离体胸主动脉环的作用及机制

杜仲乙醇提取物对大鼠离体胸主动脉环的作用及机制
岳晓洁1，，张炯炯1，许逸飞1 ，叶志孟1 ，张薇1，王会平2
（1.浙江大学医学院临床二系，浙江杭州 310031; 2.浙江大学医学院生理学教研室，浙江杭州 310031）
[摘要]：目的：探讨杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）醇提物对离体大鼠主动脉环收缩张力的作用及其可能机制。

方法：采用大鼠离体胸主动脉环灌流模型，采用累积加药法，观察杜仲醇提物对PE预收缩（苯肾上腺素组+E,-E）、氯化钾预收缩（氯化钾组+E,-E）的血管环的作用; 并检测杜仲对经无钙液预处理后的血管环的作用。

结果：不论是否有内皮，累计浓度杜仲对高浓度KCL及PE引起的血管环收缩均有明显的舒张作用。

格列苯脲（Glib），4－氨基吡啶(4－AP),四乙胺（TEA）,L-NAME,ODQ，吲哚（Indo）不能阻断杜仲对PE预收缩血管环的舒张。

胸主动脉环经无钙液孵育和杜仲处理后对PE的反应性降低。

结论：杜仲对胸主动脉环有非内皮依赖性的舒张作用，杜仲能通过抑制内钙释放而起到舒张血管环的作用。

[关键词]：杜仲乙醇提取物；胸主动脉环；内皮；钙通道
Relaxant effect of Eucommia ulmoides Oliv On rat thoracic aorta YUE Xiao-jie, ZHANG Jiong-jiong, XU Yi-fei, YE Zhi-men, ZHANG Wei ,et al
(The Second Department of Clinical Medicine, College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310031)
[Abstract] Objective: To investigate the effect of Eucommia ulmoides Oliv on vascular circles and the underlying mechanisms. Methods: The study was performed with the model of isolate rat thoracic aorta rings in organ bath.The effect of accumulated of ethanol extract of the eucommia bark(EB) on aorta rings (+E,-E), pre-contracted with PE, and pre-contracted with KCl was observed. The effect of EB on aorta rings(-E) pre-contracted with PE(-E) with Ca2+ -free medium was also observed. Conclusion:With or without endothelium, communicative concentration EB has vasorelaxant effects on the thoracic aorta pre-contracted by KCL or PE. nitric oxide synthase inhibitor L-N (G)-nitroarginine methyl ester ( L-NAME), the Soluble guanylyl cyclase Inhibitor ODQ, voltage-dependent K+ channel inhibitor 4-AP, calcium-activated K+ channel inhibitor TEA, ATP-sensitive K+ channel inhibitor Glib, and cyclooxygenase inhibitor indomethacin can’t inhibit EB’s vasorelaxant effects. EB has no relaxation effect on aorta rings which are incubated with Ca2+ -free Kreb’s solution and pre-contracted with PE. Conclusion: EB can relax the rat thoracic aorta rings endothelium independent. And one mechanism is by inhibiting of intracellular calcium ions release .
[Key words] :ethanol extract of the eucommia bark；The ring of thoracic aorta；endothelium；Ca2+ channel
杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）是杜仲科植物，我国特有经济树种。

杜仲皮是传统中药，具有补肝肾，强筋骨，安胎，益寿和降血压的作用。

甚至在抗HIV方面,心血管方面，免疫系统，抗衰老，骨细胞增殖，抗肿瘤作用都有发现，在临床上已应用复方杜仲降压片治疗高血压病[1-2]。

然而关于杜仲对离体血管作用的研究尚处在初始阶段，并没有大家公认的确切作用及机制的报道。

因此，本实验在大鼠离体胸主动脉环灌流模型的基础上，研究杜仲醇提掖对血管张力的影响并探讨其可能的作用机制。

1．材料和方法
1.1 设备：
离体血管环灌流装置：HSS-1B数字式超级恒温浴槽，J2J01型张力换能器； RM6240BD
型多道生理信号采集处理系统，均由成都仪器厂提供。

