动物细胞培养总结!!!!
动物细胞工程知识点总结
动物细胞工程知识点总结动物细胞工程是一门综合性的学科，主要研究分子生物学、细胞生物学、生物工程学等方面的知识，旨在利用现代生物技术，对动物细胞进行精细的操作和调控，实现生物制品的高效生产和治疗的有效手段。
动物细胞工程的主要内容包括：细胞培养、基因修饰、蛋白质表达、生物传感、干细胞研究、组织工程、基因治疗等等。
其中，细胞培养是动物细胞工程的基础和核心，是实现其他学科研究的前提和保障。
细胞培养技术涉及多种类型的细胞，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、鸟类细胞等。
常见的细胞培养方式有两种：悬浮培养和贴壁培养。
对于悬浮培养的细胞，需要在旋转式生物发酵罐或气泡式生物反应器中进行培养，而贴壁培养的细胞则需要一定的基础培养物和培养基来维持其生长和分化。
在细胞培养基础上，基因修饰技术可以通过外源DNA的导入或内源DNA的编辑，实现对目标细胞的基因表达的精准调控。
此外，蛋白质表达技术也是动物细胞工程的重要内容，可通过转染、转化或质粒转移等方式，将外源基因表达特定的蛋白质，实现蛋白质的高效合成和分泌。
生物传感技术是近年来兴起的一个领域，研究通过特定的生物材料或生物反应器件，实现对生物大分子的定量检测和分析，有望实现临床诊断的快速、准确、便捷化。
干细胞研究是动物细胞工程的前沿领域，主要研究人类和动物的干细胞的分化和再生能力，为组织工程、再生医学等领域提供基础和支持。
组织工程技术是一种将干细胞和生物材料结合起来，制作出复杂的组织器官或人工器官的新兴技术。
目前研究较为广泛的组织工程重要领域包括人工骨、人工关节、人工角膜等。
基因治疗技术则是动物细胞工程的又一重要领域，通过应用基因编辑、载体输送等技术，实现基因和细胞的治疗效果，是目前治疗癌症、糖尿病、血友病等疾病的新希望。
总之，动物细胞工程在医学、生物科学、生物工程等各个领域有着广泛的应用和重要作用，它的发展有助于图谱生命科学的未来，为人类的健康事业和生物科学的发展做出新的贡献。
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[整理].动物细胞培养技术动物细胞培养技术绪论部分1）细胞的基本概念：细胞（包括单个个体）在体外条件下的⽣长，成为细胞培养。
2）组织培养：其本意是指从体内取出组织和细胞，模拟体内⽣理环境，在⽆菌，适当温度和⼀定营养条件下使之⽣存和⽣长并维持其结构和功能的⽅法。
（组织培养从⼴义上说分为动物组织营养和植物组织营养两⼤类。
）组织培养常⽤术语贴壁依赖性：为细胞需贴附于第五或⽀撑物上才能⽣长的性质。
细胞⼀代时间：单个细胞连续两次分裂的时间相隔，可借助显微电影照相术来精确确定。
群体倍增时间：在对数⽣长期进⾏计算的细胞增加⼀倍所需时间。
克隆;单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，他们的遗传特性相同。
原代培养：从体内取出细胞或组织的第⼀次培养。
传代或传代培养：不论是否稀释，将细胞从⼀个培养瓶转移或移植到另⼀个培养瓶。
细胞杂交：两个或多个不同的细胞融合导致⼀个含核体的形成。
细胞培养：其本意是指从体内取出组织和细胞，模拟体内⽣理环境，在⽆菌、适当温度和⼀定营养条件下，使之⽣存和⽣长并维持其结构和功能的⽅法。
细胞培养的作⽤：在病毒学上的作⽤（病毒的分离细胞培养在药物学上的作⽤（新药的制备、药效的鉴别、病毒疫苗的⽣产、单抗的制备）；细胞培养在肿瘤学研究上的作⽤（例如化疗中的药物使⽤剂量、癌症研究等）细胞培养在细胞功能与分化研究中的应⽤；细胞培养在免疫学中的应⽤1)Harrison⾸先解剖出蛙胚原始脊髓节段进⾏培养。
哈⾥森悬滴培养法。
建⽴起⼀套合理的⽆菌操作技术。
（淋巴）⼀般皆公认Harrison为“组织培养之⽗”，凹玻⽚悬滴制备培养技术，对⽣物学知识的研究做出⼗分重要贡献。
2) Carrel 反复传代的⽅法使细胞系存活34年。
他采⽤的⽆菌技术，以及后来设计的培养瓶(卡⽒瓶，Carrel flask)等都是对组织培养的重要贡献。
特别是他的连续培养，为后来的传代培养奠定了基础。
30年代传⼊我国，50年代逐渐发展细胞培养设施和基本条件（⼀）细胞实验室基本原则：防⽌微⽣物污染和有害物的影响。
动物细胞培养技术
动物细胞培养技术动物细胞培养技术是生物学领域中的一项重要技术，它可以帮助科学家们研究动物细胞的结构、功能和生理过程。
通过培养动物细胞，科学家可以模拟生物体内的生理环境，从而更好地理解细胞的生物学特性。
本文将介绍动物细胞培养的基本原理和常用的培养技术。
一、动物细胞培养的基本原理动物细胞培养是指将动物体内的细胞取出并在体外特定的培养基中进行培养的过程。
培养基是一种模拟生物体内环境的营养液，它提供了细胞所需的必要营养物质和生长因子。
在培养基中，细胞可以获得适当的营养和生长条件，从而保持其生物学特性并进行增殖。
动物细胞培养的基本原理包括以下几点：1. 细胞来源：细胞可以来源于动物组织、器官或体液中，常用的细胞来源包括胎儿组织、胚胎组织、肿瘤组织等。
2. 细胞分离：细胞从组织中分离的方法通常包括机械分离、化学分离和酶解分离。
分离后的细胞可通过离心等方式得到单个的细胞悬液。
3. 培养基选择：根据细胞的特性和要求，选择合适的培养基。
培养基可以分为无血清培养基和含血清培养基，无血清培养基常用于细胞实验室中。
4. 细胞培养条件：通过调整培养温度、湿度、pH值、氧气含量等条件，提供合适的环境促进细胞的生长和增殖。
5. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，需要进行细胞传代以保持其活力。
传代的方法通常是将细胞分散至新的培养容器中，以维持细胞的适宜密度。
二、常用的1. 无血清培养技术：无血清培养基是一种不含胎牛血清的培养基，通过添加人工合成的生长因子和营养物质来满足细胞的生长需求。
无血清培养技术避免了胎牛血清中含有的未知因子对实验结果的干扰，提高了实验的可重复性。
2. 原代细胞培养技术：原代细胞培养是将从动物体内直接获得的组织进行分离和培养。
这种方法可用于细胞的初次培养和研究。
但由于原代细胞在培养中只能进行有限的传代，其使用寿命较短，因此需要定期重新取材。
3. 细胞系的建立：细胞系是细胞通过传代培养，并保持了一定生物学特性和遗传稳定性的细胞群。
《动物细胞培养技术及其应用》 知识清单
《动物细胞培养技术及其应用》知识清单一、动物细胞培养技术的基本概念动物细胞培养，简单来说，就是在体外模拟体内的环境，让动物细胞生长和繁殖的一种技术。
