对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱
反相高效液相色谱法分离分析酯类混合物实验报告
反相高效液相色谱法分离分析酯类混合物实验报告
反相高效液相色谱法（RP-HPLC）是一种常用的酯类混合物的分离和分析方法。
以下是一份可能的酯类混合物分离实验报告：
一、实验目的
通过RP-HPLC方法对酯类混合物进行分离和分析。
二、实验原理
RP-HPLC是一种以氢键为主的静相色谱分离技术，适用于分离极性化合物。
对于酯类混合物的分离，采用C18静相色谱柱，以水和有机溶剂混合的流动相进行梯度洗脱，使不同极性的酯类在不同时间内出峰，从而得到纯净的目标酯类。
三、实验步骤
1. 准备样品
将酯类混合物称取 10 mg，溶解于 10 mL 甲醇中，摇匀并过滤得到样品。
2. 准备流动相
以甲酸为 pH 调节剂，加入适量的乙腈，稀释峰前或峰后的混合物，调节 pH 值，加入少量离子对阴离子等物质作为流动相。
3. 调整实验参数
将前体混合物进样器，选择 RP-HPLC 波长进行检测，调整流速为 1 mL/min，小球填充压力 15000 psi。
4. 进行分离分析
将前体混合物注入色谱柱，进行梯度洗脱，收集样品，测定各组分的峰面积。
四、实验结果
经过 RP-HPLC 的分离和分析，可以得到一组明显的峰，代表不同极性的酯类组分。
根据峰面积计算出各个组分的相对含量，并进行定量分析。
五、实验结论
通过反相高效液相色谱法分离和分析酯类混合物，可以得到纯净的目标酯类，为化学分析和应用提供基础数据和参考参量。
用高效液相色谱法测定对羟基苯甲酸酯类含量
１ ２ ７ 标 准工作溶液 ：分别 吸取 上述 贮备液 １ ｍ ，用 ５ ％乙醇溶液 ．． ＯＬ ０
定容至 １ Ｏ Ｌ，此溶液浓度 为 １ ０ １ ｇ ｍ 。再分别吸取 ０ Ｏｍ Ｏ ／ Ｌ ２ 、５ ０ １ 、 、１ 、 ５ ２ｍ ０ Ｌ，用 ５ ％乙醇 溶液 定容至 １ Ｏ Ｌ，标 准工作溶液浓 度分别为 ０ ０ ０ｍ 、５ 、
维普资讯
趁 验 方 法
紫 定
甲
的
类
效 液相 色谱 法 测定
基 苯 甲 酸 酯 类 合 星
口 陈枚 刘 洋 ／ 文
对 羟 基 苯 甲 酸 酯 即 尼 泊 金 酯 ， 主 要 品 种 有 对 羟 基 苯 甲酸 甲酯 、对 羟 基 苯 甲酸 乙酯 、 １ 实 验 部 分 ． １ １ 方 法 ．
优级纯
１２ ２ 乙醇溶液 ５ ％ ．． ０
Ｈ Ｌ ＰＣ
费 时 ，且 样 品 处理 不 当 ，对 羟 基 苯 甲酸 酯就 不 能 被 完 全 提 取 ，影 响 检 测 结 果 的准 确 性 。
另外 ，该 方法 采 用 气相 色 谱 法 ， 仪器 条 件较
１ ２ ４ 盐酸溶 液 １ ．． ：１ １ ． 标准物质 ：对 羟基苯 甲酸 乙酯 、对 羟基苯 甲酸丙酯 ；纯度 ≥ ２ ５
１４ 样 品处 理 ．
次取平均值 。 以对羟 基苯 甲酸酯浓度 为横
坐 标 ， 以 峰 面 积 为 纵 坐 标 ， 得 对 羟 基 苯 甲
酸 乙酯回归方程为 ｙ Ｏ ０ ８ ６ 一 ． ２ ，其 ＝ ．０９ ｘ０４ ２
相 关系 数 为 ０ ９ ９ 对 羟 基 苯 甲 酸 丙 酯 回 归 ．９８ 方 程 为 ｙ Ｏ ０ ９ ５ 一 ． ９ ，其 相 关 系 数 为 ＝．０ ７ｘ０ ３５
对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱分析
保留时间tR，并填于下表中：
组分名称 保留时间tR /min
3 ．测量未知试样色谱图上各组分的峰高 h ，半峰宽 Y1/2 ， 计算各组分的峰面积A及其含量wi，并将数据列于下表中：
出峰 顺序 组分 峰高 h/mm 半峰宽 Y1/2/mm 峰面积 含量 w i%
A
103.6 注意事项
（1）严格按照规定使用仪器，防止因错误操作造成
作流动相。
由于在一定的实验条件下，酯类各组分的保留值保 持恒定，因此在同样条件下，将测得的未知物的各组分 保留时间，与已知纯酯类备组分的保留时间进行对照， 即可确定未知物中各组分存在与否。
本实验采用归一化法定量，归一化法使用条件及计 算公式，与气相色谱分析法相同。而对羟基苯甲酸酯类 混合物属同系物，具有相同的生色团和助色团，因此它 们在紫外光度检测器上具有相近的校正因子，可用下式：
wi
ห้องสมุดไป่ตู้Ai
A
i 1
n
100 %
i
103.3 实验条件
溶液的配制
(1)标准贮备液：
配制浓度均为1000 μ g·mL-1的上 述四种酯类化合物的甲醇溶液
四只100 mL容 量瓶
(2)标准操作液：
上述四种 标准贮备液 配制浓度均为10μ g·mL-1的 四种酯类化合物的甲醇溶液 四只10 mL容 量瓶
（3）高效液相色谱分析的流动相为何要脱气，不脱
气对实验有何妨碍？
103.8 参考答案
（1）色谱定量分析采用归一化法定量有何优缺点 ?本
实验为什么可以不用相对质量校正因子?
