菌种的传代、保藏及菌液的制备
菌种管理制度
菌种管理制度目的：为保证药品生产、检定和科研的质量，加强对检验用菌种的科学管理，特制定本制度。
范围：适用于本厂检验用菌种的管理。
职责：菌种管理人对菌种的申购、保藏、检查、发放和销毁，检验员对菌种的使用和操作安全负责，对本制度的实施监督负责。
定义：检验用菌种适用于无菌检查、微生物限度检查，评价防腐剂和抗菌剂的抑菌效果，确认灭菌工艺效果，检验的方法验证、培养基的促生长能力检查、样品检验时的阳性对照等标准菌株。
一代：将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次即成为一代。
程序：1总则检验用菌种应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性相应的等效的商业派生菌株。
2检验用菌种管理由QC部指定人负责。
3根据需要提供所需菌种，并监督其使用。
4负责菌种的申购、保藏、定期传代、使用和销毁。
5负责填写菌种记录2菌种的接收写明菌种的名称、编号、批号、接收日期、来源。
3菌种的保藏与传代标准菌株的复活或培养物的制备应按供应商提供的说明或按已验证的方法进行。
冻干管开启后可制备菌种甘油管和转种斜面。
斜面菌种1-3个月传代一次，传代代数不能超过5代，传代应及时写记录。
除另有规定外，菌种斜面和菌液应保存于2-8度保存。
冻干菌种一旦解冻制备工作菌种后，不得重新冷冻和再次使用。
保藏的菌种都应有明显的标志：菌种名称、接种日期、传代数。
每个工作日检查一次菌种冰箱的温度，长假期每隔数天检查一次。
菌种检查必要时对工作菌种进行纯度和特性确认。
菌液制备好后，在室温放置应在2小时内使用，在2-8度放置应在24h内使用。
凡是与菌种接触过的用具应在121度，30分钟。
然后清洗。
使用菌种时应在生物安全柜内操作，采取防护措施，避免污染。
未经批准，不得将菌种带离实验室。
菌种的销毁保存的菌种失去活性，变异或超过贮存时间，应进行灭活销毁121度，30分钟。
下面为朱自清的散文欣赏，不需要的朋友可以下载后编辑删除谢谢荷塘月色作者: 朱自清这几天心里颇不宁静。
菌种保藏方法
菌种保藏方法
菌种保藏方法，如下：
1、传代保藏，传代保藏菌种是微生物保存中最常用的方法之一。
很多微生物在低温或者干燥处理时，会很快死亡，为了保存菌种的活性，就要定期不断的进行菌种转接、培养后再保存。
2、斜面低温保藏，将待保藏的菌种接种在合适的斜面培养基上，在相应的条件下培养至得到充足的菌体或者孢子，随后密封试管置于4℃左右保存，具体保存温度按照保存菌种设定。
保藏时间依微生物的种类从1个月到4个月不等。
3、冷冻干燥保藏，冷冻干燥保藏法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，这种方法适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年。
我国大多数生物制品菌种都是采用该法保藏。
4、半固体穿刺保藏，配制半固体培养基，高压湿热灭菌后倒于无菌试管中至约1/3，待培养基凝固，用接种环从平面培养基上挑取单菌落，穿入培养基若干次。
在合适的条件下进行培养至菌体旺盛生长，之后密封试管，根据菌种特点在4 ℃左右或者凉爽干燥处保存。
保存时间至少可以达到
1 年，对于有些菌种甚至能达到20 年之久。
5、液氮超低温保藏，液氮超低温保藏法是菌种长期保藏的最有效最可靠的方法。
液超低温保藏法是把菌种装在含有冷冻保护剂的安瓶瓶内，将该安瓶瓶放人液氮（-196℃）中保藏。
《菌种传代与保藏》课件
去除杂菌和变异株
在菌种传代和保藏过程中，难免会混入杂菌或产生变异株。通过鉴定和纯化，可以去除这些杂菌和变 异株，保持菌种的纯度和一致性。这有助于保证实验的可重复性和结果的可靠性。