1.2 药物与试剂：
苯肾上腺素（Phenylephrine, PE）、乙酰胆碱（Acetylcholine, ACh）、
L-NAME（L-N (G)-nitroarginine methyl ester）、吲哚美辛（Indomethacin，Indo）、4-氨基吡啶（4-aminopyridine,4-AP）、四乙胺（Tetraethylammonium, TEA）、格列苯脲（Glibenclamide）、ODQ（1H-(1,2,4)oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one）、 EGTA（ethylene glycol-bis [ β-aminoethyl ether ]-N , N , N ’N ’-tetraacetic acid)、DMSO（dimethyl sulfoxide）、4% DMSO、均购自美国Sigma公司产品。

初浓度为20mg/ml的杜仲醇提液。

Krebs-Henseleit (K-H)液(mmol/L):NaCl 118，KCl 4.7，KH2PO 4 1.2，MgSO4 1.2，NaHCO3 25，CaCl2 1.25，glucose 10，无钙Krebs-Henseleit液(mmol/L)：NaCl 118，KCl 4.7，KH2PO 4 1.2，MgSO4 1.2，NaHCO3 25，glucose 10，EGTA 0.05。

1.3血管环的制备：
Sprague-Dawley (SD) 大鼠, 雄性, 体重220-270g, 由浙江大学实验动物中心提供。

每只大鼠的胸主动脉被分成6段,并随机分入不同的6个实验组中进行平行研究,以保证不同组内的血管环均来自不同的大鼠。

用钝器击昏大鼠后，充分放血, 迅速取胸主动脉, 置于通以95% O2+5% CO2 混合气体的K-H液中, 去除周围结缔组织后将血管剪成约3～4 mm 宽的血管环, 避免过度牵拉, 以防损伤内皮。

根据实验需要, 去除血管内皮时, 用棉签磨擦血管环内表面以去除内皮细胞。

将血管环放入含K-H液的浴槽内, 持续通以95% O2+5% CO2的混合气体, 将静息张力调至2.0 g 在37 ℃下稳定1 h , 期间每15 min 换液一次。

用6×10-2mol/L的KCl重复刺激3 次, 以诱发血管的最大收缩幅度。

待血管环稳定后, 用10-6mol/L PE 收缩血管环达峰值, 加入10-6mol/L ACh 检验血管内皮完整性。

舒张60-90%为内皮完整，20%以下为去内皮。

实验用RM6240BD型多道生理信号采集处理系统记录血管张力变化，分别以末次PE(1μmol/L)、KCl（6×10-2mol/L）诱发最大收缩幅度为100%,以加入药物后的血管张力幅度与PE
或KCl诱发最大收缩幅度之间的比率反映血管张力的变化。

1.4实验分组：
1.4.1 累积浓度杜仲对PE预收缩的血管环的作用: 实验组(n= 9)以PE ( 1 μmol/ L )预收缩内皮完整血管环，用累积加药法,每10min 加杜仲1 次, 使灌流液中杜仲终浓度分别达0.2、0.4、0.8、1.6、
2.4、
3.2 (mg/ml),观察杜仲对内皮完整血管环的作用; 对照组(n= 4) 以K-H 液代替杜仲累积加入。

为了考虑内皮的作用，再加上一组去内皮组(n=12)，观察杜仲对去内皮血管环的作用。

1.4.2 累积浓度杜仲对KCl预收缩的血管环的作用:用KCl（6×10-2mol/L）代替PE ( 1 μmol/ L )预收缩内皮完整血管环，具体方法同1.4.1，其中内皮完整组n=6,去内皮组n=2。

实验设计中没有做K-H液代替杜仲累积加入的对照组。

1.4.3 杜仲对无钙液预处理的血管环的作用(无钙液组):实验组(n= 4) 以无钙液预处理
内皮去除的血管环, 用3.2mg/ml 杜仲共浴15min 后, 再加入PE ( 1 μmol/ L )使血管收缩, 观察杜仲的作用。

对照组(n= 4) 以K-H 液代替杜仲孵浴去内皮血管环。

1.4.4 Indo、L-NAME、ODQ 对杜仲作用影响组(n =6):分别用0.01mmol/L Indo、L-NAME、ODQ预处理内皮完整的主动脉环20 min,用PE ( 1 μmol/ L ) 预收缩血管达稳态后, 采用累积加药法，同1.4.1加药方法。

