实验2 乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药

K 0
K t 吸光度A
实验二
乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药
目前有机磷、氨基甲酸酯类农药是我国大量使用的杀虫剂，虽然这类农药与过去使用的有机氯农药相比，降解速度较快，但在果蔬中的残留仍然较为严重。

由于该类农药能抑制人体内乙酰胆碱酯酶的生理活性，神经传导因此受阻，引起神经麻痹乃至死亡，对人类健康造成极大危害。

对于果蔬中的农药通常采用气相色谱等方法进行分析，但分析时间长，操作步骤烦琐，适用于实验室分析。

长期以来在大部分果蔬市场中，通常采用乙酰胆碱酯酶抑制法进行快速检测，即以乙酰胆碱酯酶作为检测试剂，采用农药残留检测仪，根据乙酰胆碱酯酶活性变化的程度来测定果蔬样品中的残留农药。

一、 实验目的
1． 了解果蔬中残留农药的分析方法；
2． 掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法； 3． 理解农药残留性评价的意义。

二、 实验原理
有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，酶抑制法就是根据这一昆虫毒理学原理，对农药残留进行检测。

以乙酰胆碱为底物，在乙酰胆碱酯酶（ACHE ）的作用下，乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，胆碱和二硫双对硝基苯甲酸（DNTB ）产生显色反应，使反应液呈黄色（于410nm 处有最大吸收峰）。

根据酶促反应动力学原理，在没有有机磷和氨基甲酸酯类农药存在时，底物在酶的催化作用下发生水解，反应速率可以用吸光度值随时间的变化率K 0来表示。

当有机磷和氨基甲酸酯类农药加入到酶的显色体系中时，农药抑制了酶的活性，影响显色体系的反应速度，此时体系吸光度随时间的变化率为K t ，则有机磷和氨基甲酸酯类农药对酶的活性的抑制率Y 的计算公式如下：
%1000
0⨯-=
K K K Y t
K 0：空白样品的吸光度随时间变化曲线的斜率值
K t ：样品溶液的吸光度随时间变化曲线的斜
率值
其中K 0和K t 都可通过以下过程进行推导和计算。

在样品的测量过程，选取每隔等步长时间测定一次吸光度值，3分钟内共测定7个数据点。

设数据点如下
表：
t 1 2 3 4 5 6 7 A
A 1
A 2
A 3
A 4
A 5
A 6
A 7
则线性回归所得A ～t 曲线的斜率K 为：
2
22272176543212
2
)721(7
1
)721()
()721(71
)765432()(7171
+++-++++++⨯+++-++++++=
--
=
∑∑∑∑∑ A A A A A A A A A A t t A t A t K i i i i i i
28)
lg()lg(2)lg(328
)
lg()lg(2)lg(328
)
()(2)(35
362710
35002600170352617I I I I
I I I I I I I I
I I I I I I A A A A A A ++=
∙+∙+∙=-+-+-=
由此结果可以看出，K 值的求取可以不需要使用I 0值，即实验中不需要使用蒸馏水来校正I 0值，在光源具有稳定性的前提下（通过仪器的硬件电路实现），I 0值对测量结果不会有影响，这样就可以简化步骤，只用测出空白样品和实际样品溶液的光强I 1－I 7，计算出K 0和K t ，最后得出抑制率Y 值。

采用乙酰胆碱酯酶测定残留农药时，当酶完全水解底物乙酰胆碱时，溶液显黄色，其抑制率为0％，当酶活性被农药抑制而部分水解乙酰胆碱，测定溶液显淡黄色，出现相应的抑制率，当酶完全被农药抑制，测定溶液显无色，抑制率为100%，这样就可以建立起农药残留量与酶活性抑制率之间的关系。

因而可以通过测定抑制率的大小来显示农药残留的毒性程度。

样品的毒性等级分为：安全、低毒和高毒。

毒性等级和抑制率之间的关系如下：
表4-4 抑制率和毒性等级的关系
抑制率Y 毒性等级 < 20% 安全 20%～50% 低毒 > 50%
高毒
三、 仪器和试剂
1． 仪器
农药残留检测仪 1台 天平（0.01g ） 1台 组织捣碎机 1台 一次性手套 1双 金属镊子 1支 试管架 1个 移液管架 1个 20mL 离心试管 3支 10mL 具塞试管 4支 5mL 吸量管 5支 1 mL 吸量管 3支 （或移液枪（50-250μL ） 1套）
2． 试剂
提取液：将两袋粉剂倒入500mL 瓶内，加入510mL 蒸馏水，摇匀溶解后备用。

稀释液：将两袋粉剂倒入250mL 瓶内，加入100mL 蒸馏水，摇匀溶解后备用。

酶液：每瓶酶粉加2.6mL 稀释液，摇匀后置4℃备用，配好的酶液在4℃下可使用7天。

底物：每瓶底物粉剂中加入2.6mL 蒸馏水，摇匀后置4℃备用，配好的底物液在4℃下可使用3天。

冷冻保存可使用15天。

显色剂：将二袋显色剂粉剂混合瓶内，加入32mL 稀释液，摇匀溶解置4℃下备用。

四、 实验步骤 1. 样品预处理
戴上手套将蔬菜样品剪成约1cm 2，用天平准确称取1g 剪碎后的蔬菜样品放入20mL 离心试管中，；加入5mL 提取液浸没叶片，不断摇振5min ，静置20min 后，取上清液2.5mL 置于10mL 具塞试管中待用。

2． 样品测定
(1) 空白样品的测量：向1支10mL 具塞试管中依次加入2.5mL 提取液，0.1mL 酶液，0.1mL 显色
剂，混匀后将试管放入37℃水浴中放置15分钟，15分钟到达时，马上加入0.1mL 底物混匀，约1分钟后倒入比色皿中放入农药残留检测仪进行空白测定，记录3分钟内仪器显示的光强值I 1、I 2、I 3、I 4、I 5、I 6、I 7，计算K 0。

同时做3份平行样（每个样品至少间隔5min ，依次放入水浴中，记录时间）。

(2) 待测样品的测量：向盛有待测样品提取液的具塞试管中，依次加入0.1mL 酶液，0.1mL 显色剂
混匀，将试管放入37℃水浴中放置15分钟，15分钟到达时，马上加入0.1mL 底物混匀，约1分钟后倒入比色皿中放入农药残留检测仪进行测定，记录3分钟内仪器显示的光强值I 1’、I 2’、I 3’、I 4’、I 5’、I 6’、I 7’，计算K t 。

同时做3份平行样（每个样品至少间隔5min ，依次放入水浴中，记录时间）。

并且计算样品的抑制率Y ，判断毒性等级。

五、 数据处理
通过下列公式计算蔬菜样品的抑制率，并判断毒性等级。

K 0i 28
)lg()lg(2)lg(
35
36271I I I I
I I ++=
(i=1,2,3)
3
K K K K 3
020100++=
K ti 28
)'
'lg()''
lg(2)''lg(
3536271I I I I I I ++=
(i=1,2,3)
3
K K K K 3
t 2t 1t ++=
t
蔬菜样品的抑制率
%1000
0⨯-=
K K K Y t
六、 思考题
1． 果蔬中农药残留的分析方法有哪些？
2． 影响酶抑制法分析结果的主要因素有哪些？为什么？ 3． 影响农药残留性的因素有哪些？。