答：归一化法的优点是：简便、准确，当操作条件 如进样量、流速等变化时，对结果影响小。但若试样中 的组分不能全部出峰，则不能应用此法。本实验样品为 同系物，若各组分的相对校正因子值相近，所以可以略
食品中对羟基苯甲酸酯类的检测方法
实验四高效液相色谱法检测食品中对羟基苯甲酸酯类苯甲酸、山梨酸和对羟基苯甲酸酯类是食品中常用的防腐剂，广泛存在于酱油、醋、化妆品中。
对羟基苯甲酸酯类有：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丁酯。
它们对食品均有防止腐败的作用，苯甲酸的杀菌、抑菌效力随介质的酸度增高而增强，在碱性介质中则失去杀菌、抑菌效力。
山梨酸是使用最多的防腐剂，也是酸性防腐剂。
对羟基苯甲酸酯类以丁酯的防腐作用最好，由于对羟基苯甲酸酯类都难溶于水，所以通常是将它们先溶于乙酸、乙醇、乙腈等强极性溶液中，然后使用，为更好发挥防腐作用，最好是将两种或两种以上的该酯类混合使用。
虽然在限量范围内食用上述防腐剂对人体影响不大，但若大量摄入，则会危害人体健康。
各国都对食品中可以使用的防腐剂种类和用量有严格的要求，如中国的GB2760《食品添加剂使用卫生标准》明确规定了使用范围和最大使用量。
不同商品中的最大限量：苯甲酸0.2-1g/kg（中），山梨酸0.2-1g/kg（中），甲酯1g/kg（中），乙酯0.1-0.25g/kg（中），丙酯0.012-0.2g/kg（中），丁酯0.25g/kg（日），异丁酯0.25g/kg（日）。
本方法可同时检测食品中上述8种防腐剂。
本实验检测溶液中对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯。
一、实验目的和要求1、学习高效液相色谱外标法定量定性分析方法；2、熟悉超高压液相色谱的分析操作规程；3、学习高效液相色谱检测食品中的防腐剂的方法。
二、实验原理在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸酯类，它们都是强极性化合物，可采用高效液相色谱进行分析。
以对羟基苯甲酸酯类标样保留时间定性，采用外标法定量对羟基苯甲酸酯类含量。
X=(A2×C)/A1（为样品中对羟基苯甲酸酯类的含量单位为ug/mL，单位；A1为标样对羟基苯甲酸酯类的峰面积；A2为样品中对羟基苯甲酸酯类峰面积；C为对羟基苯甲酸酯类标准液质量浓度。
食品中对羟基苯甲酸酯类的检测
食品中对羟基苯甲酸酯类的检测摘要：文章采用超声提取-高效液相色谱法同时测定食品中3种对羟基苯甲酸酯（对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯）含量的方法。
对羟基苯甲酸酯类属于防腐剂，按gb/t5009.31-2003国家推荐方法检测[1]，样品提取比较繁琐、费时，且回收效果欠佳。
本文利用较为常见的紫外检测器通过优化条件，摸索出一个简捷、快速、经济、灵敏，又能保证一定精度的测定方法。
本方法加标回收率在86.08%～112.71%之间，线性系数r>0.9998，检出限可达0.10ug/ml，分析时间短，完全能够满足分析要求，可广泛应用于食品中对羟基苯甲酸酯类检测分析。
关键词：对羟基苯甲酸酯类；高效液相色谱法中图分类号：o657.7+2 文献标识码：a 文章编号：1674-0432（2012）-10-0064-21 实验部分1.1 仪器和试剂1.1.1 仪器 shimadzu lc 10vp plus高效液相色谱系统（日本shimadzu公司），配紫外检测器及lc solution色谱工作站；分析天平：感量0.1mg；氮吹仪：美国organomation n-evap112型；均质机：ikar werke t25型均质机；溶剂过滤装置；0.45μm和0.22μm过滤膜和过滤头；milli-q超纯水机。
1.1.2 试剂甲醇、乙腈为hplc级；乙醇为分析纯；水为超纯水。
标准品：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯，纯度为99.0%，美国进口，购于上海安谱。
1.2 标准溶液的配制[2]标准贮备液：精密称取三种标准物质0.05g，用无水乙醇溶解并定容于50ml容量瓶中，配制成浓度为1mg/ml的标准贮备液，贮于4℃冰箱中备用。
标准使用液：用刻度吸管准确吸取三种标准贮备液，根据需要用无水乙醇配制成不同浓度的标准溶液系列，待用。
1.3 色谱条件色谱柱：diamonsil c18，粒度5μm，4.6mm×250mm（id×l）；检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；进样量：20 μl；流动相：水-乙腈（体积比为45：55）；柱温：室温。
高效液相色谱法测定酱腌菜中对羟基苯甲酸酯
Ｄｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｐ —ｈｙ ｄｒ ０ ｘ ｙ ｂ ｅ ｎｚ ０ ｉ ｃ ｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｓ
ｉ ｎ ｐ ｉ ｃ ｋ ｌ ｅ ｓ ａ ｎ ｄ ｓ ａ ｕ ｅ ｒ ｋ ｒ ａ ｕ ｔ ｓ ｂ ｙ ＨＰ ＬＣ
ＺＨＡＯ Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ—ｓ ｈ ｅ ｎ ｇ Ｚ ｈ ｏ ｕ ｋ ｏ ｕ Ｃｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｆ ｏ ｒ Ｄｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ Ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ａ ｎ ｄ Ｐ ｒ ｅ ｖ ｅ ｎ ｔ ｉ ｏ ｎ，Ｚ ｈ ｏ ｕ ｋ ｏ ｕ ，Ｈｅ ｎ ａ ｎ ４ ６ ６ ０ ０ ０，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ
摘要： 目的 建立高效液相色谱法测定酱腌菜中对羟基苯甲酸酯的检测方法。方法 样品经酸化 、 甲醇 一 水溶
液提取 ， 采用 高效 液相 色 谱 仪 Ｃ １ ８柱 分离 ， 紫 外 检 测器 测 定 。结果 标 准 曲 线线 性 范 围 ： ２ ． ０～ｌ Ｏ ０ ￣ ｇ ／ ｍ ｌ ， ｒ ：