这可不是把细胞随便放在一个容器里就完事，而是需要一系列严格的条件和操作。
要进行动物细胞培养，首先得有细胞来源。
这通常来自动物的组织或器官，通过一些特殊的处理方法，把细胞分离出来。
然后，把这些细胞放进一个专门设计的培养容器中，里面有细胞生长所需的营养物质、生长因子、气体环境（比如氧气和二氧化碳），还有合适的温度、酸碱度等条件。
二、动物细胞培养的基本条件1、无菌环境这可是重中之重！哪怕有一点点细菌、真菌或者病毒混入，都可能让整个培养失败。
所以，实验室的设备要严格消毒，操作过程也要在无菌的条件下进行。
2、合适的营养细胞要生长，就像我们人要吃饭一样，得给它们提供足够的营养。
这包括各种氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等。
而且，不同类型的细胞，对营养的需求还不太一样，得“因材施教”。
3、适宜的温度和酸碱度一般来说，动物细胞培养的温度在 365 到 375 摄氏度之间，酸碱度则通常维持在 pH 72 到 74 左右。
如果温度或酸碱度不合适，细胞可能会“闹脾气”，甚至死亡。
4、气体环境细胞也需要呼吸，氧气是必不可少的，一般通过培养容器中的通气装置来提供。
同时，二氧化碳对于维持酸碱度也很重要。
三、动物细胞培养的主要步骤1、取材从动物的组织或器官中取出需要培养的细胞。
这一步要尽量减少对细胞的损伤，还要保证细胞的活性。
2、原代培养把刚取出的细胞直接进行培养，这叫原代培养。
这时候的细胞还比较“娇嫩”，需要特别小心呵护。
3、传代培养当原代培养的细胞长满培养容器后，就需要把它们分成小份，转移到新的培养容器中继续培养，这就是传代培养。
4、细胞的冻存与复苏有时候为了长期保存细胞，会把细胞冻存起来。
等需要的时候，再通过特殊的方法让它们复苏，重新恢复生长和繁殖的能力。
四、动物细胞培养技术的应用1、生物制药这可是个大热门！通过培养动物细胞，可以生产出各种生物制品，比如疫苗、抗体、蛋白质药物等。
动物细胞培养心得
动物细胞培养·心得在学习动物细胞培养的过程中，我了解到是动物细胞工程中最常用的技术手段，而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础点，细胞培养是生物医学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。
在这次PPT 制作中，我对无脊椎动物和脊椎动物两大领域细胞培养取得的进展及应用作了较为详细的了解，并在此基础上探讨了动物细胞培养存在的问题以及未来的发展方向。
为相关领域研究者探讨其他种类细胞系的建立及筛选合适的细胞系培养方法作为理论的参考依据我了解到历史上组织培养技术创建于 18 世纪末，之后于 1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从体内组织取出细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。
这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。
特别是随着近年来现代生物科学领域的迅速拓展，各种分子生物学实验诸如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。
然而，在种类繁多的动物世界里，细胞培养实验技术的发展并不均衡，构建动物细胞培养体系的研究效率和效果上也存在较大的局限性。
而动物细胞培养，在1907年，哈里森（Harrison）在无菌条件下用淋巴液作培养基，培养蛙胚神经组织存活数周，并观察到神经细胞突起的生长过程，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养的基础。
之后，又有人将悬滴培养法改良为双盖片培养，提高了传代效率并减少了污染；1923年，卡雷尔（Carrel）设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。
1951年，厄尔（Earle）发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。
1951年，波米拉（Pomerat）设计了灌流小室，使细胞生活在不断更新的培养液中，便于作显微摄影和细胞代谢的研究。
动物细胞培养基础操作技术总结日志
2013年1月14日细胞传代培养与冻存准备工作1、准备：①试剂：加双抗的培养基、PBS、血清放到37度水浴锅预热20min；DMSO避光保存，现取现用不需要预热。
②灭菌：然后开启超净工作台的紫外灭菌灯和屋子的紫外灭菌灯，出去等待20min。
③设备：开启显微镜和离心机、准备3个细胞培养瓶、准备3个离心管、两个冻存管（现用现取即可）、黄色和蓝色的枪头（1毫升和200微升），废液缸。
2、时间到后，进入实验室，关闭紫外灭菌灯，洗手，进缓冲间换衣服，进无菌室戴上一次性手套，用酒精杀毒。
关闭超净工作室的紫外灭绝灯，打开排风和照明。
3、从水浴锅中取出试剂，用喷有酒精的纱布擦拭试剂表面的水；开启超净工作台，将试剂放入摆放整齐，以便于开始试验。
在细胞培养箱中取出细胞培养瓶，放入超净工作台。
开始试验：传代培养：1传3①将细胞培养瓶中的培养液倒掉。
②加入2ml（1mol/L）的PBS，洗掉死细胞和残余培养液，倒去洗液，洗2-3次。
（加液体之后平放，摇一摇）③消化：加入胰蛋白酶，2ml，静止消化3到5分钟，显微镜下观察（观察细胞呈球形为最佳），倒掉液体。
（平放的时候注意不要晃动，要静止）④分装培养液：为防止污染，将培养液分装到离心管中，并且加10%血清，本次试验用2ml血清，加培养基到20ml，摇匀。
⑤吹细胞：取加血清培养基6ml，加入培养瓶中，用培养基在培养瓶中反复冲洗，直到所以细胞都被冲洗下来为止。
（枪头勿接触瓶口，如果接触了应该换枪头，移好6ml后不用换枪头，继续用这个枪头吹，注意多吹几次瓶底和角落，吹过后细胞生长一侧变透明。
）⑥分瓶：将3个细胞培养瓶分别写好培养细胞名称、日期、使用者名字，开启盖子，分别加入2ml刚刚冲洗好的含有细胞的培养基（吸取时将培养瓶倾斜，在2/3的地方吸取，并且注意时刻让细胞液保持均匀，可以轻轻摇晃以保证其中细胞分布均匀）。
分装好后，将每个培养瓶中的培养基都加到6ml。
⑦培养：加好培养液的培养瓶放入细胞培养箱中培养，培养瓶头向箱子里面，培养两天即可继续传代。
《动物细胞培养》一节教学设计及实践反思
《动物细胞培养》一节教学设计及实践反思导读：学校每学期每位老师都有一节校内公开课。
