农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证
农杆菌感受态制备
版本一? 农杆菌感受态细胞的制备? ℃保存的E H A105于含50μg/m l链霉素平板划线，28℃培养。
? ℃振荡培养12-16h r。
? ℃220r p m振荡培养至O D600=。
??℃5000r p m离心5m i n，去上清。
??℃。
? .双元载体转化农杆菌E H A105? 取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。
再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml K a n a m y c i n的Y M平板上。
28℃培养到形成单菌落。
其中 YM 可以用LB 代替，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（（） DTT）替代。
版本二?普通农杆菌感受态制备与转化：?1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。
?2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于左右（4hr）。
?3. 5k rpm离心5分钟。
?4. 在10ml NaCl中悬浮细胞。
?5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。
?如不是马上使用，可以将之按200ul分装储存于-80℃待用。
?6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。
?7. 液氮中冷冻1分钟。
?8. 37℃水浴溶化细胞。
?9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。
?10. 离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。
?11. 涂板，28℃培养2-3天。
?版本三?农杆菌感受态细胞的制备?1.挑取少许农杆菌LBA4404，接种于5ml LB液体培养基 (含50mg/L STR)中，28℃、200r/mim培养过夜。
?2.取2ml培养物于LB液体培养基 (含50mg/L STR) 中继续培养，直至OD800 为左右。
农杆菌感受态细胞的制备
农杆菌感受态细胞的制备在科学的世界里，农杆菌这家伙可是个大明星，尤其是在植物基因工程中，简直就像是超级英雄一样的存在。
说到农杆菌，它是个很有趣的小家伙，特别是在我们想把新基因转移到植物里的时候，它的表现真是让人惊叹。
今天就来聊聊怎么准备感受态细胞，听起来有点高大上，其实就是让植物细胞准备好接受外来的基因，像小朋友期待新玩具一样，兴奋得不得了。
要准备的就是农杆菌的培养。
想象一下，咱们要给这些小家伙开个派对，当然要先让它们有个好环境。
选个合适的培养基，像是给它们铺一张舒适的床。
然后，温度、pH值、氧气这些条件也得一丝不苟，不能马虎。
温度太高，农杆菌可受不了，像人一样，热得直冒汗；温度太低，它们又会懒洋洋的，没精神。
要是培养基里的营养不够，嘿，那简直就是饿肚子的小朋友，没啥干劲。
就得让这些小家伙进入生长期，哈哈，听起来像在养宠物。
等它们长到合适的密度，咱们就准备好收割成果啦。
这时候，得小心翼翼地把它们从培养基里取出来，别把它们给弄伤了，像捧着刚出生的小宝宝一样。
取出的细胞要经过洗涤，洗去多余的培养基，确保它们干净得像新洗的衣服。
用生理盐水轻轻地重悬这些细胞，调成合适的浓度，让它们准备好迎接“客人”。
这里有个小窍门，嘿嘿，增加细胞的感受性。
可以用一些特殊的化合物，比如PEG，这玩意儿就像催化剂，能帮助细胞更好地接受外来的DNA。
想象一下，像是给小朋友加了点魔法，立马变得更加活泼，更有好奇心。
然后，得把想要转移的DNA和这些感受态细胞混合。
这个过程就像搭积木，得小心翼翼，别让它们散架。
把这个混合物在特定的条件下静置一段时间，让细胞慢慢适应，就像在等待一场盛大的聚会。
期间，要保持适宜的温度和环境，让它们尽情享受这个过程。
就要进行转化了。
这一步就像是给这些细胞送去了新玩具，兴奋得不得了。
把细胞和DNA一起放到农杆菌中，轻轻搅拌，别太猛，怕把小家伙们给搅晕了。
静置一段时间后，它们就会开始接受这些新基因，像在参加一场欢迎会一样。
感受态细胞的制备的实验步骤
感受态细胞的制备的实验步骤CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6（约2.5-3小时）；3．将菌液迅速置于冰上。
以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入1500μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟8．弃去上清，加入750μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．4℃下3000g冷冻离心5分钟10．加入20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11．立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。
农杆菌感受态制备