02 菌种传代技术
液体培养传代法
总结词
通过液体培养基进行菌种传代的方法
详细描述
将菌种接种到液体培养基中，经过一定时间的培养后，再进行菌种分离和纯化 ，用于后续的实验和研究。该方法操作简便，适用于大规模生产。
固体培养传代法
总结词
在固体培养基上进行菌种传代的方法
详细描述
将菌种接种到固体培养基表面，经过一定时间的培养后，形成菌落并进行纯化。 该方法常用于分离和鉴定微生物，能够较好地保持菌种的特性。
真空冷冻干燥保藏法
结合低温与干燥两种保藏方法，通过 真空冷冻干燥技术延长菌种存活时间 的方法。
将菌种在低温下进行真空处理，去除 水分，然后保存在干燥的环境中，这 种方法可以显著延长菌种存活时间， 并保持菌种的活性和稳定性。
液氮保藏法
通过将菌种保存在极低温度的液氮中，以延长菌种存活时间 的方法。
将菌种悬浮在液氮中，利用液氮的超低温特性（-196°C）来 延长菌种存活时间。这种方法可以长期保存菌种，但需要专 业的设备和操作技术，且成本较高。
03
及时发现并处理变异菌株
在菌种传代过程中，应密切关注菌种的生长和性状变化。一旦发现变异
菌株，应及时进行分离和鉴定，并采取相应的措施进行处理，以防止其
扩散和影响后续实验结果。
保持菌种的纯度和活性
定期进行菌种鉴定和纯化
菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程
菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程传代用菌种采用甘油冷冻管保存法。
将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合甘油并分装至冷冻管中，冷冻管标注菌种名称、代数、保存日期等信息，然后放置于-80℃冰箱中保存。
每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。
5.3.2.2液体石蜡保存法对于一些难以保存的菌种，采用液体石蜡保存法。
将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合液体石蜡并分装至玻璃瓶中，瓶口用铝箔密封，标注菌种名称、代数、保存日期等信息，保存温度为-70℃。
每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。
5.4菌种的传代传代用菌种每年进行一次复苏和传代。
复苏后，将菌种接种至适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，按照规定的传代代数制备传代用菌种，并及时更新菌种库存记录。
5.5菌种的使用使用菌种前，应先确认菌种的品质和纯度，并按照规定的传代代数制备工作用菌种。
使用后，应及时更新菌种库存记录，并进行相应的消毒处理。
5.6菌种的销毁菌种在使用过程中，如出现变异或污染等情况，应及时进行应灭活处理，并填写《菌种销毁记录表》，经主管部门审核同意后，进行销毁处理。
菌种库存中长期未使用的菌种，应定期进行清理和销毁处理。
菌复苏、复壮；Sabouraud葡萄糖琼脂培养基：用于白色念珠菌复苏、复壮；青霉素-链霉素琼脂培养基：用于铜绿假单胞菌复苏、复壮。
5.4.1.1.3复苏步骤：1.取出保存好的菌种管，用接种针在酒精灯上消毒；2.将接种针在75%酒精中消毒，再用酒精棉球擦拭消毒；3.用接种针在相应的培养基上进行接种；4.置于适宜温度下孵育，待菌落出现后进行传代或进行实验。
5.4.1.2标准菌株的确认通过形态学、生理生化特性、分子生物学等方法进行鉴定，确认菌株的纯度和种属。
5.4.1.3标准菌株的传代将菌株从原始保存方式中转移到新的保存方式中，确保菌株的保存和传承。
传代次数不宜过多，一般不超过10代。
菌种传代.
