏水至总体积为10mL。
（3）按照步骤2.3~2.7进行操作，测定待测溶液的吸光度。
（4）根据工作曲线查得待测溶液的浓度。
4.计算待测溶液中可溶性总糖的含量可溶性总糖含量（mg/mL）= 查得浓度× 稀释倍数三、注意事项1.实验过程中要避免阳光直射，以免影响实验结果。
实验8植物组织中可溶性糖含量测定(蒽酮比色法)
实验方案一、实验目的通过实验，掌握测定萝卜品质的方法（一）萝卜外部形态的测定1、实验材料取鲜样3个∕小区直尺、蒸馏水、笔、记录本、吸水纸2、实验方法．用自来水将各组萝卜洗净后，再用蒸馏水洗涤，擦干表面水分．每个小区取3个重复，用电子天平称量每株的鲜重，用直尺测量植株的茎长、茎粗、叶长，取平均值作为指标值实验(二) 植物体内可溶性糖含量的测定（蒽酮法）一、实验目的了解蒽酮法测定可溶性糖含量的原理；掌握分光光度计的使用二、实验原理糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。
不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。
因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。
蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法，在强酸性条件下，蒽酮可以与游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（还原性和非还原性）作用生成蓝绿色的糖醛衍生物，其颜色的深浅与糖的含量在一定范围内成正比。
蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。
当存在含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。
上述特定的糖类物质，反应较稳定。
该法特点：灵敏度高，测定量少，快速方便。
三、材料、仪器及试剂1.材料：植物种子、白菜叶、柑桔2.仪器：分光光度计；恒温水箱； 20ml具塞刻度试管（3支）漏斗；100ml容量瓶；刻度试管；试管架；剪刀；研钵3.试剂（1）200μg/ml标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至500ml。
（2）蒽酮试剂：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光处贮藏；（3）浓硫酸四、实验方法1.葡萄糖标准曲线的制作取6支20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。
在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml浓H2SO4，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值（OD），以标准葡2.称取1克白菜叶，剪碎，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆，然后转入20ml刻度试管中，用10ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。
海藻糖含量检测试剂盒说明书 可见分光光度法
海藻糖含量检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC0330规格：50T/48S产品内容：提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存；标准品：粉剂×1支，含10mg海藻糖。
产品说明：海藻糖存在于大量有机体中，包括细菌、藻类、酵母、植物、昆虫和其他无脊椎动物。
由于海藻糖具有独特的不同于其他碳水化合物的生物学特性，能在干旱、高温、脱水、冷冻、高渗透压及毒性物质等恶劣环境下保护生物体细胞蛋白质、脂肪、糖类、核酸等组分不受损害。
测定方法采用蒽酮比色法。
具有灵敏度高﹑简便快捷﹑适用于微量样品的测定等优点。