ｓ ｉ ｏ ｎ ｓ Ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｒ ｅ ｖ ｅ ａ ｌ ｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｗ ａ ｓ ｓ ｉ ｍｐ ｌ ｅ ， ｒ ａ ｐ ｉ ｄ， ａ ｃ ｃ ｕ ｒ ａ ｔ ｅ ａ ｎ ｄ ｌ Ｏ Ｗ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｌ ｉ ｍｉ ｔ ， ｉ ｔ ｗ ａ ｓ ｓ ｕ ｉ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ｏｒ ｆ ｔ ｈ ｅ ｄ ｅ －
对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱分析
大
学
3．测量未知试样色谱图上各组分的峰高h，半峰宽Y1/2，
通 用
计算各组分的峰面积A及其含量wi，并将数据列于下表中：
化 学
实
验
出峰 顺序
组分
峰高
h/mm
半峰宽
Y1/2/mm
峰面积
A
含量
wi%
技 术
7/13
在线答疑： wy-fxhx@ lhfdlx@
对 反羟 相基 高苯 效甲 液酸 相酯 色类 谱混 分合 析物
的
大
学
通
103.6 注意事项
用
化
（1）严格按照规定使用仪器，防止因错误操作造成 学
实
仪器损坏。
验
技
（2）流动相使用前应用微滤膜过滤并充分脱气。
术
（3）样品溶液若不清澈透明，应用微滤膜过滤。
8/13
（4）实验结束后，应冲洗色谱柱30 min以上。
对 反羟
相基
高苯
效甲
液酸
相酯
色类
谱混
分合
析物
的
在线答疑： wy-fxhx@ lhfdlx@
四只10 mL容 量瓶
混匀 备用
对 反羟 相基 高苯 效甲 液酸 相酯 色类 谱混 分合 析物
的
大
色谱条件：
学
(1)色谱柱
长25 cm、内径3 mm 装填C-18烷基键合相
通 用 化
粒度为10 μm的固定相
学
实
验
(2)流动相
甲醇︰水=55︰45流量
技
1 mL·min-1
术
4/13
(3)检测器
紫外光度检测器检测波长
的
在线答疑： wy-fxhx@ lhfdlx@
食品中对羟基苯甲酸酯类的测定 高效液相色谱法
食品中对羟基苯甲酸酯类的测定高效液相色谱法1 范围本标准适用于酱油、醋、果酱、糕点、腌制品、果酒及饮料等食品中对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯。
本标准检出限：对羟基苯甲酸甲酯：1.8 mg/kg；对羟基苯甲酸乙酯：1.2 mg/kg；对羟基苯甲酸丙酯：0.9 mg/kg；对羟基苯甲酸丁酯：1.3 mg/kg。
2 规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
3 原理试样用乙醇超声波提取，取上清液过滤，以高效液相色谱法分离，二极管或紫外检测器检测，外标法定量。
4 试剂和材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
4.1 甲醇（色谱纯）。
4.2 乙酸铵（分析纯）。
4.3 20 mmol/L乙酸铵溶液：准确称取1.54 g乙酸铵（4.2）用水定容至1000 ml，过0.45μm 滤膜。
4.4 无水乙醇（分析纯）。
4.5 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯：99 %以上。
4.6 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯的标准储备溶液：准确称取对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯各0.050 g于50 mL容量瓶中，用甲醇（4.1）稀释至刻度，该溶液每毫升相当于1 mg的对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯。
4.7 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯的标准工作溶液：将混合标准溶液用甲醇（4.1）依次稀释成1.0 μg/ml、10.0 μg/ml、25.0 μg/ml、50.0 μg/ml、100.0 μg/ml的系列标准溶液，使用前配制。
实验十一 对羟基苯甲酸酯类物质的测定--HPLC法、GC---白酒中酒精度的测定
实验报告课程名称：环境监测实验实验类型：综合实验实验项目名称：对羟基苯甲酸酯类物质的测定--HPLC法、GC---白酒中酒精度的测定实验地点：环资B座实验日期：2018年12月06日一、实验目的和要求1.掌握HPLC的保留值定性方法与归一法定量2.熟悉液相色谱仪的操作过程二、实验内容和原理<对羟基苯甲酸酯类物质的测定--HPLC法>1.高效液相色谱HPLC：高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。
高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。
高效液相色谱法有“四高一广”的特点：高压、高速、高效、高灵敏度、应用范围广。
其组成包含“高压输液泵”、“色谱柱”、“进样器”、“检测器”、“馏分收集器”以及“数据获取与处理系统”等部分。
2.测定原理：在一定的实验条件下，组分的保留值保持恒定，测得的来知物的各纽分保留时间，与已知纯物质各组分的保留时间进行对照，即可确定未知物中各纽分存在与否。
这种利用纯物质对照进行定性的方法，适用于来源已知。
且组分简单的混合物。
3.归一法定量：要求试样中的各个组分都能得到完全分离。
并且在色谱图上应都能出峰，计算公式:c1=fiAi/ΣfiAi*100。
因为对羟基苯甲酸酯类属于同系物，它们在紫外光度检测器上具有相同的校正因子，故上式可简化为: c1=Ai/ΣAi*100< GC---白酒中酒精度的测定 >1. 气相色谱：气相色谱（gas chromatography 简称GC）是指用气体作为流动相的色谱法。
对羟基苯甲酸酯的HPLC分析2016
30
实验步骤——III
条件试验 II—流动相流速
猪肉中三聚氰胺和三聚氰酸的分析 三 聚 氰 胺 三 聚 氰 酸
25
定性定量分析的原理
• 用外标法定量：以不同量标准样品进样得
