硫酸铜对斑马鱼胚胎发育的影响

中国海洋大学实验报告

年月日姓名：专业年级：同组者：

课程：发育生物学实验题目：硫酸铜对斑马鱼胚胎发育的影响

一．【实验目的】

1、锻炼独立开展科学实验、分析和解决实际问题的能力；

2、加深环境对动物受精及早期发育影响的理解

二.【实验原理】

重金属污染是近年渔业环境污染的公害之一。随着工农业的发展，浓度严重超标的一些重金属离子被排入水体而造成污染，对鱼类有毒害作用。目前水体中的重金属主要有Cd、Cu、Pb、Zn等。其中Cu离子就具有较强的毒性，可以和蛋白质中游离的羧基形成不溶性的盐，使蛋白质变性，因此常被用作杀菌剂。

斑马鱼（Danio rerio）是常见的暖水性（21~32℃）观赏鱼，鲤科,个体小（4~5㎝），常年产卵，鱼卵易收集，性成熟周期短且胚胎透明，便于观察药物对其体内器官的影响。雌性斑马鱼可产卵200枚，胚胎在24小时内就可发育成形，繁殖水温24℃时，受精卵经2~3天孵出仔鱼；水温28℃时，受精卵经36小时孵出仔鱼，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验，进而研究病理演化过程并找到病因。由于斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视。

在斑马鱼的整个生活周期中，胚胎期和仔稚幼鱼早期发育阶段对重金属污染最为敏感。据报道，波罗的海春天产卵的鲱鱼，在10 ppb 的Cu2+，水的盐度为5.7条件下即对它的受精和发育有影响。30 ppb的Cu2+引起大西洋鲱鱼（Clupea harengus）卵的死亡，而35 ppb 的Cu2+也使太平洋鲱鱼（C.pallasi）的胚胎发生大量死亡[1]。吴玉霖等1990年依据不同金属对褐牙鲆胚胎的滞育、致畸、成活率及孵化率的综合影响指际，得出5种金属对褐牙鲆胚胎的毒性大小顺序为：Cu2+>Zn2+>Cd2+>Pb2+>Cr3+,对仔鱼的毒性大小顺序为Cu2+>Cd2+>Zn2+>Pb2+>Cr3+ [2]。

三.【实验步骤】

1、实验材料

斑马鱼囊胚、CuSO4为分析纯，充分曝气的去离子水、24孔细胞培养板、恒温培养箱、用充分曝气的蒸馏水配置成浓度为5 mg/L 的CuSO4母液，用时稀释。.

2、实验方法

1）硫酸铜浓度梯度的设定

经查阅文献，确定斑马鱼胚胎发育从受精到孵化出幼鱼过程中的CuSO4半致死浓度和安全浓度范围，设定5个浓度梯度和和1个对照组。

研究表明，Cu2+对大银鱼受精卵的安全浓度为0.00112 mg/L[3]，对鮸状黄姑鱼仔鱼的安全浓度为0.006mg/L[4]，所以设定对照组CuSO4的浓度梯度分别为0（空白对照），0.001 mg/L，0.01 mg/L，0.1 mg/L，1.0 mg/L，2.0 mg/L。每个浓度组设定4个平行组。使用暴晒后的

2）胚胎的挑选与培养管理

在显微镜下选取正常发育至囊胚时期（产卵2-3 h）的斑马鱼胚胎，按2-3个/ml的密度移入24孔细胞培养板的各培养孔内，每个培养板的第一列4个孔加入2 ml 标准稀释水作为空白对照，其余20个孔加入2 ml 重金属溶液，加盖以免溶液蒸发，置于25 ℃恒温培养箱中培养。

每12 h 换水一次，每次所换水中CuSO4溶液与最初浓度保持一致，每次换水量为原水量的1/2。

3、观察、记录

每隔12 h在显微镜下观察各组胚胎整体发育情况并拍照片记录。鱼卵孵化后统计胚胎孵化率和仔鱼畸形率。如果胚胎出现S型弯曲，萎缩，缺少头部，未形成体节以及出现增生或者分叉，心跳缓慢，心包囊肿等则认为胚胎发育畸形，对于初孵仔鱼，若出现活力弱，运动失调，鳍褶出现残缺，身体成深褐色，并在12 h 内死亡，则认为胚胎受到重金属的危害。用观察心跳、身体运动及外物刺激有无反应来判断胚胎和仔鱼的死亡,死亡的胚胎和仔鱼立即从培养溶液中去除。

4、计算及数据分析

死亡率（%）=死亡的胚胎数/受精卵总数×100%

各实验组相关指标以3个平行组的平均数来代表，使用SPSS 13.0软件进行实验组间以及与对照组间的差异性分析，以P<0.05表示有显著差异，P<0.01表示有极显著差异。

四.【实验结果】

对照组第1组第2组

第3组第4组第5组36 h 发育情况：

对照组第1组第2组

第3组第4组第5组 58 h发育情况：

对照组第1组第2组

第3组第4组第5组

五.【讨论】

从上述实验结果来看，对照组和第5组死亡率最高，其中对照组胚胎的死亡可能是因为水质败坏，在显微镜下可明显观察到许多原生动物游动，并噬咬胚胎，同时还会消耗水中氧气，造成水体缺氧，胚胎发育异常。第五组死亡率最高，这在预料之中，这一组CuSO4浓度最高，对胚胎的正常发育产生严重影响，比如胚胎死亡，发育畸形，仔鱼孵出后反应迟钝，动作缓慢，很快死亡。

从实验数据来看，刚开始随着Cu2+浓度的升高，胚胎死亡率出现降低的趋势，这可能是因为水中原生动物以及致病微生物的生长因此受到抑制，对胚胎的发育影响作用减小，而低浓度的Cu2+ 对斑马鱼胚胎毒害作用不明显。从第三组之后，随着Cu2+浓度进一步升高和实验时间的延长，其对胚胎的毒害作用逐渐显著，因此死亡率升高。

同时，存在系统误差，比如因为分子之间会有间隙，在配置各浓度梯度的溶液时，把母液和自来水分开量取会导致混合后溶液体积有所改变致使浓度梯度不精确。

另外，重金属离子对斑马鱼胚胎发育的影响，与发育时间有关。在本次试验中，实验用卵是发育至50%下包期间的鱼卵，对重金属离子的毒性作用十分敏感。发育后期的鱼卵的耐受性应该会有所增加。

六、【参考文献】

[1] 李永祺，丁美丽.海洋污染生物学.北京：海洋出版社，1991:372-373.

[2] 吴鼎勋，洪万树.四种重金属对黄姑鱼胚胎和仔鱼的毒性[J].台湾海峡，1999，18（2）:186-190.

[3] 李国基等.金属离子对牙鲆仔鱼的毒性作用[J].海洋学报，1996（6）：34-39.

[4] 雷衍之.养殖水环境化学.北京：中国农业出版社，2004：257-258.