植物抗病基因工程的基本原理与方法
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
目的形状突变株
构建核DNA文库
用转座子序列作 探针进行杂交
ຫໍສະໝຸດ Baidu
野生型 细胞核 DNA
构建 核DNA
文库
cDNA差式显示
分析转座子两侧序 列并以此作探针
2021/3/11
完整的目的 性状基因
转座子标签法流程图
8
2.2 表达载体的构建
◆ 目的基因分离后，往往需要经过修饰才能应用于 植物基因工程。构建植物表达载体就是在目的基因的5’ 端加上启动子，在基因的3’端加上中止子，以便使外源 基因能在植物中有效地表达，充分发挥其功能。
◆ 美国孟山都（Monsanto）公司将真菌编码葡萄糖氧化 酶基因导入马铃薯中，获得了对Ecc引起的细菌性软腐病具 有良好抗性的植株。
2021/3/11
3
1.3 导入降解病原物致病因子基因
◆ H. Anzai(1989),et al.分离到了抗烟毒素（tabtoxin） 的基因ttr，将基因ttr与CaMV 35S启动子融合成嵌合基 因，通过农杆菌介导的转化法转入烟草，获得ttr高表达 量的转基因植株，对烟毒素和病原菌的侵染均表现出良 好的抗性。
◆ 黄大年,等(1997)将cecropinB和cecropinD基因导入 水稻幼胚，获得的转基因水稻植株可明显地提高对水稻 白叶枯病的抗性，同时也获得了高抗水稻条斑病和水稻 白叶枯病的高抗品系。
2021/3/11
5
2 植物抗病基因工程的技术环节
◆ 至今已分离的供植物基因工程应用的目的
基因有100多个，其中研究得比较多的是抗病毒、 细菌和真菌的基因，能杀死害虫或使害虫拒食的 基因，能抵抗各种除草剂的基因，能抗逆境如干 旱、高寒、高温盐碱等的基因，能提高植物体中 蛋白质含量或蛋白质品质的基因等等。这些基因 中有些是来自植物本身，有些来自微生物，还有 少数是人工合成的。
◆ Broglie(1991),et al. 在克隆菜豆几丁质基因的基础上将 CH5B基因修饰改造，通过Ti质粒转化烟草，获得几丁质酶 高效表达的转基因植株，具有协同拮抗枯萎病菌的效果。
◆ M.J.Carmona(1993),et al.，将来源于大麦基因组克隆 的硫素基因和来源于小麦cDNA克隆的硫素基因转化到烟草 中，获得了对P.s.pv.tabaci具有较高抗性的植株。
2021/3/11
6
2.1 目的基因的分离和鉴定
◆ 对已知序列进行分子克隆
◆ 从蛋白质到基因序列
PCR扩增 构建cDNA文库 构建基因组文库
◆ 与已知基因紧密连锁基因的分离
2021/3/11
7
◆ 根据植株或细胞表型变异进行基因分离
转座子标签法 图位克隆法 基因挽救技术 基因组相减法
转座子导入细胞
在植物抗性基因的利用方面
◆ 根据已有的R基因结构特征，设计新的R基因。
◆ 异源表达R基因。
◆ 向同一株植物中导入多个R基因。
在病原菌无毒基因的利用方面
◇ 转病原菌无毒基因。
◇ 将病原菌无毒基因和相应的R基因一起导入植物。
◇ 导入与植物抗病信号有关的基因。
2021/3/11
2
1.2 导入植物防卫基因
加入启动子区
目前植物基因工程中外源基因常选用的启动子主要
有3类：第一类是从Ti质粒的T-DNA序列上分离的启动
区。具有真核生物转基因起始所需的TATA盒和CAT盒；
第二类是CaMV的35S和19S启动子；第三类是从植物
本身分离出来的启动子。
2021/3/11
9
加入转录的加尾序列
真核生物为保证一个结构基因表达完全末端需要有 一个加尾序列。其功能一方面保证转录的终止；另一 方面保证形成有活性的mRNA链。植物基因工程中常 用的加尾序列是AATAAA。
加入增强序列
2021/3/11
11
加入与植物中特定DNA同源的序列 为了实现将目的基因和植物基因组有效整合，植物基因
工程中常在目的基因两端接上能和植物特定基因能整合的 DNA序列，一方面可以提高外源基因的插入效率；另一方 面也可以结合植物基因组表达调控规律，通过调整所加同 源序列的碱基序列有效地控制外源基因的插入位点和表达 时间，使目的基因更便于操作以及整合后更好地发挥作用。
插入内含子
内含子是真核生物基因组结构的特点之一。在基因
工程中，多数不用在目的基因中插入这种片段就能得到