本学期我选择了《2.2.1动物细胞培养和核移植技术（第一课时）》即《动物细胞培养》作为公开课即录像课的教学内容。
在课前经过了自己精心准备但是具体实施的教学结果却不令人满意。
通过“有效上课”专题的学习研究，我认真反思了自己这节课不成功的原因，与大家交流。
说明：第一部分公开课时《动物细胞培养》的教学设计第二部分课后的几点教学反思第三部分反思后的《动物细胞培养》教学设计一、教学目标简述动物细胞培养的过程、条件及应用。
二、教学重点、难点1. 教学重点动物细胞培养的过程及条件。
2. 教学难点动物细胞培养的过程及条件三、教材分析动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。
在动物细胞培养技术之后介绍的核移植技术、动物细胞融合技术、生产单克隆抗体以及胚胎工程都要用到动物细胞培养技术。
掌握好这项技术才能为其他技术打好铺垫。
所以把动物细胞培养讲的清清楚楚、明明白白就十分重要了。
在动物细胞培养的教学中，可把这部分内容归纳成三个问题：（1）为什么要进行动物细胞的培养？——即培养的用途（2）什么是动物细胞的培养？（3）怎样进行动物细胞的培养？第三个问题是本节课的重点。
四、学情分析动物细胞在体内的增殖学生是了解的，在体外如何实现细胞增殖的，有什么特点以及培养后的细胞有什么用途都是可以激发学生的学习兴趣。
对于动物细胞培养的条件，则要从学生已有的内环境的知识出发，启发学生自己动脑思考这个问题，以加深对培养条件的理解。
学习了植物细胞工程的基础上再去联系动物细胞培养技术，并能作出二者的比较。
五、教学过程（我将本节所以设置的问题或问题组或活动编号）5.1课堂导入：师展示两幅烧伤程度不同的病人图片。
提问如何治疗呢？生答。
师进一步提问：如何获得大量健康的自体皮肤来治疗？生答。
5.2新知学习师：通过培养皮肤细胞可获得健康皮肤细胞，那么什么是动物细胞培养?培养过程有什么特点以及培养的细胞用途有哪些呢？本节课一起来解决？师展示图片:动物细胞培养的概念。
动物细胞工程 知识点汇总
专题2 细胞工程 2.3 动物细胞工程知识点汇总1. 动物细胞培养（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。
（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。
细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
（4）动物细胞培养需要满足以下条件①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。
通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。
此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。
通常需加入血清、血浆等天然成分。
③温度：适宜温度：哺乳动物多是36.5℃+0.5℃；pH：7.2～7.4。
④气体环境：95%空气+5%CO2。
O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。
（5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。
2.动物体细胞核移植技术和克隆动物（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。
（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。
（3）体细胞核移植的大致过程是：高产奶牛（提供体细胞）进行细胞培养；同时采集卵母细胞，在体外培养到减二分裂中期的卵母细胞，去核（显微操作）（注：为什么要用卵细胞？它可以提供充足的营养；操作简便；细胞质不会抑制细胞核全能性的表达）；将供体细胞注入去核卵母细胞；通过电刺激使两细胞融合，供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎；将胚胎移入受体（代孕）母牛体内；生出与供体奶牛遗传基因相同的犊牛。
动物细胞培养总结!!!!
动物细胞培养总结动物细胞培养的基本步骤包括细胞分离、种植、培养及维护。
首先需要从动物组织中获取细胞，可以通过机械或酶解的方式将组织细胞分离出来。
然后将细胞悬浮液转移到培养皿中，加入适当的培养基，并提供适宜的温度、湿度和气体环境。
细胞在培养皿中会逐渐形成单层或悬浮状态，可以进行细胞形态观察、增殖和鉴定等。
维护细胞的正常生长和增殖，需要定期更换培养基并进行细胞传代，以避免细胞的老化和死亡。
动物细胞培养的关键因素包括细胞种类的选择、培养基的配制、环境参数的控制等。
细胞种类的选择应根据研究需求和细胞特性进行，不同的细胞对培养条件的要求有所差异。
培养基是细胞培养的基础，需要提供充足的营养物质、生长因子和激素等，以满足细胞正常生长和增殖所需。
同时，培养基的pH值、温度和湿度等环境参数也需要严格控制，以维持细胞的健康状态。
细胞培养的应用非常广泛。
首先，动物细胞培养可用于细胞生物学研究，如细胞分化、增殖、凋亡等的机制研究。
通过观察细胞在不同条件下的变化，可以揭示细胞生物学过程中的分子机制。
其次，动物细胞培养在生物医学研究中也有重要应用。
例如，用于评估药物的毒性和疗效，开发新的药物或疫苗，以及研究疾病的发生机制等。
此外，动物细胞培养还可用于生产重组蛋白和细胞疫苗等生物制剂，具有重要的经济价值。
在动物细胞培养中，不可避免地会面临一些挑战和困难。
首先，细胞的质量和纯度是细胞培养成功的关键因素之一、细胞分离和培养的过程中，可能会产生细胞杂交和污染，对细胞的准确鉴定和纯度检测提出了要求。
其次，细胞培养需要严格控制环境参数，如温度、CO2浓度和湿度等，这对实验设备的要求较高。
此外，不同细胞株的生长速度和特性也有所差异，对培养者的经验和技术水平提出了要求。
综上所述，动物细胞培养是一项重要的实验技术，具有广泛的应用前景和经济价值。
通过细胞培养，可以获得大量的细胞材料，用于细胞生物学研究和新药的研发。
然而，动物细胞培养也面临着挑战和困难，需要进行严格的细胞鉴定和纯度检测，以及合理控制环境参数。
动物细胞传代培养实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除动物细胞传代培养实验报告篇一：细胞传代培养实验报告细胞传代培养一.实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的应用打下基础。