到峰面积，然后作图得标准曲线，求出回 归方程，得到相关系数。然后进样得到被 测试样的峰面积从曲线中查到含量。
• 方法适用于样品复杂，但只对部分组分感 兴趣时。
26
定性定量分析的原理
丁酯各10μL进样，记录各色谱峰保留时间，
与步骤III所得结果相比较，进行定性分析。
32
实验步骤——V
标准曲线制作
• 在最佳实验条件下，分别取25 μL混合标样
进样，以峰面积对浓度作标准曲线。
• 要求该曲线的相关系数大于0.99，如果不
满足则可对明显偏离的实验进行重测。
33
实验步骤——VI
未知试样测定
对羟基苯甲酸酯同系物的 HPLC分析
毛侦军 maozhenjun@
一、实验目的
1. 学习高效液相色谱仪器的基本使用方法。
2. 理解和掌握高效液相色谱分离分析基本原理。
3. 学会用外标法和校正归一化法进行色谱定量分析。
2
二、HPLC 简介
1967年，高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)正式问世。
3. 若实验获得的色谱峰面积太小，应如何改 善实验条件？ 4. 为什么HPLC多在室温下进行检测分离，而 GC要在相对较高的柱温下操作？
对羟基苯甲酸酯类混合物的液相色谱分析
对羟基苯甲酸酯类混合物的液相色谱分析液相色谱分析是一种常用的分离和定量化合物的方法。
在对羟基苯甲酸酯类混合物进行液相色谱分析时，需要选择合适的色谱柱、流动相和检测方法，以实现有效的分离和定量。
首先，选择合适的色谱柱非常重要。
对于羟基苯甲酸酯类混合物的分析，可以选择反相色谱柱。
反相色谱柱具有较好的选择性和分离能力，可以有效分离羟基苯甲酸酯类化合物。
在选择色谱柱时，需要考虑样品的性质、分析目标以及分离需求。
其次，选择合适的流动相也非常重要。
在反相色谱中，流动相通常是由有机溶剂和水组成的混合物。
不同的羟基苯甲酸酯类化合物对流动相的溶解度和解离常数有所不同，因此需要根据样品的特性来选择合适的流动相。
通常情况下，可以通过尝试不同比例的有机溶剂和水来找到合适的流动相条件。
同时，还可以探索其他添加剂如缓冲剂、pH调节剂来改善分离效果。
在液相色谱分析中，还需要选择合适的检测方法。
对羟基苯甲酸酯类混合物的定量分析，常用的检测方法包括UV-Vis吸收检测、荧光检测和电化学检测等。
UV-Vis吸收检测是最常用的检测方法之一，可以通过样品对紫外或可见光的吸收来定量分析。
荧光检测可以增强灵敏度，适用于分析浓度较低的样品。
电化学检测可以通过电化学信号（如电流、电势）来定量分析。
在进行液相色谱分析时，还需要优化一些实验条件来提高分离和定量的准确性和重复性。
例如，需要确定合适的进样量、流速和柱温等实验参数。
还可以采用梯度洗脱方法来进一步改善分离效果。
最后，在分析结束后，对数据进行处理和解释也是非常重要的。
可以使用标准曲线法来定量分析得到的色谱峰，通过峰面积或高度与标准品的浓度进行线性拟合，计算出样品中羟基苯甲酸酯类化合物的含量。
同时，还可以采用质谱联用技术对色谱峰进行鉴定和确认。
总之，对羟基苯甲酸酯类混合物的液相色谱分析需要选择合适的色谱柱、流动相和检测方法，并进行实验参数的优化和数据处理，以获得准确的分离和定量结果。
这些方法可以用于不同范围内的样品检测，如医药、环境和食品等领域的分析研究中。
大学资料仪器分析实验讲义-新编
仪器分析实验讲义实验项目一、醇类混合物的气相色谱分析 (2)二、液相色谱仪的基本操作及对物质的分离、定性鉴定--对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱分析... (5)三、酊剂中乙醇含量的气相色谱测定(已知浓度样品对照法) (7)四、乙酸的电位滴定分析及其解离常数的测定.............. . (9)五、氯离子选择性电极测定水中氯含量.............. (11)六、鉴定和识别有机化合物中的电子跃迁类型 (14)七、紫外-可见光谱法测定苯甲酸钠含量.............. .. (19)八、火焰原子吸收光谱法测定自来水中钙、镁的含量.............. . (21)醇类混合物的气相色谱分析一、实验目的（1）了解气相色谱仪的结构、各组成部分的作用及相互关系。
（2）熟悉仪器的一般使用方法，巩固色谱分析实验技术。
（3）了解定性鉴定的依据和方法的原理及方法；（4）熟练掌握微量进样器进样技术。
二、实验原理1、气相色谱仪流程（见下图）：图1 气相色谱仪流程图各种物质在一定的色谱条件(固定相与操作条件等)下有各自确定的保留值，因此保留值在色谱分析中可作为一种定性指标。
对于较简单的多组分混合物，若其中所有待测组分均为已知且它们的色谱峰均能分开，则可将混合物图谱中各个色谱峰的保留值与各相应的标准试样在同一条件下所得的保留值进行对照比较，就能确定各色谱峰所代表的物质，这就是纯物质对照法定性的原理。
该法是色谱分析中最常用的一种定性方法。
本实验即采用纯物质对照法对有机混合物中各组分进行定性鉴定。
三、仪器与试剂1.仪器天美GC-7900气相色谱仪（FID氢火焰离子化检测器）；氢气、空气发生器；氮气瓶，微量进样器(1µL)。
2.试剂甲醇、正丙醇均为分析纯；混和醇样四、仪器操作条件色谱柱：10%PEG-20M填充柱，3m(L)×4mm(OD)×3mm(ID)；进样量：1µL；柱温：140ºC；气化室温度：150ºC ；检测器：FID；检测器温度：200ºC；五、实验步骤1．启动计算机，打开色谱仪主机及空气、氮气发生器开关，打开载气输出压力为0.5Mpa，启动软件，根据分析要求设置柱箱、汽化室和检测器的工作温度。
对羟基苯甲酸酯类混合物的液相色谱分析
对羟基苯甲酸酯类混合物的液相色谱分析液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）是一种广泛应用于化学、生命科学以及环境监测等领域的分离和分析技术。
对羟基苯甲酸酯类混合物的液相色谱分析，主要应用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）进行分离和定量。
高效液相色谱是一种常见的液相色谱方法，通过应用高压将溶液推入柱中进行分离。
在对羟基苯甲酸酯类混合物进行液相色谱分析时，以下是一个可能的实验步骤：1.样品制备：将待分析的羟基苯甲酸酯类混合物溶解在合适的溶剂中，并进行必要的稀释。
2.色谱柱选择：选择适合分离目标化合物的色谱柱。
