微生物蛋白质组学的定量分析

微生物蛋白质组学的定量分析

王敬强　殷剑宁　刘斯奇3

(中国科学院遗传与发育生物学研究所基因组信息学中心,北京101300)

摘要　越来越多的微生物基因组序列数据为系统地研究基因的调节和功能创造了有利条件.由于蛋白质是具有生物功能的分子,蛋白质组学在微生物基因组的功能研究中异军突起、蓬勃发展.微生物蛋白质组学的基本原则是,用比较研究来阐明和理解不同微生物之间或不同生长条件下基因的表达水平.显而易见,定量分析技术是比较蛋白质组学中急需发展的核心技术.对蛋白质组学定量分析技术在微生物蛋白质组研究中的进展进行了综述.

关键词　微生物,蛋白质组学,定量分析

学科分类号　Q51

在基因组研究热潮的推动下,蛋白质组学正在从一个符号变成一门蓬勃发展的严肃学科.但是,它所面临的技术瓶颈区域却日益尖锐地摆在研究者面前[1].因此实现蛋白质组学的技术革命是学科是否健康发展的基本前提.

大规模基因组序列测定的目的在于精确地了解某一生物体的基因结构以及基因数量.蛋白质组的分析则着重于阐明某一生物体的某一组织或某一细胞,甚至是某一细胞器在某一时间点上基因表达的水平.因而,在基因组已经确定的前提下,蛋白质组分析所关心的问题是基因表达量的“有与无”或“多与少”[2].蛋白质组表达差异分析的主要问题是如何合理地比较蛋白质组之间的差别,即如何分析不同细胞或不同时刻之间各种蛋白质表达的相对丰度.因此建立一套稳定的参照系统和一套普通适合的测定度量是非常关键的.由此可见,定量测定是蛋白质组分析的一个核心技术问题.

分子生物学和基因组学的发展均以简单生物系统作为突破口,蛋白质组研究也概莫能外.微生物体作为一种理想的生物材料,已被广泛地应用于这些研究中[3].对研究蛋白质组的分析技术而言,微生物具有以下突出的特点:a1微生物的基因组比较小,基因和细胞器结构相对简单,并且蛋白质修饰水平较为低下,因此微生物细胞蛋白质组所含的蛋白质数量比其他高级生物系统要少得多.b1微生物的培养条件可以严格地控制,因此可以在设计的实验条件下,观察微生物蛋白质组表达水平的变化;c1在微生物研究领域中,细胞学、分子生物学和基因组学已经积累了丰富的数据,这些构成了蛋白质组研究的坚实基础;d1微生物的实验周期短,取材简单、便宜.这些都是开发分析技术的理想条件.

蛋白质组定量的概念是试图准确地测定蛋白质组间相对含量的差别,而不在于测定其绝对浓度.根据蛋白质组分析的手段,定量方法可大致分为电泳定量法和色谱定量法;根据处理蛋白质方法不同,又可分为体外标记法(labeling i n vit ro)和体内标记法(labeling i n vivo).

1　体外标记的电泳定量法

这种定量法一般采用不同的蛋白质显色剂,将电泳分离的蛋白质染成可被肉眼或机器识别的斑点,然后运用图像分析软件定量比较斑点的吸光度差别.

111　直接染色比较法

虽然双向电泳(two2dimensional electrophoresis, 2DE)并非一种理想的定量分析系统,但是它可以直观地反映蛋白质表达的差异.考马斯亮蓝染色法和银染法是两个普遍使用的染色方法.考马斯亮蓝染色的敏感性较差(约100ng),银染的敏感性虽然较高(1～10ng),但它的浓度动力学范围较窄.因此这两种方法不适合于相对严格的定量分析比较.目前公认的理想方法是荧光染色,最常用的是Molecular Probe公司生产的SyPro Ruby.这种试剂在敏感性(100fmol)和动力学方面(103)都基本可以满足蛋白质组定量分析的要求[4].传统的以双向电泳(2DE)为基础的差异蛋白组分析分为