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版本一 1.1 农杆菌感受态细胞的制备 1.1.1. 取-70℃保存的 EHA105 于含 50μg/ml 链霉素平板划线，28℃培养。 1.1.2. 挑取单菌落接种于 5ml YM 液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养 12-16 hr。 1.1.3. 取 2ml 菌液转接于 100ml YM 液体培养基中，28℃220rpm 振荡培养至 OD600=0.5。 1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm 离心 5min,去上清液。 1.1.5. 加入 10ml 预冷的 0.1M 的 CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置 20min。4℃5000rpm 离心 5min，去上清。 1.1.6. 加入 4ml 预冷的含 15%甘油的 0.1M 的 CaCl2 溶液，轻轻悬浮。 1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌 Eppendorf 管中，每管 200μl 冻存于-70℃。 1.2. 双元载体转化农杆菌 EHA105 取 1μg 左右的质粒 DNA 加入到 200ml EHA105 感受态细胞中，混匀后，冰浴 30min，-70℃放 置 10min 。再在 37℃水浴 5min 或 42℃水浴 1min，接着冰浴 2min，加入 800mlYM 液体培养 基 28℃，175rpm 摇培 3hr 后涂在含 50μg/ml Kanamycin 的 YM 平板上。28℃培养到形成单 菌落。 其中 YM 可以用 LB 代替 ，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl（7.0） 0.01 DTT）替代。 版本二 普通农杆菌感受态制备与转化： 1. 挑单菌落于 2ml YEP 培养基（含 Rif20mg/ml）中 28℃过夜活化。 2. 取 2ml 过夜菌液接种于 50ml YEP 培养基中 28℃生长至 OD600 约等于 0.5 左右（4hr）。 3. 5k rpm 离心 5 分钟。 4. 在 10ml 0.15M NaCl 中悬浮细胞。 5. 5 krpm 离心 5 分钟，悬浮细胞于 20ml 冰预冷的 CaCl2。 如不是马上使用，可以将之按 200ul 分装储存于-80℃待用。 6. 加 1ug DNA 于 200ul 感受态细胞中，冰上放置 30 分钟。 7. 液氮中冷冻 1 分钟。 8. 37℃水浴溶化细胞。 9. 加 1ml YEP 培养基，28℃摇床培养 2-4hr（低速）。 10. 离心 1 分钟，悬浮细胞在 100ul YEP 培养基中。 11. 涂板，28℃培养 2-3 天。
农杆菌感受态细胞的制备和转化
Pei YX 实验室文档zengjieqiao 第七篇
农杆菌感受态细胞的制备
取-80℃保存的LBA4404于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。
挑取单菌落接种于5ml YEB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 h。
取2ml菌液转接于100ml YEB液体培养基中，28℃ 220rpm振荡培养至
=0.5。
OD
600
转入无菌离心管，4℃，5000rpm离心5min,去上清液。
溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。
加入30ml预冷的(0.05-0.1)M的CaCl
2
4℃ 5000rpm离心5min，去上清。
溶液，轻轻悬浮。
加入4ml预冷的含15%甘油的(0.05-0.1)M的CaCl
2
农杆菌悬浮液分装于无菌1.5 ml Eppendorf管中，每管200μl冻存于-80℃。
注意：(0.05-0.1)M的CaCl
溶液都可以，差别不是很大!
2
转化
分别向200μL根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中分别加入20 ng质粒DNA,轻轻混匀。
在冰浴中共放置30min。
置液氮中速冻5 min。
37℃热激5 min之后。
置冰上5 min,然后加入600μl YEB液体培养基。
于28℃、200 r/min培养4 h。
取100μL菌液均匀涂布于筛选培养基上,28℃放置36-48 h后可见抗性菌落长出。
阳性鉴定
挑去菌落过夜培养，进行菌液PCR！（注意做对照即：空的LBA4404也摇上，同时PCR）。
农杆菌感受态细胞的制备
农杆菌感受态细胞的制备（以GV3101菌株为例）：1.在新铺制的加有20 mg/L Gen（庆大霉素）、50 mg/L Rif的YEB固体培养基上，用接种环或灭菌牙签“平板划线法”通过分区划线稀释分离得到农杆菌GV3101菌株的单克隆菌落。
2.挑选一个单克隆菌落，接种到5 mL新鲜的加有20 mg/L Gen、50 mg/L Rif的YEB液体培养基中，置摇床上28℃振荡培养过夜。
3.将过夜摇浓的GV3101菌液按1: 100比例接种到50 mL新鲜YEB液体培养基中，置28℃摇床，200 r/min振荡培养至OD600为0.5左右，将菌液转移至50 mL离心管，冰浴30 min。
4.集菌：将菌液置于4℃预冷的离心机中离心，4,000 r/min，10 min。
5.重悬：弃上清，加入10 mL预冷的0.15 M NaCl溶液，在冰上旋转震荡将菌块悬起，4,000 r/min，4℃离心10 min。
6.重悬：弃上清，加入1 mL预冷的20 mM CaC12溶液，在冰上旋转震荡将菌块悬起，分装至预冷的1.5 mL无菌离心管中，液氮速冻后，-80℃保存备用。
农杆菌感受态细胞的转化（冻融法）：将农杆菌感受态细胞从-80℃取出后置冰上自然解冻，在超净台中用无菌枪头吸取2 μL质粒加入到感受态细胞中，轻轻吹打混匀后于冰上静置30 min，再经液氮速冻2 min，37℃水浴热激5 min，在超净台内加入900 μL YEB液体培养基，置28℃摇床100 r/min慢速震荡复苏培养4-6 h。
复苏后的菌液离心，弃去约800灿上清，余下上清将菌体重悬起，均匀涂布到抗性筛选YEB固体培养基上，培养平板倒置于280C恒温培养箱内避光培养36—48 h。