有效的表达，因此，认为它是基因产物功能非必需的。
但是在实际操作中，如果在目的基因适当的位置插入这
种序列，其表达量可以提高几十到几百倍。因此，有人
推测，内含子可能在基因翻译中起增强子的作用。
2021/3/11
2021/3/11
4
1.4 导入其它蛋白基因
◆ 贾士荣,等(1993)和M.Hassan (1993),et al.向马铃薯 导入cecropin基因后提高了马铃薯对青枯病的抗性。
◆ J.M.Jaynes(1993),et al.将cecropinB基因导入烟草 后获得的转基因植株，提高了其对R.solanacearum引起 病害的抗性。
10
加入翻译起始密码子
由于植物中mRNA的翻译起始密码子多数也是AUG， 因此，要在目的基因功能蛋白的编码序列前加上适当的 核苷酸序列。
加入终止密码子 植物基因工程中所使用的mRNA翻译终止密码子有
UAA、UAG、UGA三种。一般在目的基因功能蛋白的 编码序列后直接加上对应的碱基序列。实验中通常采用 的是Ti质粒中的Nos终止子。
►自1986年3月以后，我国已研究的转基因作物47类，涉及的转基因
103种。正式公布的转基因作物：棉花、大豆、西红柿、青椒和矮牵牛。
►目前，已经商品化的转基因作物所转入的外源基因主要是抗性基
因，只有少数是改良作物品种性状的。
2021/3/11
1
1 植物抗病基因工程策略
1.1 导入植物抗病相关基因和病原菌致病相关基因
第六章 植物抗病基因工程的基本 原理与方法
植物抗病基因工程是通过分子生物学技术获得对植物病害 （病毒、细菌、真菌、线虫等病害）具有一定抗性的转基因 植株。
► 1983年首例转基因烟草问世。
► 1994年首批转基因作物如延熟西红柿和抗除草剂棉花等获得批准
进行商品化生产。目前，国内外已报道的转基因作物有1 6种70多个品系。
◆ 菜豆毒素（phaseolotoxin）是一种非寄主专化性毒
素，产菜豆毒素的P.s.pv.phaseolicola菌株通过argK基因
合成一种不被菜豆毒素抑制的OCTaseR酶，从而对该毒
素不敏感。将argK基因导入烟草和菜豆，获得的转基因
烟草和菜豆对P.s.pv.phaseolicola有较高的抗性。
构建核DNA文库
用转座子序列作 探针进行杂交
ຫໍສະໝຸດ Baidu
野生型 细胞核 DNA
构建 核DNA
文库
cDNA差式显示
分析转座子两侧序 列并以此作探针
2021/3/11
完整的目的 性状基因
转座子标签法流程图
8
2.2 表达载体的构建
◆ 目的基因分离后，往往需要经过修饰才能应用于 植物基因工程。构建植物表达载体就是在目的基因的5’ 端加上启动子，在基因的3’端加上中止子，以便使外源 基因能在植物中有效地表达，充分发挥其功能。
◆ 美国孟山都（Monsanto）公司将真菌编码葡萄糖氧化 酶基因导入马铃薯中，获得了对Ecc引起的细菌性软腐病具 有良好抗性的植株。
2021/3/11
3
1.3 导入降解病原物致病因子基因
◆ H. Anzai(1989),et al.分离到了抗烟毒素（tabtoxin） 的基因ttr，将基因ttr与CaMV 35S启动子融合成嵌合基 因，通过农杆菌介导的转化法转入烟草，获得ttr高表达 量的转基因植株，对烟毒素和病原菌的侵染均表现出良 好的抗性。
◆ 黄大年,等(1997)将cecropinB和cecropinD基因导入 水稻幼胚，获得的转基因水稻植株可明显地提高对水稻 白叶枯病的抗性，同时也获得了高抗水稻条斑病和水稻 白叶枯病的高抗品系。
2021/3/11
5
2 植物抗病基因工程的技术环节
◆ 至今已分离的供植物基因工程应用的目的
基因有100多个，其中研究得比较多的是抗病毒、 细菌和真菌的基因，能杀死害虫或使害虫拒食的 基因，能抵抗各种除草剂的基因，能抗逆境如干 旱、高寒、高温盐碱等的基因，能提高植物体中 蛋白质含量或蛋白质品质的基因等等。这些基因 中有些是来自植物本身，有些来自微生物，还有 少数是人工合成的。
◆ Broglie(1991),et al. 在克隆菜豆几丁质基因的基础上将 CH5B基因修饰改造，通过Ti质粒转化烟草，获得几丁质酶 高效表达的转基因植株，具有协同拮抗枯萎病菌的效果。