在HPLC中常用的色谱柱有反相柱、离子交换柱和正相柱等。
3.流动相制备：根据实际需要选择合适的流动相组分。
常用的流动相包括纯有机溶剂、水和其它缓冲液等。
4.色谱条件设置：设置合适的色谱条件，包括流速、柱温和检测器波长等。
这些条件通常需要根据待分析化合物的特性和色谱柱的要求进行优化。
5.样品进样：将样品加入自动进样器中，设定进样量并进行进样。
6.色谱分离：开启色谱仪，控制流速和柱温等条件，进行色谱分离。
在此过程中，目标化合物会在柱中与流动相发生相互作用，并在柱中保留一定的时间。
7.检测和定量：通过连接的检测器获得色谱图谱，并根据峰面积或峰高测定目标化合物的浓度。
选择合适的检测器可以根据化合物的性质来确定，常见的检测器包括紫外可见光检测器、荧光检测器和质谱检测器。
8.数据处理：利用色谱软件对得到的数据进行处理分析，生成峰面积、峰高、保留时间等结果。
需要注意的是，在实际的液相色谱分析中，可能需要对不同的样品进行前处理或者使用不同的溶剂体系进行优化。
同时，还需要注意校准曲线的制备和样品浓度的合理选择，以保证分析结果的准确性和可靠性。
总结起来，液相色谱是一种重要的分离和分析技术，对于对羟基苯甲酸酯类混合物的分析有着广泛的应用。
高效液相色谱法测定化妆品中对羟基苯甲酸酯类防腐剂
２ ｕｆ ｅＲｋ Ｈ Ｐａｏ－ｅｒ ｉ ｅ ｌ Ｋ ｉＮ ，ｉＭ ｒ ｔｓ ｔｄ Ｌ ｔ ｒｊ Ｄ ｊ Ａ ， ｎ ｏ ｏａｈ Ａ ． ａ
Ｊ ｒｍ ｔ ｒ １８ ；１ ：９ Ｃ ｏ ａ ｇ ， ９７４０３５ ｈ ｏ ３ ｃｍ ｈ Ｈ Ｈｅｅ ． ｎｌ ｍ， ９０３４３８ Ｓｈ ａｌ ， ｉ Ｅ Ａ ａ Ｃ ｅ １８；０ ：９ Ｊ ｋ Ｚ ｈ ４ ｉ ｎ ｅ Ｅ， ｅｓｏ Ｂ Ｓｈｅｂｒ Ｊ ｌ Ｊ ｓｃ Ｗｅ ｅｂｒ ｓ ｇ Ｇ ｒ ｎ ｃｏｎｅｇ ｔ Ａ ｏ ｈ ， ｅａ． ｓ
２ 实验部分 ２１ 仪器与试剂 ． Ｈ １９Ａ高效液相色谱仪；Ｙ ００ Ｐ００ Ｂ ３０ 型超声波 仪；Ｄ －型离心机。 ４ ２ 分析纯无水乙醇和硫酸； 色谱纯甲醇； 中性氧化 铝预柱（０－０ １０２０目）定量称取四种对羟基苯甲酸 ； 酯， 用无水乙醇配成 １ ｇｍ ｍ ／Ｌ的标准储备液； 准确 移取０５１０２０３０４０５０ Ｌ各标准储备液， ．、．、．、．、．、．ｍ
８ ｅａ ａ ａ ｏｏ ， ｗ ｄ Ｋ ａ．Ｊ ｈｏ Ｍａｄ Ｙ ，Ｙ ｍ ｍ ｔ Ｍ Ｏ ａａ ｅ ｌ ．Ｃ ｒ ｔ －
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对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱分析
对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱分析引言：羟基苯甲酸酯类化合物广泛应用于医药、农药、染料、涂料等领域。
分析羟基苯甲酸酯类混合物的组分和含量对质量控制和新产品研发具有重要意义。
反相高效液相色谱作为一种广泛应用的分析方法，能够有效分离和测定羟基苯甲酸酯类混合物。
一、反相高效液相色谱的原理反相高效液相色谱通过利用固定相相对于流动相的更强亲和性，通过分子大小、亲水性和亲油性的差异，实现混合物的分离。
反相色谱固定相通常是碳链比较长的疏水性物质，流动相是亲水性的有机溶剂和缓冲溶液。
二、反相高效液相色谱仪器和试剂的准备1.反相高效液相色谱仪器：常见的仪器有普通液相色谱仪和高压液相色谱仪，具体选择根据实验需要。
2.柱和固定相：反相高效液相色谱柱可选择C18柱，其主要成分是碳链较长的疏水性物质。
柱的长短和内径的选择应根据分析目的确定。
3.流动相：在反相高效液相色谱中，流动相通常为亲水性有机溶剂和缓冲溶液的混合物，比如乙腈/水和甲醇/水的混合物。
4.标准样品：准备一系列不同浓度的羟基苯甲酸酯类化合物的标准溶液。
标准样品的纯度以及溶解度要得到验证。
三、反相高效液相色谱方法的优化1.流动相组成的优化：通过试验确定最佳流动相体系，优化色谱条件。
2.流速的优化：试验确认最佳流速，保证分离和分析的准确性。
3.柱温的优化：试验确定最佳柱温，保证分离的效果和色谱峰形。
4.检测器选择：选择合适的检测器，根据实验要求确定检测器的灵敏度和线性范围。
四、反相高效液相色谱条件的确定1.建立标准曲线：根据一系列不同浓度的标准溶液，进行色谱分析，绘制出峰面积与浓度的线性关系曲线。
2.样品预处理：将待测样品进行提取或者稀释，以达到合适浓度的范围。
3.优化反相高效液相色谱条件：根据实验目的和样品特点，选择和优化最佳流动相、流速、柱温等条件。
五、反相高效液相色谱分析结果的处理和表达1.色谱峰面积的积分：根据色谱图中峰的面积大小，进行峰面积的积分。
反相高效液相色谱测定化妆品中几种防腐剂
反相高效液相色谱测定化妆品中几种防腐剂摘要：建立了反相高效液相色谱法测定化妆品中四种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的含量，并对相关的实验条件进行了优化：采用乙醇作为提取剂提取化妆品中的对羟基苯甲酸酯类防腐剂，色谱柱为Shimpack VP-ODS C18烷基柱（4.6mm i.d×150mm，5μm）；进样体积为5uL；流动相为乙醇：2%的醋酸水溶液=45：35（v/v）；流速为0.8ml/min；柱温为30℃；紫外检测器，检测波长是254nm。
实验结果表明在25~1000μg/mL浓度范围内各防腐剂的含量与色谱峰面积有良好的线性关系，线性回归方程分别为对羟基苯甲酸甲酯(MP) y=2.556224×10-5 x-4.237644；对羟基苯甲酸乙酯(EP) y=2.62564×10-5 x＋1.636635；对羟基苯甲酸丙脂(PP)y=2.704263×10-5x＋7.964306；对羟基苯甲酸丁酯(BP) y=3.016108×10-5 x＋1.567237。
相关系数分别为R2=0.9997、0.9999、0.9994、0.9999（n=5）。
回收率为88.748%－115.042%，平均回收率为98.448%。
相对标准偏差（n=6）分别为4.56%、0.95%、2.56%、1.04%，而所测各种防腐剂在3倍噪音下的最低检测限分别为：1.35×10-4ug、0.8×10-4ug 、0.77×10-4ug 和5.85×10-4ug。
该实验体现了反相高效液相色谱法简便、快速、稳定，能准确测定化妆品中对羟基苯甲酸酯类防腐剂的含量的优势。