菌落PCR初步鉴定阳性克隆：用灭菌牙签蘸一点菌落作为模板材料将其溶解在PCR反应体系中，PCR程序中的预变性时间相应延长，使细菌细胞壁裂解释放出核质。
通过比较电泳条带的大小，初步确定是否为阳性克隆。
实验三农杆菌感受态细胞制备及转化
所以涂板后无单菌落出现，出现长满板的情况为抗生素失活。
农杆菌感受态的制备
A • 挑取农杆菌单菌落于液体培养基中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜活化
B
• 菌液按1:50的比例转接于50ml新鲜培养基中，振荡培养至OD600为0.4-0.6；
C
• 菌液转移至10 ml的离心管中，冰浴30 min
D
• 4℃，5 000 rpm离心5 min, 弃上清，收集菌体
农杆菌介导基因转化
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条 件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发 状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有 一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到 植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农 杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-
E
• 菌体重悬于4ml冰预冷的20 mM的CaCl2中，冰浴10-20 min
F
• 4℃，5 000 rpm离心5 min，弃上清 • 菌体重悬于1ml冰预冷的20 mM的CaCl2，分装100µ l/管，24 h内使用或液氮速冻 后-70 °C保存
G
感受态制备的要点：
OD600：0.4～0.6 OD值超过0.6必须重新活化 当OD达到0.3时，每隔20min测一次OD值。 分光光度计要测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态，有沉淀要 摇匀。注意比色杯的正确选择及使用 光电比色法定量测试原理：朗伯比尔定律：“当一束平行单色光垂直通过某一均 玻璃比色杯只适用于可见光区,在紫外区测定时要用石英比色杯。石英玻璃在紫 匀非散射的吸光物质时, 其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比”。 外线到红外线的整个光谱波段都有较好的透光性能，可见光透过率在９３％以 其中“吸收层厚度”就是实践中的比色杯厚度，如果测试中使用的比色杯不是同 上，特别是在紫外光谱区，最大透过率可达８０以上，而普通的玻璃在紫外光 一套，就无法保证其厚度一致，也就人为导致测试结果出现偏差。 谱区的透过率较差。一般，测定波长在350毫微米以上时，可以用玻璃比色杯；
农杆菌感受态细胞的制备与转化
实验五、农杆菌感受态细胞的制备与转化
01
实验目的：学习农杆菌感受态细胞的制备和转化原理。
02
实验要求：掌握农杆菌的特点及真核表达载体结构及应用。
03
技术应用：高等植物（双子叶植物或单子叶植物）转 基因鉴定基因功能 ，包括过表达（诱导型或组成型），RNAi等。
04
试剂： YEB液体培养基（液体和固体），Kan（卡那霉素），Rif（利福平）； CaCl2(预冷)；NaCl；50%无菌甘油 。
02
实验材料： 农杆菌GV3101菌株，重组双元表达载体pCAMBIA1300
01
农杆菌简介： 第一例转基因植物就是用农杆菌介导法完成的。
01
菌种：根癌农杆菌和发根农杆菌，二者均属革兰氏阴性菌，对双子叶植物侵染广泛，在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。
02
实验原理：
双元表达载体系统主要包括两个部分：
2.双元表达载体系统
双元表达载体
双元表达载体中Ti质粒pCAMBIA1300 的结构
1
2
3
4
5
农杆菌感受态细胞的制备流程
将10l构建好的质粒DNA加入200 l 农杆菌感受态细胞中，混匀；
01
冰浴30min，液氮迅速冷冻3-5min，37℃水浴无抗）YEB培养基，28℃振荡培养4h（选作）；
一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如NPTII基因以及Lac Z基因等。 双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。
农杆菌
1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。
1.1.2. 挑取单菌落接种于50ml YEB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。
1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml（含有抗生素） YEB液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。
1.1.4.（将菌液冰浴30min后）转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。
1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。
4℃5000rpm离心5min，去上清。
1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。
1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。
农杆菌感受态细胞的制备(l)将农杆菌接种于5一10mlYEB液体培养基中(Str 100mg/L)，28℃震荡过夜。
(2)取lml活化的菌液接种于50ml含有抗生素的YEB培养基中，同样条件下培养至OD600值为0.4一0.5左右。