二、原理从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。
细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。
细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。
所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。
三、材料和试剂1、细胞：293细胞株2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml玻璃吸管、酒精灯等四、操作步骤1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。
2、加入1~2ml0.25％胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。
3、马上吸走胰酶液，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入培养箱中消化几分钟4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代5.根据确定的比例来取需要的量（剩余的细胞拿来做细胞计数），加入4ml左右的培养液6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱7.收拾整理超净台附：消化液配制方法：称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100ml10xpbs+纯水溶解到1L，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。
动物实验细胞实验报告
一、实验目的1. 掌握动物细胞培养的基本操作技术。
2. 了解细胞培养过程中可能出现的常见问题及其解决方法。
3. 观察细胞在不同培养条件下的生长状态，了解细胞生长规律。
二、实验原理动物细胞培养是指将动物体内的细胞取出，在体外条件下进行培养、繁殖的过程。
细胞培养技术是生物学研究的重要手段，广泛应用于细胞生物学、分子生物学、遗传学等领域。
本实验采用动物细胞培养技术，通过观察细胞在不同培养条件下的生长状态，了解细胞生长规律。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：小鼠胚胎成纤维细胞、胎牛血清、DMEM培养基、青霉素、链霉素、无菌培养皿、无菌移液器、细胞计数板等。
2. 实验仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、超净工作台、离心机、电子天平等。
四、实验步骤1. 准备工作（1）将小鼠胚胎成纤维细胞接种于无菌培养皿中，放入细胞培养箱中培养。
（2）配制DMEM培养基，加入青霉素、链霉素，混匀后过滤除菌。
2. 细胞传代（1）将培养好的细胞取出，用无菌移液器吸取适量的细胞悬液，加入无菌离心管中。
（2）以1500r/min的速度离心5分钟，弃去上清液。
（3）加入适量的DMEM培养基，混匀后用无菌移液器吸取适量的细胞悬液，接种于新的无菌培养皿中。
（4）将培养皿放入细胞培养箱中培养。
3. 细胞计数（1）用细胞计数板对细胞进行计数，计算细胞密度。
（2）根据细胞密度调整细胞传代比例。
4. 观察细胞生长状态（1）用倒置显微镜观察细胞在不同培养条件下的生长状态。
（2）记录细胞形态、细胞密度、细胞周期等指标。
五、实验结果与分析1. 细胞生长状态在适宜的培养条件下，细胞呈长梭形，排列整齐。
随着培养时间的延长，细胞密度逐渐增加，细胞体积逐渐增大。
2. 细胞计数结果经过多次传代，细胞密度逐渐增加，细胞计数结果如下：第1代：1.5×10^6个/mL第2代：2.0×10^6个/mL第3代：2.5×10^6个/mL第4代：3.0×10^6个/mL3. 细胞周期分析通过观察细胞形态，发现细胞处于不同的生长阶段，包括G1期、S期、G2期和M 期。
动物细胞培养总结!!!!
动物细胞培养总结动物细胞培养总结一．实验准备1.实验器械、器皿的清洗和消毒（1）清洗和包装离心管(1.5ml，2ml,15ml)若干，闷存管若干放入铝饭盒，用牛皮纸包覆，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。
蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。
取适量蒸馏水于4l玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。
过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂冲洗，蒸馏水馨洗脸，研磨。
过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。
玻璃瓶圆桶瓶盖，瓶身浸酸。
浸酸时应注意安全，须佩戴耐酸手套和白大褂，特别注意维护不好面部和身体外露部分，提早底上一盆水在旁以便浸酸完结后冲洗耐酸手套，避免站立时酸液滴至地板上不好冲洗。
瓶口慢慢坠入液面下，特别注意缓慢减少瓶身，并使液体慢慢灌入瓶内，以免产生气泡飞溅酸液，出现危险。
浸酸时器皿必须充满著酸液，勿领气泡，煮沸过夜。
抽出瓶身时，须佩戴耐酸手套和白大褂，特别注意维护不好面部和身体外露部分，提早底上一盆水在旁，抽出后将瓶身放进盆内水中在迁移至水池边冲洗，以免酸液凝结地板不好冲洗。
换水洗几次，等待水回应后已经开始冲洗，每瓶都用自来水注满，死掉，重复15次，再用蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。
（2）消毒灭菌1>全自动高压杀菌锅：挂电源，关上控制器，检查水位，若水位严重不足提蒸馏水补齐，放进物品，瓶类物体须扳动盖子后摆最上面一筐，砌上杀菌锅盖，松开盖子至温度表明栏的左上角有一红照亮灯，按start已经开始高涨。
若灭有无菌水或玻璃瓶等待降温至常温再关上，关上后立即松开，无菌水瓶口封上封口膜。
若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可关上杀菌锅，须穿上线手套抽出。
2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。
动物细胞培养总结!
