分光光度法测叶绿素 文档

分光光度法测定叶绿素含量

作者：未知来源：郑州轻工业学院时间：2006-9-22

一、实验目的

1.了解植物组织中叶绿素的分布及性质。

2.掌握测定叶绿素含量的原理和方法。

二、实验原理

叶绿素广泛存在于果蔬等绿色植物组织中，并在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体。当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光、热较敏感；在酸性条件下叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和甲醇。高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a 和b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。

叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有：

1.原子吸收光谱法：通过测定镁元素的含量，进而间接计算叶绿素的含量。

2.分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯—比尔定律计算出提取液中各色素的含量。

叶绿素a 和叶绿素b 在645nm 和663nm 处有最大吸收，且两吸收曲线相交于652nm 处。因此测定

提取液在645nm、663nm、652nm 波长下的吸光值，并根据经验公式可分别计算出叶绿素a、叶绿素b

和总叶绿素的含量。

三、仪器、原料和试剂

仪器

分光光度计、电子顶载天平(感量0．01g)、研钵、棕色容量瓶、小漏斗、定量滤纸、吸水纸、擦境纸、滴管。

原料

新鲜(或烘干)的植物叶片

试剂

1. 96％乙醇(或80％丙酮)

2. 石英砂

3. 碳酸钙粉

四、操作步骤

取新鲜植物叶片(或其它绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，去除中脉剪碎。称取剪碎的新鲜样品2g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3mL95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10mL，继续研磨至组织变白。静置3～5min。

取滤纸1张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗，滤液流至100mL 棕色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至100mL，摇匀。

取叶绿体色素提取液在波长665nm、645nm 和652nm 下测定吸光度，以95％乙醇为空白对照。

五、计算

按照实验原理中提供的经验公式，分别计算植物材料中叶绿素a、b 和总叶绿素的含量

叶绿体色素的提取、分离、理化性质及含量测定

[ 实验原理]

植物叶绿体色素是吸收太阳光能，进行光合作用的重要物质。它一般由叶绿素a 、叶绿素b 、胡萝卜素和叶黄素组成。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。

色素分离的方法有多种，纸层析是最简便的一种。当溶剂（有机推动剂）不断从纸上流过时，由于混合物（叶绿素提取液）中各种成分在固定相（滤纸纤维素所吸附的水分）和流动相（有机推动剂）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。

叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。

叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被氢离子所取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。

根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度D 与其中溶液浓度C 和液层厚度L 成正比，即：D ＝KCL

D ：吸光度，即吸收光的量，C ：溶液浓度,

K ：为比吸收系数（吸光系数），L ：液层厚度，通常为1cm.

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素 a 、b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度 D ，并根据叶绿素 a 、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。

叶绿素a 、b 的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于红光区和蓝紫光区，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

已知叶绿素a 、b 的80 ％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm 和645nm ，又知在波长663nm 下，叶绿素 a 、b 在该溶液中的吸光系数分别为82.04 和9.27 ，在波长645nm 下分别为16.75 和45.60 ，可根据加和性原则列出以下关系式：

D 663 ＝82.04Ca ＋9.27Cb(1)

D 645 ＝16.75Ca ＋45.60Cb （2 ）

式（ 1 ）、（ 2 ）中的 D 663 和 D 645 为叶绿素溶液在波长663nm 和645nm 时的吸光度，Ca 、Cb 分别为叶绿素a 和b 的浓度，以mg ／L 为单位。

解方程组（ 1 ）、（ 2 ），得：

Ca=12.7D 663 – 2.69 D 645 （3 ）

Cb=22.9 D 645 – 4.68D 663 （4 ）

将Ca 与Cb 相加即得叶绿素总量Ct ：

Ct=Ca+Cb=20.2 D 645 +8.02 D 663 （5 ）

由于叶绿素a 、b 在652nm 的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为34.5 ），也可以在此波长下测定一次吸光度（ D 652 ）而求出叶绿素 a 、 b 总量：

Ct= Ca+b=D 652 × 1000/34.5 （6 ）

丙酮提取液中类胡萝卜素的含量：Ck=4.7D 440 - 0.27Ca+b

由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。

[ 实验材料]

新鲜植物叶片。

[ 仪器设备]

研钵，漏斗，滴管，大试管（带胶塞），大头针，滤纸，天平，量筒，毛细管。

试管，试管架，烧杯，酒精灯，玻棒，铁三角架，刻度吸量管，火柴，

分光光度计，容量瓶，定量滤纸。

[ 药品试剂]

95 ％乙醇、80 ％丙酮、石英砂、碳酸钙粉、醋酸铜粉末

推动剂：按石油醚：乙醚（ 4 ： 1 ）（V ／V ）。

KOH- 甲醇溶液：30gKOH 溶入100mL 甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。

[ 实验步骤]