关健词：反相高效液相色谱法；化妆品；防腐剂Determination of preservatives in Cosmetic Products byReversed-Phase High Performance Liquid ChromatographyAbstract：In this paper, RP-HPLC was used to measure the content of preservatives in cosmetics.In RP-HPLC method, on the relevant experimental conditions were optimized, such as :the use of ethyl alcohol as the extraction solvent extraction of cosmetics preservative Parabens; column system was alkyl Shimpack VP-ODS C18 column (4.6mm i.d × 150mm, 5μm); Injection volume was 5ul；Mobile phase of acetonitrile：2% acetic acid aqueous solution = 45：35 (v / v)；The flow rate was 0.8ml/min；The column temperature was 30 ℃；the detector was UV detector and its wavelength was 254nm.The results show that the concentration in the range of 25 ~ 1000μg/mL preservative content of each chromatographic peak area with a good linear correlation and their Linear regression equation were Methylparaben (MP) y=2.556224×10-5 x-4.237644；Ethylparaben(EP) y=2.62564×10-5x＋ 1.636635；Propylparaben(PP) y=2.704263×10-5x＋7.964306；Butylparaben(BP) y=3.016108×10-5x＋1.567237 and their calibration coefficients were about 0.9997、0.9999、0.9994、0.9999（n=5）.Method recoveries were parabens content recovery was 88.748% -115.042% and the average recovery was 98.448%. Experiments show that the relative standard deviation（n=6）were 4.56%、0.95%、2.56%、1.04% .Measured that each antiseptic's limits under 3 time of noises lowest examination were 1.35×10-4ug、0.8×10-4ug 、0.77×10-4ug and 5.85×10-4ug.So the RP-HPLC method is simple, fast, stable and accurate determination of Parabens in cosmetics preservative content advantage.Key words : RP-HPLC；cosmetics；preservative目录摘要： (I)Abstract： (II)1前言 (1)1.1目前化妆品使用的防腐剂 (1)1.2防腐剂的性质 (1)1.3防腐剂的危害 (2)1.4目前防腐剂检测方法及其不足 (2)1.5本文防腐剂检测方法的选择 (3)1.6本研究的目的与意义 (4)2实验部分 (5)2.1实验仪器 (5)2.2 实验试剂 (5)2.3 色谱条件 (6)2.4标准溶液的制备 (6)2.4.1标准储备液的配制 (6)2.4.2标准使用液的配制 (6)2.4.3标准混合使用液的配制 (6)2.5 化妆品样品的选取及处理 (6)2.5.1化妆品的选取 (6)2.5.2化妆品萃取方法的选取 (6)2.5.3化妆品的处理 (6)3结果与讨论 (6)3.1检测波长的选择 (6)3.2固定相的选择 (7)3.3流动相的要求与选择 (8)3.4最佳色谱条件下各标准防腐剂样品的色谱图 (9)3.5对羟基苯甲酸酯类标准曲线的制作及检出限 (10)3.5.1对羟基苯甲酸酯类标准曲线的制作 (10)3.5.2对羟基苯甲酸酯类的检测限 (11)3.6精密度实验 (11)3.7准确度实验 (12)3.8实际化妆品样品的测定 (13)3.9某些化妆品样品的测定色谱图 (13)4 结论 (14)参考文献 (16)致谢 ...................................................... 错误！未定义书签。
反相高效液相色谱法测定对羟基苯甲酸酯类
对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱测定一、实验目的⒈学习高效液相色谱用保留值定性和用归一化法定量的技术。
⒉熟悉高效液相色谱分析操作。
3.掌握用高效液相色谱法测定食品中防腐剂的含量。
二、实验原理高效液相色谱仪是一种色谱分析仪器，主要用于有机化合物的分析，可以对已知80%左右的有机化合物进行分离和分析。
特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质的分离和分析。
液相色谱仪在医药、食品、农业、生命科学、化工和环保等领域都有广泛的应用。
液相色谱分析方法实质上是一种物理化学分析方法，又称色层法或层析法。
它是利用不同物质在两相（固定相和流动相）中具有不同的分配系数和吸附能力及其他亲和作用性能的差异为分离依据，当混合物中各组分随流动相移动时，在两相中反复进行多次分配，从而使各组分得到分离。
流动相为液体的色谱分析叫做液相色谱分析。
根据分离原理的差异，液相色谱通常分为以下几种类型：液固吸附色谱、液液分配色谱、离子交换色谱和离子对色谱、凝胶色谱。