动物细胞培养总结一．实验准备1.实验器械、器皿的清洗和消毒（1）清洗和包装离心管，2ml,15ml)若干，冻存管若干放进铝饭盒，用牛皮纸包裹，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。
蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。
取适量蒸馏水于4L玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。
过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂刷洗，蒸馏水润洗，烘干。
过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。
玻璃瓶拧下瓶盖，瓶身浸酸。
浸酸时应注意安全，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁以便浸酸结束后清洗耐酸手套，防止走动时酸液滴到地板上不好清洗。
瓶口慢慢沉入液面下，注意缓慢降低瓶身，使液体慢慢浸入瓶内，以免产生气泡溅出酸液，发生危险。
浸酸时器皿要充满酸液，勿留气泡，浸泡过夜。
取出瓶身时，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁，取出后将瓶身放入盆内水中在转移至水池边清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。
换水洗几次，待水澄清后开始冲洗，每瓶都用自来水灌满，倒掉，重复15次，再用蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。
（2）消毒灭菌1>全自动高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，放入物品，瓶类物体须拧松盖子后放最上面一筐，盖上灭菌锅盖，拧紧盖子至温度显示栏的左上角有一红点亮灯，按start开始升温。
若灭有无菌水或玻璃瓶待降温至常温再打开，打开后立即拧紧，无菌水瓶口封上封口膜。
若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可打开灭菌锅，须戴上线手套取出。
2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。
动物细胞培养实验报告
一、实验目的1. 掌握动物细胞培养的基本原理和方法。
2. 熟悉动物细胞培养过程中常用的仪器和试剂。
3. 通过动物细胞培养实验，了解细胞生长、增殖、分化的过程。
二、实验原理动物细胞培养是指将动物组织或器官中的细胞取出，在体外模拟体内环境，使其在适当的营养和条件下生长、增殖、分化。
动物细胞培养是生物学、医学、药理学等领域的重要研究手段。
三、实验材料1. 试剂：胎牛血清、DMEM培养基、青霉素、链霉素、胰蛋白酶。
2. 仪器：超净工作台、细胞培养箱、移液器、培养皿、显微镜等。
四、实验方法1. 细胞复苏：将冻存的细胞取出，用无菌生理盐水洗涤，加入适量DMEM培养基，在37℃、5%CO2培养箱中复苏。
2. 细胞传代：将复苏后的细胞用胰蛋白酶消化，加入适量的DMEM培养基终止消化，用移液器吹打细胞，制成单细胞悬液。
将单细胞悬液接种于培养皿中，在37℃、5%CO2培养箱中培养。
3. 细胞观察：在显微镜下观察细胞的生长状态，记录细胞生长、增殖、分化的过程。
4. 细胞传代：待细胞铺满培养皿底部时，用胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液。
将单细胞悬液接种于新的培养皿中，重复上述步骤。
五、实验结果1. 细胞复苏：复苏后的细胞在显微镜下观察到细胞呈圆形，细胞质清晰，细胞核明显。
2. 细胞生长：细胞接种后，在培养箱中培养，细胞逐渐铺满培养皿底部。
细胞生长过程中，细胞体积逐渐增大，细胞核逐渐增多。
3. 细胞增殖：细胞生长过程中，细胞数量逐渐增多，细胞铺满培养皿底部的时间逐渐缩短。
4. 细胞分化：在培养过程中，部分细胞发生分化，形成不同形态的细胞。
如神经细胞、肌肉细胞等。
六、实验讨论1. 细胞培养过程中，温度、CO2浓度、培养基成分等条件对细胞生长、增殖、分化具有重要影响。
实验中应严格控制这些条件，以确保细胞正常生长。
2. 细胞传代过程中，应注意防止污染。
操作应在超净工作台中进行，使用无菌器材，避免细菌、真菌等微生物污染。
3. 细胞培养实验过程中，应定期观察细胞生长状态，及时调整实验条件，以保证细胞正常生长。
动物细胞培养
（难）
3、以课本P48克隆高产奶牛为例分析核移植的 大致过程
供体细胞注入 去核卵母细胞
激活受体细胞， 完成分裂、发 育
减数第二次分裂中期 （MⅡ卵母细胞）
去核的卵母细胞
胚胎移植
代孕牛子宫
克隆牛
问题
1.克隆动物性状与供体动物完全一样吗？性别和供体动 物一样吗？ 不完全一样！因为：1、供体动物只提供 细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒体DNA） 来自于受体卵母细胞.2、生物的性状还受环境的影响。
动物细胞培养、核移植、胚胎移植等
供体细胞 （供核）
细胞培养
体细胞 核移 重
注入
植
组
卵巢卵母细胞 （MⅡ中期：供质）
去核
无核卵 母细胞
细 胞
胚胎 构建重 移植 组胚胎
代孕 母体
生出与供体奶 牛遗传基础相 同的犊牛
4、应用前景：
① 加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育 ② 保护濒危物种，增加存活数量 ③ 克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白 ④ 可以作为异种移植的供体 ⑤ 可以用于组织器官的移植
适宜的酸碱度：PH：7.2-7.4
4）气体环境：“95％空气+5％CO2”的混合气体培养箱。
氧气是细胞代谢必须的； CO2维持培养 液的PH。
5.动物细胞培养技术的应用:
1.蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体
2.应用于基因工程 主要用于作为受体细胞
3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4.细胞的生理、药理、病理研究
c.个体水平上：指基因型完全相同的两个或一个 群体。
–思考与回忆：
• 1、动物细胞全能性特点？
• 随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制， 分化潜能变窄。细胞核仍具有全能性。