(3)将菌液冰浴30min后，装至50ml离心管中。
(4)4℃，5000g离心10min，收集菌体。
(5)弃上清，用lml 20mmol/L的冰预冷CaCl2重悬沉淀，并加入0.5ml，80%的甘油，混匀。
(6)按每管200ul分装，液氮速冻后于一70℃保存。
冻融法转化土壤农杆菌(l)取1ug载体DNA加到200ul冰上溶化的感受态细胞中，轻混，冰浴30min。
(2)液氮中速冻5min，37℃水浴5min，再迅速冰浴2min。
(3)加入800ul YEB液体培养基，28℃轻摇4一6hr。
(4)取50一200ul菌液涂布于YEB选择平板上（含有相应的抗生素），28℃倒置培养2天。
1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。
农杆菌感受态的制备方法
农杆菌感受态细胞制备第一天晚至第三天晚： 1）取-80℃保存的GV3101于含50μg/ml 利福平的LB （千分之一的利福平）平板划线，28℃培养（一般要两天）。
注意：划线的时候要少沾一点原菌株，不必等到菌株融化就可轻轻沾一点，一定要少量，然后轻轻地划在板上。
挑得太多不容易长出单菌落，如果太用力也容易伤到菌株。
第三天下午或晚： 2) 挑取单菌落接种于灭菌的50ml 新管子加10ml 50μg/ml （千分之一）利福平的LB 液体培养基中，200rpm 28℃振荡培养12-16 hr （过夜可以）。
注意：管子最好用灭菌过的报纸包一下，摇菌时。
第四天早： 3) 取1-2ml （按1:50或者1:100的比例）菌液转接于含有50μg/ml （千分之一）利福平的100ml LB 液体培养基中（用500 ml 的三角瓶来摇菌28℃，200rpm 振荡培养至OD 600=0.5）。
注意：摇菌的过程可能需要3-4小时，要随时监控菌的浓度，可以平行的摇两瓶，其中一瓶用来测浓度，避免污染；并且为了保证检测菌液与未检测菌液的一致性，平行的两瓶菌液，最好来源于同一个50 ml 管子的菌液。
摇菌的过程中可以预先把NaCl 置于冰上预冷。
4) 转移菌液到新的灭过菌的50 ml 离心管中，冰上30min ； 5) 4℃，5000rpm 离心5min 。
6) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干，可以用预冷的NaCl 快速冲洗一遍。
7) 加入10ml 预冷的0.15M 的NaCl 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min 。
注意：要用5ml 枪调到3ml 挡，轻轻抽打。
8) 4℃，5000rpm 离心5min 。
9) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干。
10）加入2 ml 预冷的含15%甘油的20mM 的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。
注意：要用1ml 枪轻轻抽打。
11）按200ul 的量分装到1.5 ml 无菌Eppendorf tube 中，液氮速冻，-80℃保存，一般不要存放超过2-3个月。
农杆菌感受态制备
版本一1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1. 取-70 C保存的EHA105于含50用/ml链霉素平板划线，28 C培养。
1.1.2. 挑取单菌落接种于 5ml YM液体培养基中，220rpm 28 C振荡培养12-16 hr。
1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM 液体培养基中，28 C 220rpm 振荡培养至 OD600=0.5。
1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm 离心5min,去上清液。
1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCI2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min °4C 5000rpm离心5min，去上清。
1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。
1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendof管中，每管200 M冻存于-70 C。
1.2.双元载体转化农杆菌 EHA105取1⑷左右的质粒 DNA加入到200ml EHA105 感受态细胞中，混匀后，冰浴30min , -70 C放置10min。
再在37 C水浴5min或42 C水浴1min，接着冰浴 2min，加入800mlYM 液体培养基 28 C, 175rpm 摇培3hr后涂在含50旧/ml Kanamycin 的YM平板上。
28 C培养到形成单菌落。
其中 YM 可以用LB代替，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCI2 0.01Tris-HCI （7.0）0.01 DTT ）替代。
版本二普通农杆菌感受态制备与转化：1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml ）中28 C过夜活化。
2. 取2ml过夜菌液接种于 50ml YEP培养基中28 C生长至 OD600约等于0.5左右（4hr ）。
3. 5k rpm离心5分钟。
4. 在10ml 0.15M NaCI 中悬浮细胞。
5. 5 krpm 离心5分钟，悬浮细胞于 20ml冰预冷的CaCI2。
实验三农杆菌感受态细胞制备及转化
农杆菌感受态
感受态细胞（competent cell)是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态.
