基因工程复习资料

基因工程复习资料

生物技术在制药行业的应用：基因工程制药、细胞工程制药、酶工程制药、发酵工程制药。

基因工程：基因工程是在分子水平上进行的遗传操作，是指将一种或多种生物体的基因分离出来或人工合成基因，按照人们的愿望，进行严密的设计和体外加工重组，转移到另一种生物体的细胞内，使之能在受体细胞中遗传表达并获得新的遗传性状而形成新的生物类型的生物技术。（又称遗传工程）

基因工程流程：分、切、接、转、筛、表。

基因工程的四大要素(或基本条件)：目的基因、载体、工具酶、受体。

基因工程的突出特点：打破物种间基因交流的界限。

连接酶：T4连接酶(辅助因子为ATP，高等生物，实验采用)和大肠杆菌连接酶(辅助因子为NAD+，低等生物)。

基因工程诞生的理论基础：证明生物的遗传物质是DNA（20世纪40年代）、明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制机制（20世纪50年代）、明确了遗传信息的传递方式（20世纪60年代）。

基因工程诞生的技术突破：工具酶(限制性内切酶和DNA连接酶)的发现与应用（基因操作的剪刀，针线）、载体的发现（发现了运载工具）、逆转录酶的发现（便于真核生物基因的获取，因其常有内含子，不便于操作）。

基因工程诞生的元年：1973年的DNA体外重组和大肠杆菌转化实验。

基因工程制药：利用重组DNA技术，结合发酵工程、细胞工程、酶工程等现代生物技术研制预防和治疗人类、动物重大疾病的蛋白质药物、核酸药物，以及生物制品的一门技术。

工具酶：工具酶是指基因工程操作中所使用的核酸酶类。

核酸酶：核酸酶是指对核酸片段可以进行操作（核酸的扩增、核酸的切割、核酸的连接）的一类酶。

工具酶：限制性内切酶、连接酶、聚合酶、修饰酶。

胰蛋白酶：动物细胞消散需要胰蛋白酶。

限制性核酸内切酶的限制作用：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制；这是维护宿主遗传稳定的保护机制。

限制性核酸内切酶的修饰作用：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏；这是宿主细胞识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用

机制。

主要运用限制性核酸内切酶Ⅱ类：识别位点特定序列（回文对称序列）、切割位点位于识别位点上。

限制性核酸内切酶的命名：Haemophilus influenzae d流感嗜血杆菌d株、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ。

①限制性核酸内切酶第一个字母(大写，斜体)代表该酶的宿主菌属名(genus)第一个字母；第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)前两个字母。

②第四个字母代表宿主菌的菌株名的第一个字母(小写，正体)或染色体外成分(质粒或噬菌体，大写，正体)。

③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示(正体)。限制性核酸内切酶的特征：可识别特异性的序列；切割方式①在识别序列的对称轴的5’端切割，产生5’黏性末端，②在识别序列的对称轴的3’端切割，则产生3’黏性末端，③在识别序列的对称轴上切割，产生平头末端

回文结构大多数识别位点具有180度旋转对称的结构形式，即这些核苷酸对的顺序是回文结构。

同裂酶：同裂酶是指识别序列相同、切割方式相同或不同、来源不同的II限制性核酸内切酶。

同尾酶：同尾酶是指来源各异、识别序列不同，但产生相同的黏性末端的II限制性核酸内切酶。

影响限制性核酸内切酶活性与酶切效果的因素：

1).酶的纯度：要求不存在其他核酸内切酶或外切酶的污染。

2).DNA样品的纯度：DNA样品中的蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高NaCl等，都能抑制酶活性。样品中DNase会降解DNA，影响酶切。

3).酶切反应的温度、时间：多数II型限制酶最适反应温度是37℃，但Sma I为25℃或30℃，Sfi I为50℃，Taq I为65℃。反应温度过高或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。

4).DNA的甲基化程度：限制性核酸内切酶不能切割甲基化的核苷酸序列。大肠杆菌中的DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、Mbo I 等，但Bam HI、Bgl II、Sau3A I不受影响。

5).DNA分子的构型：限制性内切酶对不同构型DNA分子的酶切效果是不同的，例如超螺旋DNA酶解所需要的酶量，比线性DNA酶解所需要的酶量高许多，甚至可高达20倍。

6).反应缓冲液：主要成分：p H (Tris-HCl)、离子强度(Na Cl)、Mg2+；辅助成分：β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)防止酶氧化；牛血清蛋白(BSA)组分V对于某些酶是必需的，可防止酶在低浓度蛋白质溶液中变性。

7).星号活性：是指在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列的特性。例如Eco RI在高pH(＞8)、低盐(50mmol/L)和高浓度甘油(＞5％)存在的情况下，其识别序列由GAATTC 改变为NAATTN。以Eco RI表示其星号活性。常发生星活性的内切酶有：Eco RI、HindⅢ、Kpn I、Pst I、Sal I、Hinf I等。

DNA连接酶：DNA连接酶是指能催化双链DNA分子内或分子间的5’-磷酸基和3’-羟基生成磷酸二酯键而使DNA链连接的一类酶。

DNA连接酶平末端DNA片段的连接：a).直接用T4 DNA连接酶连接：效率不高，较少采用。b).同聚物加尾连接平末端DNA片段：先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA连接酶进行连接。c).用衔接物连接平末端DNA分子：目的是在平末端分子上构建限制性核酸内切酶酶切位点，经酶切后产生特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNA连接。

衔接物：指用化学方法合成的一段由若干个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。

影响DNA连接酶在连接反应的因素：

1).DNA的浓度：连接产物的分子构型(线形或环状)与DNA浓度及DNA分子长度存在密切关系。在一定浓度下，小分子DNA片段进行分子内连接，有利于形成环化分子。对于长度一定的DNA分子，其浓度增加有利于分子间连接。此外，分子间连接还与两种片段的末端浓度的比例有关。原则上一种片段的浓度大于另一一种片段的浓，如：在克隆中，插入片段:载体片段=2:1。

2).反应温度：连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下，然而保持连接酶活性的最佳反应温度却是37℃。但在该温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷，所以连接反应一般采用16℃过夜。