动物细胞培养实验报告
动物细胞培养实验报告动物细胞培养实验报告引言：动物细胞培养是一项重要的实验技术，广泛应用于生物医学研究、药物开发和生物工程等领域。
本实验旨在通过培养动物细胞，观察细胞的生长、分裂和功能表达，以及研究细胞在不同环境条件下的生理和生化特性。
材料与方法：1. 细胞培养基：选择适合培养动物细胞的培养基，如DMEM或MEM等。
2. 细胞培养器具：细胞培养瓶、细胞培养皿、离心管、显微镜等。
3. 细胞株：选择合适的细胞株，如人类肺癌细胞株A549。
4. 细胞培养条件：温度、湿度、CO2浓度等。
5. 细胞培养试剂：胎牛血清、抗生素等。
实验步骤：1. 细胞传代：将细胞株从冻存管中取出，加入培养基中，将细胞传代至合适的密度。
2. 细胞培养：将细胞悬浮液均匀地加入细胞培养器具中，放入培养箱中培养。
3. 细胞观察：使用显微镜观察细胞的形态、数量和分裂情况。
4. 细胞染色：使用荧光染料或细胞染色剂对细胞进行染色，观察细胞内部结构。
5. 细胞功能表达：通过Western blot、PCR等技术，检测细胞中特定基因或蛋白的表达情况。
6. 细胞处理：在特定条件下处理细胞，如药物处理、温度变化等，观察细胞的反应和变化。
7. 细胞计数：使用细胞计数板或细胞计数仪等工具，统计细胞的数量。
结果与讨论：1. 细胞生长：观察到细胞在培养基中呈现出典型的生长曲线，包括潜伏期、对数期和平台期。
2. 细胞形态：细胞在培养基中呈现出典型的形态特征，如细胞核的形状、细胞质的颜色等。
3. 细胞分裂：观察到细胞在培养基中进行有丝分裂或无丝分裂，并计算细胞分裂指数。
4. 细胞染色：通过荧光染料或细胞染色剂染色后，观察到细胞内部结构的变化，如细胞器的位置和形态。
5. 细胞功能表达：通过Western blot、PCR等技术，检测到特定基因或蛋白在细胞中的表达水平。
6. 细胞处理：在特定条件下处理细胞后，观察到细胞的形态、数量和功能发生变化，如细胞凋亡、增殖等。
动物细胞的培养和生长技术
动物细胞的培养和生长技术，是生物学领域的一项重要技术。
它可以帮助生物学家更好地研究动物细胞的特性、生长过程和功能，从而为人们提供更好的医学支持和药物研发。
一、动物细胞的培养培养动物细胞需要选择合适的培养基和培养条件。
培养基是指一种能够满足细胞生长、分化和代谢等需要的营养液。
目前用于动物细胞培养的细胞培养基主要有两种，一种是定义培养基，另一种是复合培养基。
定义培养基是经过精确调配的，其中的各种元素和成分时不变的，能够精确控制细胞的生长与变化。
复合培养基则是将多种培养基成分混合在一起，适用于培养某些难以生长的细胞。
在选取培养基的时候，要考虑到细胞的来源和需求。
例如，不同种类的细胞需要的培养基成分可能有很大的不同，因此需要选择适合这种细胞生长的培养基。
二、动物细胞的生长动物细胞的生长是一个复杂的进程，需要合适的条件和环境。
在培养细胞的过程中，要注意控制以下几个方面：1、温度动物细胞生长的温度范围为37℃左右。
在培养细胞的过程中，需要控制好恒温箱的温度，以保证细胞的正常生长。
2、CO2在体内温度和CO2浓度相对稳定的情况下，细胞可以正常生长和分裂。
因此，在培养细胞的过程中，要控制好CO2浓度，一般设置为5%左右。
3、pH值动物细胞对pH值的适应范围比较窄，一般在7.2~7.4之间。
在培养细胞的过程中，要注意保持培养基的pH值，以避免对细胞生长产生不良影响。
4、细胞密度细胞密度是指每个培养皿中细胞的数量。
在培养细胞的过程中，要注意控制细胞密度的大小，避免出现超过存活数量以及空缺的情况。
三、动物细胞的常见培养技术1、单层培养单层培养是将细胞分散在培养皿表面上并逐渐生长成一层的技术。
这种技术适用于很多不同类型的细胞，如K562、HEK293等。
2、悬浮培养悬浮培养是将细胞在培养基中悬浮生长的技术，适用于一些不适合单层培养的细胞，如白细胞、淋巴细胞等。
3、三维培养三维培养是用一些支撑材料和培养基构建三维细胞组织的培养技术。
动物细胞培养
典型过程培养
动物细胞培养
低温下CO2溶解度增加，引起 溶解度增加，引起pH 温度 低温下 变化。 变化。 黏度 培养基的黏度主要受血清含量 的影响。 的影响。在搅拌条件下黏度大则细胞受 损伤小。 损伤小。加入羧甲基纤维素或聚己烯基 吡咯烷增加培养基黏度
典型过程培养
动物细胞培养
细胞培养基的基本组成 1、水 、 细胞培养用的各种液体都要用水来配置， 细胞培养用的各种液体都要用水来配置，对水 的纯度要求很高。 的纯度要求很高。通常细胞培养用水的污染物 标准可参考医药上注射用水标准， 标准可参考医药上注射用水标准，单原则上应 高于注射用水标准。 高于注射用水标准。 2、能源和碳源 、 主要是糖和糖酵解的产物和谷氨酰胺。 主要是糖和糖酵解的产物和谷氨酰胺。细胞能 用的糖主要是六碳糖，特别是葡萄糖。 用的糖主要是六碳糖，特别是葡萄糖。葡萄糖 很容易被大多数细胞转化为乳酸。 很容易被大多数细胞转化为乳酸。昆虫细胞更 偏爱蔗糖。 偏爱蔗糖。在多数培养基中谷氨酰胺作为主要 的能源和碳源。 的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的问题是它 的自发降解，降解量与时间、温度、 的自发降解，降解量与时间、温度、血清和磷 酸浓度有关，降解产物为氨，对细胞有毒性。 酸浓度有关，降解产物为氨，对细胞有毒性。
典型过程培养
动物细胞培养
转化细胞由于有无限寿命， 转化细胞由于有无限寿命，在培养中更 易生长，被广泛用于生成生物制品， 易生长，被广泛用于生成生物制品，如 重组蛋白药物、病毒疫苗等。但是， 重组蛋白药物、病毒疫苗等。但是，人 们对她们的安全性仍然非常关心， 们对她们的安全性仍然非常关心，对可 能造成的生物危害性进行严格的检测和 控制。 控制。
典型过程培养
动物细胞培养
一、动物细胞培养的特性 动物细胞培养是指在合适的培养条件下， 动物细胞培养是指在合适的培养条件下， 动物细胞离体生长和增殖， 动物细胞离体生长和增殖，并保持其特性 和功能的技术，这些细胞不再形成组织。 和功能的技术，这些细胞不再形成组织。
动物培养工作总结
动物培养工作总结在过去的一年里，我从事了动物培养工作，这是一项充满挑战和机遇的任务。
在这个过程中，我学到了很多关于动物细胞培养的知识和技能，也总结了一些经验和教训。
首先，我了解到动物细胞培养是一项非常精细和复杂的工作。
它需要严格的无菌操作和精细的实验设计。
在实验前，我们需要进行充分的准备工作，包括实验计划的制定、器皿的清洗和消毒、培养基和其他试剂的配制和灭菌、无菌室或超净工作台的清洁和消毒、以及培养箱和其他仪器的检查和调试。
这些准备工作需要细致和耐心，因为任何一个小错误都可能导致实验失败。