但是蒽酮比色法也存在一定缺陷，如果样本中含有可溶性糖，则会影响测定。
本试剂盒建议用于除海藻糖外不含其他可溶性糖样本的测定。
试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿﹑研钵、浓硫酸和蒸馏水。
操作步骤：一、海藻糖提取：1、细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次），室温静置45min，振荡3~5次，冷却后，8000g，常温离心，取上清。
2、组织的处理：称取约0.1g样本，常温研碎，加入1mL提取液，室温静置45min，振荡3~5次，冷却后，8000g，常温离心，取上清。
3、血清（浆）的处理：吸取约100μL血清（浆），加入0.9mL提取液，室温静置45min，振荡3~5次，冷却后，8000g，常温离心，取上清。
4、标准品的处理：标准品用1mL双蒸水溶解，溶液浓度为10mg/mL，稀释到0.1、0.08、0.06、0.04、0.02、0mg/mL。
二、测定操作表：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至620nm，蒸馏水调零。
2、调节水浴锅至95度。
粗多糖检测方法(蒽酮比色法)
粗多糖检测方法（蒽酮比色法）：1 主要仪器（1）离心机（ 4000r/min ）。
（2）离心瓶容量 100ml 或具盖 10ml 离心管。
（3）分光光度计。
（4）水浴锅。
2 试剂实验用水为双蒸水；所用试剂为分析纯级。
（1）葡萄糖标准液：准确称取I.OOOOg经过98〜100 C干燥至恒重的分析纯葡萄糖，加水溶解后以水稀释至 1000ml ，此溶液 1ml 含 1mg 葡萄糖，用前稀释10倍（0.1mg/ml ），现用现配。
（2） 0.2%蒽酮硫酸溶液：称取0.2g蒽酮置于烧杯中，缓慢加入100ml浓硫酸（分析纯），溶解后呈黄色透明溶液，现用现配。
3 测定步骤（1）样品处理：准确称取样品 1〜2g 按上法用乙醇沉淀多糖，然后用热水分次溶解沉淀并稀释定容至 100〜250ml （使样液含糖量在 0.02〜 0.05mg/ml间）。
过滤，弃去初滤液即为待测液。
（2）标准曲线的绘制：准确吸取葡萄糖标准液（ 0.1mg/ml ） 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml 于 10ml 具塞比色管中，加水至 1.0ml ，加入蒽酮试剂 5ml 充分混匀，在沸水浴中加热 10min ，取出在流水中冷却 20min后，在 620nm 波长下，以试剂空白调零，测定各管的吸收值绘制标准曲(3) 样品测定：准确吸取样品待测液10ml (含糖20〜80⑷)按标准曲线绘制步骤于 620nm 波长下测定吸光度值并求出样品含糖量。
4 结果计算：m1X= --------------- x F x n x 100%m x 1000式中X—样品中粗多糖含量(以葡萄糖计)(%)；m1 —由标准曲线查得样品液含糖质量( mg )；m —样品质量( g )；n —稀释倍数；F—换算因子。
换算因子的测定：准确称取被测物质的纯品 20mg 置 100ml 容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，吸取 0.2 〜0.4ml 于 10ml 具塞比色管中，加水至 1.0ml 按上法测定。
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4）使用离心机要注意哪几个问题？
两侧必须配平，注意安全。
5）53WB 分光光度计的原理及操作注意事项是什么？ 原理：
分光光度计测量的是分子内电子跃迁产生的带状吸收光谱。根据不同的特征峰可以进行
定性测量，根据朗伯比尔定律可以进行定量测量。
注意事项：
溶液必须为均匀溶液，拿放石英皿要轻拿轻放，注意透光侧的光洁。
1.海藻糖含量的计算
舍去偏差较大的第三个数据点，作图如下：
0.9 0.319
Unknown 0.447
吸光度A
吸光度-糖含量标准曲线
0.35 0.3
0.25 0.2
0.15 0.1
0.05 0 0