1. 目的建立菌种的传代、保藏及菌液制备的操作规程。
2. 范围适用于质检中心菌种的传代、保藏及菌液制备。
3. 责任人实验室检定菌保管员、检验中心主任。
4. 内容4.1 标准菌种的概念及其管理4.1.1标准菌种是指由国家授权机构制备的具有稳定的生物学特性并用妥善方法保藏的菌种。
我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理委员会（CCCCM）管理，涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）提供。
4.2 菌种代号的意义4.2.1国内药品微生物检验所用的菌种代号是：CMCC（F）或 CMCC（B）CMCC ——中国医学菌种保藏中心；B ——代表细菌， F ——代表真菌。
4.2.2 菌种的名称▪铜绿假单胞菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）１０１０４］▪生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１］▪大肠埃希菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）４４１０２］▪金黄色葡萄球菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３］▪枯草芽孢杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６３５０１］▪白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］▪黑曲霉［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００３］4.3 标准菌种的保藏形式我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中。
在这种容器中，微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须的环境条件，一般呈休眠状态。
4.4 培养基的选择细菌一般用营养琼脂培养基，特别指出的是生孢梭菌用硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基进行传代，真菌一般用改良马丁培养基。
4.5 菌种的传代4.5.1 菌种的复苏4.5.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml 滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化工作台。
4.5.1.2先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕,再将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75% 乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。
点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。
4.5.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置35~37℃培养22~24 h。
菌种传代与保藏作业指导书
菌种传代与保藏作业指导书1.标准菌的来源标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。
2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。
购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。
储存于2〜8℃,有效期为3个月。
3.标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
3.3操作步骤：a.打开洁净工作台。
氏在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。
d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5〜0.8ml到安瓿中。
e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。
f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。
g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30〜35℃,培养18〜24小时；真菌培养温度23〜28℃,培养3〜5天。
观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。
h.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。
以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。
菌液的制备及保存
1目的菌种保藏使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。
规范菌种原始菌液的制备及长期保存。
2内容2.1定义原始菌液--由冻干菌或冷冻菌直接传代的孢子或生长菌的原始悬浮液。
工作菌液--由原始菌液直接稀释，或根据一般试验需要而等量稀释的特定浓度的孢子或细菌的悬浮液。
22总则微生物室收到实验菌种后应进行活化及纯化，并进行传代（芽孢杆菌除外）。
每一新菌种在适宜的琼脂平板上划线分离，检查是否纯种，观察菌落形态并用革兰氏染色或芽孢染色法进行镜检，如果是芽孢悬浮液，用常规方法测定其存活孢子数。
经检查如果满意，贴上合适的标签，并将贮备菌存放在实验室专用的冰箱里（2〜8C）或冷冻室内，以避免与实验室正在使用的其它菌种相混淆，作好菌种传代的记录以便能追踪传代史。
生孢梭菌的孢子悬浮菌应每年制备一次。
原始菌种的传代次数最多传至第五代。
O Q 代产览2.3 培养基2.4冻干菌制备原始菌液2.4.1由甘油冷冻菌制备原始菌液241.1 把冻干菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第一代。
2.4.1.2 从冷冻箱内取出冷冻菌，使其在室温下慢慢融化；2.4.1.3 把冷冻菌无菌转移至100ml该菌所适用的液体培养基中；2.4.1.4 根据菌种的类型，将接种后的培养基在适当温度下培养24h或更长一些时间；2.4.1.5 把甘油冷冻菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第二代。
2.4.2由集菌平板制备原始菌液2.4.2.1 在超净工作台内，把经过24h （或更长时间）培养的菌液摇匀，各取1ml,无菌转移至5只培养基平板上，轻轻转动平板，使菌液均匀分布于平板表面。
不同培养基适24231 生长菌-24h以内即可显见增长;用于不同菌种。
2.4.2.2 另用一只平板，划线分离菌液，培养之，以检查菌液是否纯种。
242.3 在适当的温度下培养以上平板，不同菌种所需培养周期不一。
24232 孢子-需要3〜7天或更长时间才能得到50%孢子，这样可确保提到浓的悬浮液。
菌种复苏传代操作规程