其次，我学到了动物细胞培养需要严格的质量控制。
在实验过程中，我们需要定期检查细胞的生长情况和质量，及时调整培养条件，确保细胞的生长和繁殖。
同时，我们也需要对实验数据进行详细的记录和分析，以便后续的实验设计和改进。
在进行动物细胞培养的过程中，我也遇到了一些挑战和困难。
例如，细胞的污染是一个常见的问题，也是导致实验失败的主要原因之一。
为了防止污染，我们需要在所有的操作中保持无菌环境，使用无菌的器材和试剂，并且在操作过程中避免交叉污染。
另外，细胞的传代和分化也是一个复杂的过程，需要根据细胞的特性进行适当的操作和调整。
尽管动物细胞培养工作充满了挑战，但是当我看到成功的实验结果时，我感到非常的满足和有成就感。
在这个过程中，我也学到了很多关于细胞生物学和生物化学的知识，提高了我的实验技能和科学研究能力。
总的来说，动物细胞培养是一项复杂而精细的工作，需要严格的实验设计和操作，同时也需要细致的观察和记录。
尽管困难重重，但是当我们看到成功的实验结果时，所有的努力和付出都是值得的。
我将继续努力，不断提高自己的实验技能和科学研究能力，为生物科学的发展做出自己的贡献。
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动物细胞培养总结一．实验准备1.实验器械、器皿的清洗和消毒（1）清洗和包装离心管，2ml,15ml)若干，冻存管若干放进铝饭盒，用牛皮纸包裹，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。
蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。
取适量蒸馏水于4L玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。
过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂刷洗，蒸馏水润洗，烘干。
过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。
玻璃瓶拧下瓶盖，瓶身浸酸。
浸酸时应注意安全，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁以便浸酸结束后清洗耐酸手套，防止走动时酸液滴到地板上不好清洗。
瓶口慢慢沉入液面下，注意缓慢降低瓶身，使液体慢慢浸入瓶内，以免产生气泡溅出酸液，发生危险。
浸酸时器皿要充满酸液，勿留气泡，浸泡过夜。
取出瓶身时，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁，取出后将瓶身放入盆内水中在转移至水池边清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。
换水洗几次，待水澄清后开始冲洗，每瓶都用自来水灌满，倒掉，重复15次，再用蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。
（2）消毒灭菌1>全自动高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，放入物品，瓶类物体须拧松盖子后放最上面一筐，盖上灭菌锅盖，拧紧盖子至温度显示栏的左上角有一红点亮灯，按start开始升温。
若灭有无菌水或玻璃瓶待降温至常温再打开，打开后立即拧紧，无菌水瓶口封上封口膜。
若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可打开灭菌锅，须戴上线手套取出。
2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。
加温升压之前，先打开排气阀门，加温约半小时后见排气阀处开始排残留在锅内的冷空气，排气五分钟，关闭排气阀，继而开始升压。
灭菌后不要立即打开气阀放气以免水汽喷出。
待自然降温至常压才能打开气阀。
玻璃瓶须拧紧，饭盒，枪头灭菌后放入烘箱烘干备用。
2.无菌间消毒及设备检查用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兑水，抹布、拖把擦洗。
配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔细擦拭CO2培养箱，超净台，超净台内物品，显微镜，桌面，若培养箱内未培养细胞可以再打开高温灭菌模式将培养箱灭菌一次。
用蒸馏水擦拭清洗水浴锅内壁，注意底座不要沾水。
检查CO2总压力表，若读数不足四分之一提前预定CO2瓶，换瓶时需要扳手。
CO2培养箱最下层的增湿盘须定期观察加水，将增湿盘内注入1/2无菌蒸馏水，并将盘直接放置在培养箱中央。
启动培养箱，培养箱接通电源，增湿盘加水，连接好气体供给，检查有无漏气，输入系统设置。
设置温度和二氧化碳。
紫外照射无菌间30分钟，注意屋内不要有人以及培养基等试剂。
3.细胞培养用液的配置及分装RPM1640培养基配制：将干粉型RPM1640培养基溶于总量1/3的去离子水中，再用1/3水冲洗包装内2次，倒入培养基中，以保证所有干粉都溶解成培养液，根据产品说明的要求和实验补加谷氨酰胺和NaHCO3 ,倾斜三角瓶轻轻放入转子，用磁力搅拌器搅拌2h。
用泵使培养基在超净台内通过灭菌的过滤器，过滤除菌，分装后置4度冰箱保存备用。
使用前调pH至，加双抗于培养液中浓度为1%，使用时加胎牛血清10%FBS.胎牛血清FBS的处理：使用前应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体，将胎牛血清放入56度水浴中30分钟，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。
分装前提前2天放4度冰箱解冻，溶解完全后于超净台内分装为25ml每管，留2管放四度备用，余下放-20度冻存。
配制含血清培养基或冻存液前务必提前一天取出分装后的血清四度溶解备用，血清融化很慢。
5%NaHCO3溶液配制：5g NaHCO3，100ml蒸馏水， NaHCO3溶于水后，过滤除菌。
%胰蛋白酶液200ml在超净台内分装成每管1ml或2ml，封口膜封口，-20度备用。
双抗溶液配制：80万单位青霉素加4ml灭菌D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。
100万单位链霉素加5ml灭菌的D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。
两溶液各取混合，加入9mlD-Hanks液，则成含青链霉素各1万单位/ml，分装后置于4度冰箱保存备用。
二．操作步骤注意事项：1、所有实验用的器械，仪器灭菌，消毒，烘干。