y = 0.3653 x R²= 0.9812
0.2
0.4
0.6
0.8
1 糖含量ml
图 1. 吸光度-糖含量标准曲线
在拟合直线时选择了固定截距为 0。
标准曲线方程为 y=0.3653x，相关系数 R2=0.9812。
由标准曲线得到 0.447 吸光度对应的糖含量为 1.22ml。
则酵母菌中海藻糖含量为
2.实验结果与讨论
1.22 × 0.95 × 40 × 3
ω=
30
× 100% = 46.36%
第三个实验点出现了较大的偏差，分析可能的原因是试管内还有杂质，导致显色反应程
0
0.3
0.6
0.9
平均值
8. 教师审阅意见：
Unknown
3
实验 4 蒽酮比色法测定酵母菌中海藻糖含量
第二部分：实验报告
二、实验记录
实验现象： 沸水浴加热中溶液由黄色变为绿色，浓度不同则颜色深度不同。 整理后的数据如下：
表三、实验数据整理
糖浓度/mL
0
0.3
0.6
吸光度
0
0.139
1.760
三、实验结果及讨论
称量药品一定要准确 加入蒽酮操作上需要尽快操作，但要确保安全 注意离心机与分光光度计的使用
6. 要采集的数据
温度，压力，湿度（有则记录），糖浓度，吸光度
7. 原始记录表
温度：
压力：
湿度：
5 未知样 1ml
1 8 10
2
糖浓度/mL 吸光度
实验 4 蒽酮比色法测定酵母菌中海藻糖含量
表二、原始实验数据记录
度加剧。
4
实验 4 蒽酮比色法测定酵母菌中海藻糖含量
3.思考题： 1）加蒽酮试剂时为什么盛有样品的试管必须浸入冰水中冷却？ 保证安全，防止过早进行反应。
2）煮沸样品时为什么“准确”煮沸 10min？ 由于蒽酮试剂与糖的显色强度随时间变化，所以要准确控制时间，本实验中 6min 即可。 3）在沸水浴中加热样品，为什么要打开试管盖？ 使得试管内外气压相等，沸水浴的温度即为其恒压沸点的温度。
六、指导教师批阅意见
表四、实验报告评分表
实验预习
实验记录
结果及讨论
自评 总分
实验原 预习思 实验现 原始数 计算举 数据图 结果讨
理
考
象
据
例
表
论
10
10
10
10
10
15
15
20
8
指导教师批阅意见：
5
实验 4 蒽酮比色法测定酵母菌中海藻糖含量
教师签名 日期
6
沸水浴、冰水浴、53WB 分光光度仪器
↓ 称量 30mg 干酵母
↓ 加入 3mlTCAaq
↓ 离心，取上清液稀释 40 倍
↓ 配制蒽酮溶液
↓
1
实验 4 蒽酮比色法测定酵母菌中海藻糖含量
取 5 支编号试管，加如下溶液
↓ 表一、溶液配制组成
编号
1
2
3
4
葡萄糖/ml
0
0.3
2.1 酵母菌中海藻糖→TCAaq
2.2 海藻糖→葡萄糖→糖醛
2.3 糖醛+蒽酮→蓝绿色复合物→分光光度计测量
3. 试剂与仪器
1） 化学试剂
2g/L 蒽酮试剂：称取 0.10g 蒽酮溶于 50ml80%（体积分数）H2SO4 中，0.1g/L 标准葡萄 糖溶液，5g/L 三氯乙酸水溶液（TCA）。
2） 测量仪器
实验 4 蒽酮比色法测定酵母菌中海藻糖含量
化工专业实验报告
第一部分：实验预习
实验名称
蒽酮比色法测定酵母菌中海藻糖含量
一、实验预习
1. 实验目的
1.1 培养安全意识，注意安全；
1.2 掌握用三氯乙酸（TCA）抽提法提取酵母菌中海藻糖的方法；
1.3 掌握用蒽酮比色法测定海藻糖含量的原理和方法。
2. 实验原理
0.6
0.9
蒸馏水/ml
2
1.7
1.4
1.1
蒽酮/ml
8
8
8
8
总计/ml
10
10
10
10
↓ 立即放入冷水中，冷却后拿出混匀，在放入冷水中
↓ 打开试管盖，擦净外壁与试管盖的液体
↓ 沸水浴 6min，观察现象
↓ 放入自来水中冷却
↓ 测量吸光度，处理数据
↓ 整理好实验台 5. 注意事项 注意实验的人身安全与仪器安全
四、自评
这次实验在张老师的带领下收获颇多。首先在实验中老师反复强调了安全的重要性，这
让我加强了自己的安全意识。在实验流程的书写、数据处理的规范上老师也让我了解了正确
的做法，这些均对于我以后的科研生活有着很大的帮助，希望能够在以后的实验中越做越好。
五、参考文献
[1]王保国，化工过程综合实验（第 2 版），清华大学出版社，北京，2009 年 10 月。