观察杜仲对内皮完整血管环的作用。

以1.4.1中杜仲对PE预收
缩内皮完整血管环的作用为对照。

1.4.5 4-AP,TEA,Glib对杜仲作用影响组。

实验组(n=6)分别用1mmol/L 4-AP；1mmol/L TEA; 3μmol/L Glib代替0.01mmol/L Indo，其中4-AP,TEA累计加药浓度为0.2、0.4、0.8、1.6、
2.4、
3.2、
4.0 (mg/ml)。

其余同1.4.4。

1.5 统计处理：
实验结果以⎯x±s表示，用excel做统计，两组间比较采用t检验，P<0.05认为有显著性差异。

2. 结果
2.1 累积浓度杜仲对PE预收缩的血管环的作用：
杜仲（0.2，0.4，0.8，1.6，3.2mg/ml）可使PE预收缩的内皮完整胸主动脉环舒张，比PE预收缩时的张力明显降低（P<0.05）,而对照组，累积加入K-H液对内皮完整胸主动脉环舒张作用不明显，累计浓度杜仲亦可使去内皮的胸主动脉环舒张（P<0.05）（图一）。

图一累计浓度杜仲对PE预收缩胸主动脉环的作用
Fig.1. Effect of cumulated EB(0.2,0.4,0.8,1.6,3.2mg/ml) on the tension of PE(10-4M) pre-constricted endothelium-intact or endothelium-denuded thoracic aorta.(P<0.05) 2.2杜仲对高钾预处理之后收缩的血管的作用
为观察杜仲是否对KCL诱导的血管收缩作用有影响，用KCL（6×10-2mol/L）预收缩血管，结果表明，杜仲对KCL（6×10-2mol/L）预收缩的内皮完整或去内皮动脉环都有明显的舒张作用，且两者无显著性差异（P>0.05） (图二)
图二累计浓度杜仲对KCL预收缩内皮完整或去内皮胸主动脉环的作用
Fig.2.Effect of cumulated EB(0.2,0.4,0.8,1.6,3.2mg/ml) on the tension of KCL(6×10-2mol/L) pre-constricted thoracic aorta endothetium-independent.(P>0.05)
2.3杜仲对无钙液预处理的血管环的作用
用无钙液预处理去内皮血管环，去除细胞外钙离子内流的影响后，与对照组比较，
3.2mg/ml的杜仲对PE引起的血管环收缩作用有明显抑制 (P<0．01)（图三）。

图三 杜仲对无钙液预处理的血管环的作用
Fig.3. Effect of EB(3.2mmol/L) on aorta rings, incubated with Ca2+ -free K-H solution.
2.4Indo，L-NAME，ODQ对杜仲作用影响
环氧合酶抑制剂Indo(10µmol／L)预处理后，杜仲使PE预收缩的内皮完整血管产生的舒张作用未被减弱。

与正常对照组血管相比，舒张作用反而加强，但无显著性差异（P<0.05）。

一氧化氮合酶抑制剂L-NAME与鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ不能阻断累积浓度杜仲对PE预收缩的内皮完整的胸主动脉环的舒张作用，且都无显著性差异（P>0.05）（图四）
图四 ODQ，L-NAME，吲哚美辛(Indo，10µmol／L)预处理对杜仲血管环舒张效应的影响
Fig.4.Effect of pretreatment with 0.01mmol/L Indo、L-NAME、ODQ on the action of eucommia bark (EB，3.2mg／m1)in the endothelium-intact aorta
rings．Values are expressed as mean±SD P>0．O5,compared with the value
in absence of Indo、L-NAME、ODQ.
2.5 Gli、4-AP、TEA对杜仲作用的影响
KATP抑制剂Gli(3µmol／L)预处理后，杜仲对PE预收缩的血管环的舒张作用未减弱，与对照组相比，舒张作用无明显变化(P>0.05)。

电压门控的K通道抑制剂4-AP(1mmol／L), 钙敏感钾通道阻断剂TEA(1mmol／L)预处理后，杜仲使PE预收缩的内皮完整血管产生的舒张作用,与正常对照组血管相比，反而加强，但无显著性差异(P>0.05)。