2、打开溶剂，培养瓶瓶盖时，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。
3、用完溶剂，培养瓶时，瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。
4、所有物品放入超净台需用酒精棉擦拭，包括手伸出窗口拿取物品再回到窗内时需要重新用酒精棉擦拭。
开始工作：1、实验前换紫外照过的白大褂和拖鞋。
2、戴橡胶手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。
3、取待用的细胞，旋紧瓶盖。
4、胰酶消化缓慢时可以将细胞置于5%CO2、37度培养箱中1min-2min，目的是提高酶活性，促进消化。
1.细胞复苏提前预冷离心机，设参数为4度，1000r/min,5min。
将枪头，装有离心管的饭盒，垃圾盒放入超净台，酒精棉擦一遍超净台台面和移液器尤其枪口，以防别人用枪时不慎沾染脏污堵塞枪口。
超净台和房间照15分钟紫外，照紫外的同时取出无血清培养基和含血清培养基37度水浴加热。
关闭紫外，打开风机，升高窗高，点燃酒精灯，用镊子从饭盒中取2个15ml离心管放至试管架，每管加入3ml无血清培养基，提前剪好2条封离心管的封口膜备用。
戴上橡胶手套再套上线手套，用镊子从液氮中取出塑料冻存管，用手拿冻存管迅速浸入37度水浴中，剧烈急速摇晃冻存管，因为有防水胶布缠裹不用担心进水染菌，使其急速融化，注意管内冻存细胞的融化情况。
基本转为液态时将冻存管取出，摘下线手套，冻存管转移至超净台内，用酒精擦手，擦拭冻存管尤其管口，撕下胶布和封口膜，再擦拭管口，整个溶解过程尽量在30s至1min内完成。
(注意：这一步对细胞存活率至关重要。
既要尽快融化以减少融化过程对细胞的损害，又要尽可能减少细胞在较高温度停留的时间以减少DMSO对细胞的毒害，切不可将冻存管放在烧杯内不管。
)打开冻存管管盖，逐滴加入1ml无血清培养基，轻柔地将冻存管内的细胞悬液吸取出来，转移至已备好的离心管内，轻轻摇混匀，盖上管盖，轻轻地上下颠倒混匀。
封上封口膜。
低俗离心1000r/min,5min。
小心地吸出上清液，要求上清液尽可能吸走，同时又不触及管底沉淀的细胞。
（较高要求时可以用手指轻弹离心管管底，将细胞团分散，加入10ml无血清培养基混匀离心10min 弃上清再洗一次，有助于减少DMSO残留。
）加3至5ml培养液至沉淀的细胞，轻轻摇晃使分散成细胞悬液，将细胞转移至培养瓶中，拧紧盖子，转移至培养箱中再反旋拧松半圈，以利于瓶口内外进行气体交换，注意取出培养瓶时须先拧紧瓶口。
37度恒温箱中培养。
第二天观察细胞生长情况。
培养基瓶盖过火，拧紧后封上封口膜。
收好物品，擦一遍台子，灭酒精灯。
2传代培养附着型胞(adherentcell)传代培养离心法提前预冷离心机，设置好参数4度，1000r/min,5min。
倒液法不需要。
将灭菌枪头，装有离心管的饭盒，新培养皿/瓶,垃圾盒放入超净台，酒精棉擦一遍超净台台面和移液器尤其枪口，以防别人用枪时不慎沾染脏污堵塞枪口。
超净台和房间照15分钟紫外，照紫外的同时从冰箱取出PBS,胰酶，含血清培养基于37度水浴加热。
关闭紫外，打开风机和照明，升高窗高，点燃酒精灯，将所需试剂先擦瓶底，放在台子上再擦侧壁一圈，擦瓶口瓶盖，撕下封口膜，再仔细擦一遍瓶口。
用喷过酒精的塑料筐将细胞培养瓶拧紧盖子拿到超净台旁的椅子上放平放稳，每三瓶/皿一摞拿入超净台先擦最下面一个的底部，擦好后放在台面上，擦一摞的侧面一圈，在分别擦底面顶面瓶口，直到所有培养瓶各个面及瓶口擦好，注意不要擦到有marker标记字迹的部位，酒精会擦掉字迹，若擦到字迹待酒精干后立即补写上以防事后记不清。
轻轻倒掉旧培养液，注意不要使液体倒流回来冲击细胞，挂在外壁的残留液滴用酒精棉擦掉,培养瓶可以轻轻翻转瓶子使细胞生长的面在上，顶面在下，液体留至顶面后直接倒掉液体。
加1ml PBS，注意枪冲着不长细胞的培养皿侧壁或翻转培养瓶朝瓶的顶壁或侧壁打入PBS，尽量不碰到瓶口或培养皿，若怀疑碰壁，弃掉枪头。
轻轻摇晃培养皿或瓶，使PBS沾到所有细胞，洗涤细胞一遍，轻轻倒掉PBS。
加入%胰蛋白酶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，若是高倍胰酶先稀释（%为1X胰酶），37℃作用数分钟。
等待消化期间准备好新的培养皿/瓶，每25cm2小皿/瓶加入2ml含血清培养基。
消化中的皿盖好盖子或瓶拧紧盖子，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状，有10%细胞漂动时，倒掉胰酶溶液，加入1ml(25cm2小皿/瓶)含血清之新鲜培养基终止胰酶作用。
(若细胞将要分离而呈现圆粒状且80%细胞漂动，则不移去胰酶，在胰酶作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止胰酶作用，吹打成细胞悬液转移至离心管，封上封口膜，离心后再吸掉上清液。
）轻轻摇晃培养瓶使细胞自瓶壁脱落，以吸管上下轻轻吸放数次以打散细胞团块，注意吹打时有系统性的将所有面积都打到不要集中只吹打一处而一些地方没吹打到，吸和吹时枪头都不要离开液面以减少气泡，气泡多破裂时对细胞有冲击且会增加体积不利于操作，培养瓶吹打时操作角度小不方便，用倒液法（10%细胞漂动即倒掉胰酶加含血清培养基终止消化）时吹打细胞要用二档多吹打几次，用皿或离心法（80%细胞飘动不弃胰酶直接加含血清培养基再离心弃上清）时细胞很容易脱落，可以用一档轻轻吹打，保证所有面积都吹打到即可。
混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，拧紧瓶盖，镜下观察细胞数量多，培养液澄清，若细胞密度过低将影响生长可适当补充细胞悬液，若细胞密度过大将影响迅速生长一天后即需传代，可根据实验适当添加培养基或细胞悬液使生长速度符合预期，转移至CO2培养箱，拧松半圈瓶盖，37度培养。
试剂瓶瓶盖过火，拧紧后封上封口膜。
密封收好物品。
擦一遍台子，灭酒精灯。
3细胞换液取待用的细胞，旋紧瓶盖。
弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。
用微量枪加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。
用微量枪加入适量的细胞培养液于培养瓶中。
旋紧瓶盖。
将细胞置于5%CO2、37度培养箱，反旋拧松瓶盖半圈，培养。
4细胞冻存1>准备工作：提前一天将血清FBS从-20度取出放在4度冰箱解冻。
选取对生增生期细胞（镜下密密麻麻，胞体突触明显），在收集细胞24h前换液一次。