在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，它们都是强极性化合物，可采用反相液相色谱进行分析，选用非极性的C-18烷基键合相作固定相，甲醇的水溶液作流动相。
在一定的色谱条件下，酯类各组分的保留值是恒定的，因而在同样条件下，记录纯酯类各组分和未知样品的色谱图，将测得的未知样品的各组分保留时间与已知纯酯类各组分保留时间对照，便可确定未知样品中各组分存在与否。
这种利用纯物质对照定性分析的方法适用于来源已知且组分简单的混合物。
本实验采用归一化法定量。
归一化法适用条件及计算公式与气相色谱法相同： Ci（%）=(fiAi)/(ΣfiAi)在对羟基苯甲酸酯类混合物属同系物，具有相同的生色团和助色团，因此紫外光度检测器测量时，它们的校正因子相同，故上式便可检测为Ci（%）=Ai/ΣAi×100％三、仪器和试剂仪器：高效液相色谱仪LC-20aT试剂：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、甲醇、水（GB/T 6682规定的一级水）、乙酸铵（分析纯）实验条件1 色谱柱：长15cm、内径3mm，装填C-18烷基键合相、颗粒度为10um的固定相。
食品中对羟基苯甲酸酯类的检测方法
实验四高效液相色谱法检测食品中对羟基苯甲酸酯类苯甲酸、山梨酸和对羟基苯甲酸酯类是食品中常用的防腐剂，广泛存在于酱油、醋、化妆品中。
对羟基苯甲酸酯类有：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丁酯。
它们对食品均有防止腐败的作用，苯甲酸的杀菌、抑菌效力随介质的酸度增高而增强，在碱性介质中则失去杀菌、抑菌效力。
山梨酸是使用最多的防腐剂，也是酸性防腐剂。
对羟基苯甲酸酯类以丁酯的防腐作用最好，由于对羟基苯甲酸酯类都难溶于水，所以通常是将它们先溶于乙酸、乙醇、乙腈等强极性溶液中，然后使用，为更好发挥防腐作用，最好是将两种或两种以上的该酯类混合使用。
虽然在限量范围内食用上述防腐剂对人体影响不大，但若大量摄入，则会危害人体健康。
各国都对食品中可以使用的防腐剂种类和用量有严格的要求，如中国的GB2760《食品添加剂使用卫生标准》明确规定了使用范围和最大使用量。
不同商品中的最大限量：苯甲酸0.2-1g/kg（中），山梨酸0.2-1g/kg（中），甲酯1g/kg（中），乙酯0.1-0.25g/kg（中），丙酯0.012-0.2g/kg（中），丁酯0.25g/kg（日），异丁酯0.25g/kg（日）。
本方法可同时检测食品中上述8种防腐剂。
本实验检测溶液中对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯。
一、实验目的和要求1、学习高效液相色谱外标法定量定性分析方法；2、熟悉超高压液相色谱的分析操作规程；3、学习高效液相色谱检测食品中的防腐剂的方法。
二、实验原理在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸酯类，它们都是强极性化合物，可采用高效液相色谱进行分析。
以对羟基苯甲酸酯类标样保留时间定性，采用外标法定量对羟基苯甲酸酯类含量。
X=(A2×C)/A1（为样品中对羟基苯甲酸酯类的含量单位为ug/mL，单位；A1为标样对羟基苯甲酸酯类的峰面积；A2为样品中对羟基苯甲酸酯类峰面积；C为对羟基苯甲酸酯类标准液质量浓度。
色谱—固相萃取-高效液相色谱法测定食品中6种对羟基苯甲酸酯12.18
固相萃取－高效液相色谱法测定食品中6种对羟基苯甲酸酯王萍亚，周勇，陈皑，黄鹂，赵华，张薇英(国家海洋食品质量监督检验中心, 浙江舟山316021)摘要：建立了固相萃取－高效液相色谱法（SPE-HPLC）同时测定食品中6种对羟基苯甲酸酯（对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯、对羟基苯甲酸丁酯）含量的方法。
考察了2种不同提取液和3种不同流动相体系对6种对羟基苯甲酸酯分析的影响，最终分别选择乙醇和甲醇－柠檬酸缓冲液为提取剂和流动相。
样品提取液经Oasis HLB固相萃取柱净化和甲醇定容后，紫外检测器258 nm处测定。
结果表明，6种对羟基苯甲酸酯在0.1 ~ 20.0 mg/L范围内呈现良好线性关系，各组分的检出限分别为0.1 mg/kg、0.1 mg/kg、0.1 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg和0.2 mg/kg（S/N=3），不同剂量的加标回收率为82.8% ~ 115.5%，相对标准偏差（RSDs）为0.2% ~ 6.8%。
该方法简便、快速、灵敏，准确度和重现性较好，可作为食品中测定多种对羟基苯甲酸酯类添加剂的有效方法。
关键词：对羟基苯甲酸酯；食品；高效液相色谱法中图分类号：O658 文献标识码：A文章编号：栏目类别：研究论文Determination of 6 p-Hydroxybenzoates in Food Using Solid PhaseExtraction-High Performance Liquid ChromatographyWANG Ping-ya, ZHOU Yong, CHEN Ai, HUANG Li, ZHAO Hua, ZHANG Wei-ying(National Marine Food Quality Supervision and Testing Center, Zhoushan, Zhejiang 316021, China) Abstract: A methd was developed for determination of 6 p-hydroxybenzoates (methyl p-hydroxybenzoate, ethyl p-hydroxybenzoate, isopropyl p-hydroxybenzoate, propyl p-hydroxybenzoate, isobutyl p-hydroxybenzoate and butyl p-hydroxybenzoate) in foods using the combination of solid phase extraction (SPE) and high performance liquid chromatography (HPLC). Two