◆ M.J.Carmona(1993),et al.，将来源于大麦基因组克隆 的硫素基因和来源于小麦cDNA克隆的硫素基因转化到烟草 中，获得了对P.s.pv.tabaci具有较高抗性的植株。
2021/3/11
6
2.1 目的基因的分离和鉴定
◆ 对已知序列进行分子克隆
◆ 从蛋白质到基因序列
PCR扩增 构建cDNA文库 构建基因组文库
◆ 与已知基因紧密连锁基因的分离
2021/3/11
7
◆ 根据植株或细胞表型变异进行基因分离
转座子标签法 图位克隆法 基因挽救技术 基因组相减法
转座子导入细胞
在植物抗性基因的利用方面
◆ 根据已有的R基因结构特征，设计新的R基因。
◆ 异源表达R基因。
◆ 向同一株植物中导入多个R基因。
在病原菌无毒基因的利用方面
◇ 转病原菌无毒基因。
◇ 将病原菌无毒基因和相应的R基因一起导入植物。
◇ 导入与植物抗病信号有关的基因。
2021/3/11
2
1.2 导入植物防卫基因
加入启动子区
目前植物基因工程中外源基因常选用的启动子主要
有3类：第一类是从Ti质粒的T-DNA序列上分离的启动
区。具有真核生物转基因起始所需的TATA盒和CAT盒；
第二类是CaMV的35S和19S启动子；第三类是从植物
本身分离出来的启动子。
2021/3/11
9
加入转录的加尾序列
真核生物为保证一个结构基因表达完全末端需要有 一个加尾序列。其功能一方面保证转录的终止；另一 方面保证形成有活性的mRNA链。植物基因工程中常 用的加尾序列是AATAAA。
加入增强序列
2021/3/11
11
加入与植物中特定DNA同源的序列 为了实现将目的基因和植物基因组有效整合，植物基因
工程中常在目的基因两端接上能和植物特定基因能整合的 DNA序列，一方面可以提高外源基因的插入效率；另一方 面也可以结合植物基因组表达调控规律，通过调整所加同 源序列的碱基序列有效地控制外源基因的插入位点和表达 时间，使目的基因更便于操作以及整合后更好地发挥作用。
插入内含子
内含子是真核生物基因组结构的特点之一。在基因
工程中，多数不用在目的基因中插入这种片段就能得到
有效的表达，因此，认为它是基因产物功能非必需的。
但是在实际操作中，如果在目的基因适当的位置插入这
种序列，其表达量可以提高几十到几百倍。因此，有人
推测，内含子可能在基因翻译中起增强子的作用。
2021/3/11
2021/3/11
4
1.4 导入其它蛋白基因
◆ 贾士荣,等(1993)和M.Hassan (1993),et al.向马铃薯 导入cecropin基因后提高了马铃薯对青枯病的抗性。
◆ J.M.Jaynes(1993),et al.将cecropinB基因导入烟草 后获得的转基因植株，提高了其对R.solanacearum引起 病害的抗性。
10
加入翻译起始密码子
由于植物中mRNA的翻译起始密码子多数也是AUG， 因此，要在目的基因功能蛋白的编码序列前加上适当的 核苷酸序列。
加入终止密码子 植物基因工程中所使用的mRNA翻译终止密码子有
UAA、UAG、UGA三种。一般在目的基因功能蛋白的 编码序列后直接加上对应的碱基序列。实验中通常采用 的是Ti质粒中的Nos终止子。
►自1986年3月以后，我国已研究的转基因作物47类，涉及的转基因
103种。正式公布的转基因作物：棉花、大豆、西红柿、青椒和矮牵牛。
►目前，已经商品化的转基因作物所转入的外源基因主要是抗性基
因，只有少数是改良作物品种性状的。
2021/3/11
1
1 植物抗病基因工程策略
1.1 导入植物抗病相关基因和病原菌致病相关基因
第六章 植物抗病基因工程的基本 原理与方法
植物抗病基因工程是通过分子生物学技术获得对植物病害 （病毒、细菌、真菌、线虫等病害）具有一定抗性的转基因 植株。
► 1983年首例转基因烟草问世。
► 1994年首批转基因作物如延熟西红柿和抗除草剂棉花等获得批准
进行商品化生产。目前，国内外已报道的转基因作物有1 6种70多个品系。
◆ 菜豆毒素（phaseolotoxin）是一种非寄主专化性毒
素，产菜豆毒素的P.s.pv.phaseolicola菌株通过argK基因
合成一种不被菜豆毒素抑制的OCTaseR酶，从而对该毒
素不敏感。将argK基因导入烟草和菜豆，获得的转基因
烟草和菜豆对P.s.pv.phaseolicola有较高的抗性。