重组DNA要导入宿主细胞，其生理状态很重要，需要将细胞进行特 殊处理，使细胞膜透性发生暂时性改变，成为容易接受外源DNA分 子的状态，即成为感受态细胞。
电击法， CaCl2法。 不同的转化方法需制备不同的感受态。 CaCl2法制备感受态：正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶
农杆菌介导基因转化
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件 下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状 根。
根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有 一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植 物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆 菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的TDNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后 通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 特点：操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
• 4℃，5 000 rpm离心5 min, 弃上清，收集菌体 D E • 菌体重悬于4ml冰预冷的20 mM的CaCl2中，冰浴10-20 min
• 4℃，5 000 rpm离心5 min，弃上清 F
• 菌体重悬于1ml冰预冷的20 mM的CaCl2，分装100µl/管，24 h内使用或液氮速冻 G 后-70 °C保存
感受态细胞制备及转化中出现的问题
感受态长期保存要进行速冻，立即用-80 ℃冰箱或液氮速冻，而在使用 时，用37 ℃水浴或手掌体温进行速融，避免冰晶形成过程对细胞造成的 伤害，导致细胞破损不能存活。 感受态细胞不能反复冻融。 涂板后时间过长会有假阳性转化子的出现，抗生素在37℃过夜后失活， 抗生素作用是抑制未转化的感受态细胞生长，而不能将这些细胞杀死， 所以涂板后无单菌落出现，出现长满板的情况为抗生素失活。
农杆菌感受态制备与转化
双元载体的农杆菌转化
1.1农杆菌感受态细胞的制备
1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。
1.1.
2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。
1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。
1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。
1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。
4℃5000rpm离心5min，去上清。
1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。
1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。
1.
2. 双元载体转化农杆菌EHA105
取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min(液氮一分钟)。
再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。
28℃培养到形成单菌落。
其中YM 可以用LB 代替，第一次的CaCl2溶液可用溶液（0.1MCaCl2
0.01Tris-HCl（7.0）0.01 DTT）替代。
农杆菌感受态的制备和转化
1.农杆菌感受态的制备感受态制备溶液:8% PEG 4000, 4% DMSO,50mM CaCl220Mm重悬细胞效果更好？挑取农杆菌(EHA105和LBA4404)单菌落接种于含氯霉素或链霉素和利福平5mLYEB液体培养基中,28℃,200～250r/min振荡培养30～36h,转入100mLYEB液体培养基中(1:20比例接种),在相同条件下培养至菌液OD600=0.4-0.6(约10h)。
然后冰上放置菌液15min，4℃,4000r/min离心10min,用适量50mmol/L冰浴CaCl2溶液重悬后在相同条件下离心,再用1/10原体积50mmol/L冰浴感受态制备溶液重悬,用1.5mL离心管分装成50μL小份,置于冰上，液氮速冻之后现用或-80℃保存备用。
Not Iike E.coli cells, fresh A.bacterium competent cells had higher transformation efficiency . As time went on . the transformation efficiency was decreased. When the storage time was longer than7 days and the temperature is higher than 4℃, A. bacterium lost the competent ability.2.冻融法转化农杆菌50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），与质粒混合均匀之后, 放置冰上30 min，然后置于液氮速冻3-5min,28℃水浴热激5min,然后加入无抗生素的LB培养基，28℃，200～250r/min振荡培养2h，涂布抗性平板，28℃静置培养36小时后挑菌落鉴定。
