对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱

对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱

一目的要求：

1 学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量；

2 熟悉高效液相色谱仪的结构；

3 熟悉高效液相色谱分析操作（流动相的设置、检测波长的设置、运行时间设置、保留时间和峰面积的获取）。

二基本原理

在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，它们都是强极性化合物，可采用反相液相色谱进行分析，选用非极性的C-18烷基键合相作固定相，甲醇的水溶液作流动相。

由于在一定的实验条件下，酯类各组分的保留值保持恒定，因此在同样条件下，将测得的未知物的各组分保留时间，与已知纯酯类各组分的保留时间进行对照，即可确定未知物中各组分存在与否。这种利用纯物质对照进行定性的方法，适用于来源已知，且组分简单的混合物。

本实验采用归一化法定量，归一化法使用条件及计算公式，与气相色谱分析相同：

对羟基苯甲酸酯类混合物属同系物，具有相同的生色团和助色团，因此它们在紫外光度检测器上具有相近的校正因子，故上式可简化为：

三实验主要仪器和试剂

LC-2010A高效液相色谱仪（日本岛津）配紫外检测器，色谱柱：日本岛津公司（Shim-pack VP-ODS，150mm×4.6mm，5μm）

试剂：1．对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、甲醇等均为分析纯；二次蒸馏水

标准溶液的配制：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯用甲醇作溶剂分别配制成1000μg/mL标准贮备液；用甲醇稀释成10μg/ml标准工作液；标准混合工作液分别含四种酯类化合物10μg/mL的甲醇溶液。（浓度仅供参考，记录实验中具体使用的浓度）

四实验条件（3、4、5仅供参考，记录实验中具体的操作条件）

1．色谱柱：日本岛津公司（Shim-pack VP-ODS，150×4.6mm，5μm），

2．检测器：紫外光度检测器，检测波长254nm

3．流动相：甲醇：水(Ｖ１：V2)，流量1mL/min（以在混合试样中能分开）

4．进样量：5μL

5．柱温：30℃

五、实验步骤

1．在淋洗瓶中装入足够量的甲醇和水，分别脱气5min；

2．根据实验条件，设定各操作条件的参数，然后开始走基线，待仪器液路和电路系统达到平衡时，记录仪基线呈平直，即可进样。

3．依次分别吸取5 L的四种标准工作液及标准混合工作液和未知试液进样，记录各色谱图，并各重复1次。在每次进样后，于进样信号附近标明进样溶液名称。

六数据记录及处理

1．记录实验条件

(1) 色谱柱：日本岛津公司（Shim-pack VP-ODS，150×4.6mm，5μm），

(2) 流动相：

(3) 检测器：

(4) 进样量：

(5) 柱温：

2．测量四种对羟基苯甲酸酯化合物色谱图的保留时间t R，并填于下表1。

表1 四种对羟基苯甲酸酯化合物的保留时间

3．依次测量标准混合液色谱图上各色谱峰的保留时间t R（min）值，并填入表2，然后与上表中h值对照，确定各色谱峰代表何种化合物。

表2 未知试样色谱图

七思考题

1．归一化法定量的使用条件？本实验为什么可以采用归一化法定量？

2．在高效液相色谱中，为什么可利用保留值定性？这种定性方法你认为可靠吗?

3．本实验为什么采用反相液相色谱，试说明理由。

4. 本实验中怎样调整流动相的比例改变保留时间，举例说明