病毒的分离鉴定

病毒的分离与鉴定

要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则：

①从患病者体分离出病毒；

②在实验动物或寄主细胞中可以培养；

③证明这种培养物具有滤过性；

④在原始宿主或相关种属能产生同样的病症；

⑤能重新分离出病毒。

1.病毒的分离

1.1标本的处理

1.1.1标本的收集

a)粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小

珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。

b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的

液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g 4℃离心30min。

c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的

PBS制备成20%的悬液，3000×g 4℃离心30min。

1.1.2 除菌处理

a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。

b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用4

小时。

c) 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、

痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。

1.2 病毒的分离培养

病毒是严格的细胞寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。

1.2.1 鸡胚接种

a) 鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以的受精卵以保证规格质量上

的一致 。

b) 孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱进行,气室向上，孵育的最适温度

为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。

c) 检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二

天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。

d) 接种：

图3. 尿囊腔接种用9～12天鸡

胚，将标本接种于尿囊腔, 孵育后

取尿囊液检查, 常用于培养流感

病毒和腮腺炎病毒等。

图4. 绒毛尿囊膜接种：用10～l 2

天鸡胚，以无菌手续在蛋壳上开

—小窗，然后将材料滴在绒毛尿

囊膜上．孵育后。观察膜上有无

斑点病变。常用于培养单纯疱疹

病毒、天花病毒和痘病毒。

e)剖检及收获

收获前鸡胚应置4℃冰箱

过夜，使鸡胚血液凝固。收获时，

用碘酒将气室部卵壳消毒，将气室处卵壳剥去（不要将碎片落入壳膜）。然后用无菌手术刀柄从胚胎背部轻轻下压，（切勿压破卵黄囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉素小瓶，于低温保存。

f)优缺点

优点：技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大、不需特殊设备。缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。

1.2.2 细胞培养

细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至2～4个细胞团悬液进行培养。根据细

胞的类型和培养细胞代数的不同，可将其分为两种：原代细胞培养；传代细胞培养。

组织细胞培养的病毒，当出现稳定的细胞病变后，就可取培养液或培养液与细胞培养物混和物，细胞培养物中的病毒可采用冻融、超声波等方法使其释放出来。优点：

a)每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等；

b)无个体差异，准确性和重复性好；

c)可严格执行无菌操作；

d)细胞培养本身就能显示病毒的生长特征；

e)应用空斑技术可进行病毒的克隆化。

2.病毒的鉴定

2.1形态学鉴定

细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）：病毒在细胞增殖后，可引起细胞的不同变化。常见的形态学改变如细胞圆缩、聚合、溶解或脱落。CPE出现的时间是鉴定病毒的标志之一。

某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化，在普通光学显微镜下可见胞浆或胞核出现的呈嗜酸性或嗜碱性染色、大小数量不等的圆形或不规则形的团块状结构，病毒学上称为包涵体。

2.2血吸附和血凝作用

多见于以出芽方式释放的病毒。血吸附指感染细胞具有吸附红细胞的能力；血凝作用指感染细胞的培养液中有许多游离病毒存在，具有凝集红细胞的作用。

2.2.1血吸附实验

具有血凝能力的病毒能使感染的细胞吸附红细胞，这种现象被称作吸附作用。大多数粘液病毒能引起吸附。具体检验步骤如下：

a)用PBS配制10%的豚鼠红细胞悬液，4℃保存，用前按需要量稀释

成0.5%的浓度（10%悬液1ml加19ml PBS混匀）。

b)吸去对照和试验管培养细胞的上清液，试验管的上清液留待电镜

观察。

c)每管加入0.2ml红细胞悬液，4℃孵育30min。用4℃的PBS清洗

培养细胞3次。

d)显微镜下读取结果并记录，根据吸附红细胞的量可分为0（阴性）

~4（完全吸附）级。

e)37℃孵育60min，有神经氨酸酶的病毒将会从红细胞上游离下来。

2.2.2血凝实验

a)在血凝板第一排的1~12孔加入50μl生理盐水。

b)在第1孔中加入50μl病毒，混匀后吸50μl到第2孔，如此倍

比稀释直到第10孔，混匀后弃50μl；最后两孔（11、12）为红细胞对照。

c)将1%的红细胞轻轻摇动混匀，在1~12孔中每孔加入50μl。

d)手工震荡，37℃静置30min（室温40min）后观察结果。