1. 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备1) 挑取单菌落GV3101，接种于5mL附加有50mg/L的利福平的液体LB培养基中，28℃，200rpm，过夜；2) 取2mL培养物至50mL液体LB培养基中，继续培养至OD600为0.5左右；3) 将培养物冰浴30min，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；4) 用l0mL 0.lmol/L冷的NaCl悬浮菌体；5) 4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；6) 1 mL 20mmo1/L冷的CaCl2悬浮，分装成50uL/管，液氮速冻后，-80℃保存。
农杆菌感受态制备和转化-冻融法
农杆菌的感受态制备和转化-冻融法
农杆菌感受态细胞的制备
(l)将农杆菌接种于5一10mlYEB液体培养基中(Str 100mg/L)，28℃震荡过夜。
(2)取lml活化的菌液接种于200ml含有抗生素的YEB培养基中，同样条件下培养至OD600值为0.4一0.5左右。
(3)将菌液冰浴30min后，装至50ml离心管中。
(4)4℃，5000g离心10min，收集菌体。
(5)弃上清，用4ml 20mmol/L的冰预冷CaCl2重悬沉淀，并加入1.7ml，50%的甘油，混匀。
(6)按每管200ul分装，液氮速冻后于一70℃保存。
冻融法转化土壤农杆菌
(l)取1ug载体DNA加到200ul冰上溶化的感受态细胞中，轻混，冰浴30min。
(2)液氮中速冻5min，37℃水浴5min，再迅速冰浴2min。
(3)加入800ul YEB液体培养基，28℃轻摇4一6hr。
(4)取50一200ul菌液涂布于YEB选择平板上（含有相应的抗生素），28℃倒置培养2天。
CaCl2 20mM 50ml 20*mM/1000*110*50ml/1000=0.11g至50ml。
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证农杆菌电击感受态的制备及电击转化表达载体pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的农杆菌（EHA105）电击转化（1）抽提纯化pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的重组质粒 pB-2mb-FRO-1.7A重组载体和pB-2mβ-1.7A空载体的（DH5α）菌种接种于5ml LB（含卡那霉素50mg/L）液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜。
按V-GENE公司的质粒提取试剂盒提取pB-2mb-FRO-1.7A重组质粒。
（2）取200ml型号的电击杯用无水乙醇浸泡，晾干。
（3）农杆菌EHA105电击预备处理。
I. 接种于5ml YEP（含链霉素Sm50mg/L）液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养过夜至OD600值为0.4。
EHA105 II. 离心管中收集1ml菌液，4℃，8000rpm，离心30s。
1.5mlIII. 去残液，沉淀用200μl ddH2O充分悬浮，4℃，8000rpm，离心30s。
IV. 重复步骤�Ｈ�次。
V. 去残液，沉淀用200ml ddH2O充分悬浮，即为电击用农杆菌EHA105感受态。
加入200μl灭菌甘油混匀后置于-80℃备用。
（4）电击I. 分别取10ml pB-2mb-FRO1-1.7A和pB-2mb-1.7A重组质粒至200μl EHA105感受态中，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上。
II. 准备好电击装置（BioRad），电压为2.5V，用手按住电击按钮，直到啪的一声电击完毕。
III. 室温静置2min后加入800ml YEP培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培养2h。
IV. 离心30s，收集菌液，沉淀用200ml ddH2O悬浮，用玻璃棒涂布含含卡那霉素50mg/L和含链霉素Sm50mg/L的YEP固体培养基平板，28℃培养48h。
8000rpm1. 制备农杆菌电转感受态(1)挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素100mg/L)液体培养基中，28'C, 220rpm震荡培养过夜。
实验五农杆菌感受态细胞的制备和质粒转化
感受态细胞制备的原理
• 感受态细胞制备的原理是细菌在低温和低 渗氯化钠溶液中，菌细胞壁通透性增加。
实验原理
• 转化方法：电击法、 CaCl2、 NaCl等化 学试剂法 • 感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性 发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通 过时细胞的状态。 • 转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子 的受体细胞( TransfoKan培养基
影响转化率的因素
• • • • 细胞生长状态和密度。 转化的质粒 DNA 的质量和浓度。 试剂的质量。 防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。
实验试剂
农杆菌LBA4404 YM培养基， 0.1mol/LNaCl溶液（预冷） 20mM CaCl2溶液（预冷） 卡那霉素（50mg/ml） 质粒DNA （上周日提取）
2.挑取单菌落接种到40ml YM液体培养基（硫酸链 霉素，25mg/ml）中，28℃条件下，250rpm悬 浮培养12-20小时。
3．在超净工作台上将菌液转入灭过菌的50ml离心管 中，4℃ ，5000×rpm离心8min。 4．在超净工作台上弃上清，用100mM NaCl （4℃ 预冷）重悬农杆菌，4℃， 5000×rpm离心8min。 5．在超净工作台上弃上清，加入原始农杆菌菌液 1/50体积（800ml）的20mM CaCl2溶液重悬菌体， 并分装成500ml/管。 6．将分装后的离心管置于液氮中10秒，-80℃保存。
农杆菌感受态细胞的制备
1.将农杆菌LBA4404（抗硫酸链霉素，25mg/ml）接 种在YM平板上，26-28℃ 培养48小时。