（图五）
图五 TEA（1mmol／L)、4-AP（1mmol／L)、Glib（3µmol／L)预处理对杜仲血管环舒张效应的影响
Fig.4. Effect of pretreatment with Glib(3µmol／L), 4-AP(1mmol／L)and TEA(1mmol／L)on the action of eucommia bark (EB，3.2mg／m1)in the
endothelium-intact aorta rings．Values are expressed as mean±SD
P>0．O5,compared with the value in absence of Glib、4-AP、TEA..
3.讨论：
日本学者Chiu-Yin Kwan等人之前已做过相关研究，表明杜仲叶和皮的水提物具有内皮依赖性的舒张作用，NO途径及内皮上的K通道的活化可能参与其舒张作用，而不涉及血管内皮的M胆碱受体，且杜仲叶的甲醇提取物无血管舒张作用[3]。

本实验研究结果表明，杜仲皮的乙醇提取物使PE和KCL预收缩的大鼠动脉环舒张，且呈浓度依赖性。

研究表明，内皮细胞通过释放的血管舒张物质在调节血管平滑肌的张力中起重要的作用[4.5]。

从内皮细胞中释放的最重要的一种物质是内皮依赖性舒张因子(EDRF)，现在被确认为是NO[4.6]，NO在维持血管静息张力中起重要作用，作为一种内皮源性舒张因子，其舒血管机制现已阐明。

NO在内皮细胞中合成后，通过激活可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)，引起环磷酸鸟苷(cGMP)升高，从而产生舒血管作用[7]。

后者主要通过cGMP依赖性蛋白激酶使钙内流减少，增加钙ATP酶对钙的摄取或直接作用于收缩蛋白去磷酸化而使血管舒张。

细胞因子通过激活NO合酶而促进NO合成，可产生多种生物效应，包括改变血管的反应性和降低血压等。

为了研究杜仲的血管舒张作用是否是内皮依赖性的，我们用NO合酶抑制剂L-NAME和鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ处理血管，发现杜仲的舒张血管作用未被阻断，提示NO途径可能未参加杜仲的舒张血管作用。

由花生四烯酸在环氧合酶催化下产生的PGI2也是重要的内皮依赖性舒张因子，为了验证该途径是否参与杜仲的舒血管作用，我们用环氧合酶抑制剂吲哚美辛处理血管，发现杜仲的舒张血管作用亦未被阻断，提示PGI2亦未参加杜仲的舒血管作用。

血管平滑肌的舒张与钾离子通道有关，本试验欲研究钾通道是否参与杜仲的舒血管作用及具体为哪一通道，故分别采用ATP依赖性钾通道抑制剂格列苯脲（Glib），电压门控钾通道抑制剂4－氨基吡啶(4－AP),配体门控钾通道抑制剂四乙胺（TEA）处理血管，均未引起杜仲舒血管作用的变化，说明各种钾通道未参与杜仲的舒血管作用。

既往研究认为，血管平滑肌的收缩主要是依赖细胞外钙离子的内流(包括受体操作性钙通道，电压依赖性钙通道以及钙释放激活的钙通道)和细胞内钙离子的释放(通过肌醇1，4，
5一三磷酸受体及rya-nodine受体途径)而使细胞内钙离子浓度的增加。

KCl通过平滑肌细胞超极化而刺激血管收缩，其机制主要是使电压依赖性钙通道开放,为此我们推测杜仲可能通过抑制外钙内流而具有血管舒张作用，为了确定杜仲是否因阻断外钙内流引起的内钙释放而舒张血管，尚需阻断内钙进一步研究。

PE诱导的血管收缩是由a-肾上腺素受体的激活造成的，主要是通过激活磷脂酶C，产生甘油二酯(diacylglycerol，DG)和三磷酸肌醇(1，4，
5-triphos-phate inositol，IP3)，DG 可以通过蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)激活肌凝蛋白轻链，而IP3则可以诱导肌浆网内的钙离子释放[8.9]，这是否提示杜仲舒张血管作用的机制，可能是通过影响内贮钙的释放产生舒张作用。

为了进一步证明，我们又用无钙液预处理去内皮血管环，发现动脉环经无钙液孵育及杜仲处理后，血管对PE的反应性明显降低，表明杜仲可能通过阻断内钙释放起血管舒张作用。

综上所述，杜仲乙醇提取物的舒血管作用是非内皮依赖性的，其可能的机制是抑制内钙释放。

实验结果显示，各种抑制剂处理后，杜仲的血管舒张作用未减弱，有些甚至加强，可能与杜仲种植方法，提取工艺，及实验操作有关，具体原因有待进一步研究。

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