different extraction solution and three different mobile phase were tested for p-hydroxybenzoates analysis, and finally ethanol and methanol-citric acid solution were selected as optimal. Samples were extracted with ethanol solution and purified by Oasis HLB solid-phase extraction cartridge. p-hydroxybenzoates were redissolved in methanol and determined by UV-detection at wave length of 258 nm. Results showed that the calibration graphs was linear in the concentration rang of 0.1 ~ 20.0 mg/L. The limits of detection were 0.1 mg/kg for methyl p-hydroxybenzoate, ethyl p-hydroxybenzoate, isopropyl p-hydroxybenzoate, propyl p-hydroxybenzoate and 0.2 mg/kg for isobutyl p-hydroxybenzoate, butyl p-hydroxybenzoate（S/N=3）. The average recoveries were between 82.8% ~ 115.5% with relative standard deviations（RSDs）of 0.2% ~ 6.8%. The method is simple, rapid, sensitive, accurate and reproducible. It can be used for the routine analysis of the p-hydroxybenzoates in foods.Key words: p-hydroxybenzoates; food; high performance liquid chromatography（HPLC）防腐剂是食品生产、加工、储存等过程中广泛使用的一类化合物，它们能够抑制微生物的繁殖，以达到延长食品保质期目的，如苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸酯类等[1-2]。
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对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱
一目的要求：
1 学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量；
2 熟悉高效液相色谱仪的结构；
3 熟悉高效液相色谱分析操作（流动相的设置、检测波长的设置、运行时间设置、保留时间和峰面积的获取）。
二基本原理
在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，它们都是强极性化合物，可采用反相液相色谱进行分析，选用非极性的C-18烷基键合相作固定相，甲醇的水溶液作流动相。
由于在一定的实验条件下，酯类各组分的保留值保持恒定，因此在同样条件下，将测得的未知物的各组分保留时间，与已知纯酯类各组分的保留时间进行对照，即可确定未知物中各组分存在与否。
这种利用纯物质对照进行定性的方法，适用于来源已知，且组分简单的混合物。
本实验采用归一化法定量，归一化法使用条件及计算公式，与气相色谱分析相同：
对羟基苯甲酸酯类混合物属同系物，具有相同的生色团和助色团，因此它们在紫外光度检测器上具有相近的校正因子，故上式可简化为：
三实验主要仪器和试剂
LC-2010A高效液相色谱仪（日本岛津）配紫外检测器，色谱柱：日本岛津公司（Shim-pack VP-ODS，150mm×4.6mm，5μm）
试剂：1．对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、甲醇等均为分析纯；二次蒸馏水
标准溶液的配制：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯用甲醇作溶剂分别配制成1000μg/mL标准贮备液；用甲醇稀释成10μg/ml标准工作液；标准混合工作液分别含四种酯类化合物10μg/mL的甲醇溶液。
（浓度仅供参考，记录实验中具体使用的浓度）
四实验条件（3、4、5仅供参考，记录实验中具体的操作条件）
1．色谱柱：日本岛津公司（Shim-pack VP-ODS，150×4.6mm，5μm），
2．检测器：紫外光度检测器，检测波长254nm
3．流动相：甲醇：水(Ｖ１：V2)，流量1mL/min（以在混合试样中能分开）
4．进样量：5μL
5．柱温：30℃
五、实验步骤
1．在淋洗瓶中装入足够量的甲醇和水，分别脱气5min；
2．根据实验条件，设定各操作条件的参数，然后开始走基线，待仪器液路和电路系统达到平衡时，记录仪基线呈平直，即可进样。
3．依次分别吸取5 L的四种标准工作液及标准混合工作液和未知试液进样，记录各色谱图，并各重复1次。
在每次进样后，于进样信号附近标明进样溶液名称。
六数据记录及处理
1．记录实验条件
(1) 色谱柱：日本岛津公司（Shim-pack VP-ODS，150×4.6mm，5μm），
(2) 流动相：
(3) 检测器：
(4) 进样量：
(5) 柱温：
2．测量四种对羟基苯甲酸酯化合物色谱图的保留时间t R，并填于下表1。
表1 四种对羟基苯甲酸酯化合物的保留时间
3．依次测量标准混合液色谱图上各色谱峰的保留时间t R（min）值，并填入表2，然后与上表中h值对照，确定各色谱峰代表何种化合物。
表2 未知试样色谱图
七思考题
1．归一化法定量的使用条件？本实验为什么可以采用归一化法定量？
2．在高效液相色谱中，为什么可利用保留值定性？这种定性方法你认为可靠吗?
3．本实验为什么采用反相液相色谱，试说明理由。
4. 本实验中怎样调整流动相的比例改变保留时间，举例说明。