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两步:a 1不同的样品在不同的胶上进行分离、染色,并进行吸光度定量;b 1运用图像分析软件比较不同的胶图,找出吸光度有差异的蛋白质点.目前最常用的双向电泳图像分析软件有Biolmage 2D Investigator ,ImageMaster 22D Elite ,Melanie 和PDQuest.然而,斑点吸光度的定量仍然是一个很困难的步骤,这大部分是由2DE 技术的不足引起.因为即使是同一样品的平行实验,要完全保持平行胶图中吸光度的一致性也是很困难的.因此,每个

样品必须作几个平行实验以计算每个点的平均值,尽量减少实验的误差.此外,胶点的匹配,也经常会出错,必须进行手动的校正.总之,多个平行实验和胶图的匹配,使得样品的差异比较成了一个费时、费力的过程.112　荧光双向差异凝胶电泳法

为了解决胶图间的比较问题,人们发明了一种荧光标记与双相电泳相结合的技术———荧光双向差异凝胶电泳法(fluorescence two 2dimensional differential gel electrophoresis ,DIGE )[5],将待比较的蛋白质样品预先经不同的花菁染料(如Cy2,Cy3,Cy5)标记后,等量混合进行电泳.蛋白质之间的差异可以通过蛋白质斑点不同荧光信号的比率来决定,因此可以直接从一张胶图上得到差异点(图1).与传统的差异比较相比,DIGE 是在同一块胶上分析两个不同的样品,然后通过分别显色来显示差异.由于样品出自于同一胶图,能够重叠,

Fig 11　Fluorescence tw o 2dimensional differential gel

electrophoresis (DIGE )

图1　荧光双向差异凝胶电泳比较法(DIGE )

可以直接用于比较.因此蛋白质重现性与2DE 系统无关.为确保这种方法的准确度,可以在不同的样品中加入同一种蛋白质,作为内标.利用荧光双向差异凝胶电泳,可以进行各种微生物蛋白质组的差异分析.113　免疫测定法

利用免疫化学的特点定量分析蛋白质是一类相当成熟的技术,如蛋白质印迹(Western blot ),酶联免疫吸附测定(EL ISA ).这种方法应用于蛋白质组分析的关键问题是能否找到一类广普性识别的抗体.革兰氏阴性细菌Helicobacter pylori 是一种病原体.它侵入胃粘膜引起发炎,可导致胃溃疡乃至胃癌.H.pylori 感染人体,会引起免疫反应,产生抗体.受感染的病人血液中就会含有若干抗H.pylori 蛋白质的抗体.利用这一特点,Haas 等[6]成功地找到了H.pylori 与胃疾病相关的直接证据.他们取H.pylori 细菌提取液做几组平行的双向电泳实验,一组银染作为对照胶,胶点进行定量分析和质谱鉴定;另一组电转至几块聚偏二氟乙烯(PVDF )膜.然后把PVDF 膜分别与正常人、胃溃疡患者和胃癌患者的血清共孵育,与抗体结合的蛋白质再用第二抗体显色检测.最后,比较银染图谱和免疫图谱,就可以判断何种疾病与H.pylori 的感染相关.在H.pylori 感染的与胃癌相关的免疫蛋白质组学研究中,该小组报告得到了32种抗原(9种新发现的抗原,其余23种已被其他的研究证实).采用类似的策略,K ornilovska 等[7]将Helicobacter 的细胞提取物直接注射至兔子体内,然后用免疫的兔血清在细菌蛋白质的2DE 2PVDF 膜上筛选高抗性的抗原,找到了若干个具有

临床检验意义且免疫活性的Helicobacter 蛋白质.

2　体内标记的电泳定量法

这种定量法一般采用不同的同位素标记物,直接将其加入到微生物的培养液中,参与细胞的蛋白质合成.电泳之后,分离的蛋白质用放射自显影方法检测并加以定量分析.211　单种同位素标记法

将35S 甲硫氨酸掺入到蛋白质合成中的方法,是一种广泛应用于细菌蛋白质研究体内蛋白质代谢的经典方法,将不同微生物分别与含有35S 甲硫氨酸的培养液孵育一段时间,提取细胞蛋白质进行双向电泳分离.分离的蛋白质同时用银染和放射性自显影检测,依据相对密度测定蛋白质表达的高低.