YM培养基的配方：酵母提取物0.4g/L；甘露醇 10g/L；NaCl 0.1g/L；MgSO4 0.1g/L； K2HPO4 0.5g/L；琼脂粉 15g/L pH：7.2-7.4
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农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤发布日期：2010-04-28 发布
人:technew最后更新时间:2010-04-28 浏览次数:889
一、目的及要求
了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
二、实验原理
在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。
在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。
感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。
农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。
将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。
制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。
三、实验仪器、材料和试剂
仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。
材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株
试剂：
YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，
MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌；
链霉素（Sm）储液：125mg/ml
0.15 N NaCl，高压灭菌。
20mM CaCl2，高压灭菌。
四、实验步骤
1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜；
2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5；
3. 5000rpm, 离心5min；
4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min；
5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。
一．农杆菌感受态细胞的制备
二．双元载体转化农杆菌EHA105
三．杆菌转化子的鉴定
A．农杆菌转化子的PCR鉴定
B．农杆菌转化子的酶切鉴定
关键词：农杆菌感受态细胞转化子
一．农杆菌感受态细胞的制备（同大肠杆菌质粒DNA的提取），然后将其转化大肠杆菌，再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。
取-70℃保存的EHA105于含有50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养2天。
挑单
菌落接种于5ml YM（0.5g/L KH
2 PO
4
,10 g/L Mannitol,2 g/L L-Glutamine,0.2
g/L NaCL,0.2 g/L MgSO
4,0.3 g/L Yeast extract,PH
7
.0）液体培养基中，220rpm，
28℃振荡培养18 hr 左右。
将5ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，
28℃,220rpm,振荡培养至OD
600
=0.5。
转入无菌1.5ml的EP管，5000g离心5min,
去上清液。
加入1ml预冷的0.1M的CaCl
2
溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min，
4℃下，5000g离心5min，去上清。
加入200µl预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl
2溶液，轻轻悬浮。
混匀后立即冻存于-80℃。
二．双元载体转化农杆菌EHA105
取1µg左右的质粒DNA加入到200µl EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；-70℃放置10min ；取出后37℃水浴5min或42℃水浴1min；冰浴2min；加入800µl YM液体培养基,28℃，175rpm摇培3hr；取出后涂在含50μg/ml Kanamycin 的YM平板上，28℃培养到形成单菌落。
三．杆菌转化子的鉴定
A．农杆菌转化子的PCR鉴定
挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50µg/ml Kanamycin的YM液体培养基中，28℃，220rpm摇培16hr，直接用菌液做PCR。
PCR反应体系如下：
反应组分体积终浓度母液浓度
农杆菌转化子菌液2µl
P1 (35S) 2µl 200nM 2µM
P2 (GUS) 2µl 200nM 2µM
10 ×PCR Buffer 2µl
Mg2+ 1.2µl 1.5mM 25mM
d NTP 1.2µl 150µM 2.5mM
Taq酶0.2µl 1U 5U/µl
H
O 9.4µl
2
20µl
PCR反应参数设置如下：94℃预变性3min 后开始以下循环反应：94℃变性30秒，50℃退火1min ，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸10min。
反应结束后，取10µl反应液在1.0 %琼脂糖凝胶中电泳扩增产物。
B．农杆菌转化子的酶切鉴定
提取农杆菌质粒DNA（同大肠杆菌质粒DNA的提取），然后将其转化大肠杆菌，再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。