菌种复苏传代操作规程一、引言菌种复苏传代操作规程是生物实验室中非常重要的一项工作，它关系到实验的可靠性和成功率。
本文将详细介绍菌种复苏传代操作规程，包括前期准备、菌液制备、培养基制备、菌种接种、传代等步骤。
二、前期准备1.准备好所需设备：无菌培养箱、移液器、显微镜等；2.准备好所需试剂：琼脂、葡萄糖等；3.清洗设备并消毒。
三、菌液制备1.从冰箱中取出需要复苏的菌株，将其在无菌条件下解冻；2.取出一定量的琼脂加入到试管中，并加入适量的葡萄糖和其他所需成分；3.将琼脂溶液加热至沸腾，然后冷却至50℃左右；4.将解冻后的菌株用移液器吸取适量细胞悬浮液，并滴入琼脂溶液中；5.轻轻摇晃试管使得细胞均匀分布在琼脂中；6.将试管放置于无菌培养箱中，在适当的温度下进行培养。
四、培养基制备1.准备好所需试剂：琼脂、葡萄糖等；2.将琼脂加入到试管中，并加入适量的葡萄糖和其他所需成分；3.将琼脂溶液加热至沸腾，然后冷却至50℃左右；4.将制备好的菌液接种到琼脂溶液中，并轻轻摇晃使得细胞均匀分布在琼脂中；5.将试管放置于无菌培养箱中，在适当的温度下进行培养。
五、菌种接种1.准备好所需设备：无菌移液器、显微镜等；2.从前一代培养基中取出需要传代的菌株；3.用移液器吸取一定量的细胞悬浮液，并滴入新的培养基中；4.轻轻摇晃试管使得细胞均匀分布在琼脂中；5.将试管放置于无菌培养箱中，在适当的温度下进行培养。
六、传代1.在前一代培养基中进行培养，当菌落数量达到一定程度时，即可进行传代；2.从前一代培养基中取出需要传代的菌株；3.用移液器吸取一定量的细胞悬浮液，并滴入新的培养基中；4.轻轻摇晃试管使得细胞均匀分布在琼脂中；5.将试管放置于无菌培养箱中，在适当的温度下进行培养。
七、结论通过以上步骤，我们可以成功地进行菌种复苏传代操作。
在实验过程中，我们需要注意保持无菌条件，并严格按照操作规程进行操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。
菌种的传代、保藏及菌液的制备
菌种的传代、保藏及菌液制备标准菌种的概念及其管理§§检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中菌种的名称§生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１］§白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］§微生物菌种的使用、保存与管理、验证。
§一.制定菌种使用保藏管理程序§§标准菌种的保藏形式培养基的选择§菌种的传代§§§菌种的接种菌种的复苏《的传代次数不得超过从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第严格控制菌种的传代§1.复溶菌种并转种按菌种说明书要求复溶所转菌种并转接于适当的增菌培养基内（为第一代）2.鉴定菌种后制甘油冷冻管后，挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管面，工作用菌种（为第三代）§3.将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于试验§保存管（第三代）斜面养基适当温度培养后作为工作用菌种（第三代）§将（第三代）菌种冷冻或低温保存，将生长、转种后的第二代菌种灭菌处理。
§当工作用用菌种代数小于上代工作用菌种转接下代工作用菌（第三代）可直接§转接第四代，直至四代转为五代。
菌种保藏标签的规范与要求菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标签必须字迹清晰可见，应注明：称，系列号旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必处理掉处理过程应记录。
严格菌种的质量控制，确保菌种的质量菌种的质量对检验至关重要，对实验式储备的菌种而言，除了在起始阶段要对菌种进行纯度和属性确认外，还应对每一次传代都进行确认的质量控制系统。
因为微生物菌种从上一代传到下一代时，很可能发生污染或变异，因此每次传代中至少要对菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必要时应做菌种鉴定试验，所有被确认受到污染的菌种应及时销毁，不得用于常规实验。
菌种保存、传代、使用、销毁管理规程-操作规程
表 1 传代用菌种保存方法、保存温度、保存期限
菌种名称 大肠埃希菌〔 CMCC(B)4410〕2 金黄色葡萄球菌〔 CMCC(B)2600〕3 铜绿假单胞菌（ CMC（C B） 10104） 枯草芽孢杆菌〔 CMCC(B)6350〕1 乙型副伤寒沙门菌〔 CMCC(B)5009〕4 白色念珠菌〔 CMCC(F)9800〕1
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? 改良马丁琼脂培养基：用于黑曲霉复苏、复壮；
? 液体硫乙醇酸盐培养基：用于生孢梭菌复苏、复壮；
? 营养肉汤培养基：用于金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门
菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮；
? 改良马丁培养基：用于白色念珠菌复苏、复壮
5.4.1.1.3 标准菌株的复苏操作步骤：
包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、 制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。
i) 储备菌种管制备成功，储存于－ 30℃，有效期为两年。
5.4.1.2 标准菌株的确认
a) 用无菌接种环取上述培养物接种到胰酪大豆胨琼脂（ TSA）培养基（细菌）或沙氏葡萄
糖琼脂培养基（真菌和酵母菌）平板上，或相应的宜于该菌生长的鉴别培养基平板上。
制成复壮后的孢子悬液 20ml。以无菌技术向复壮后的菌种菌悬液中 1~2ml/管加石蜡高
出菌种表面约 1cm 使菌体与空气隔绝，并将试管直立，封存于冻存管，置于 -20℃冷冻
或 2～8℃冰箱中保存。制备 10 支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控
制，即进行相应的确认。其余作为储备管。 将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。 内容
以下操作均在生物安全柜内进行。
a) 在安瓿的外表面用 75%的酒精擦拭并让其自然风干。
b) 用一小砂轮在安瓿的上部划一条线， 用手轻轻将安瓿掰开 （开启安瓿时必须小心， 因为
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。
传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。
2、传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。
培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。
2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。
其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。
常用的有方法包括以下几种，如：①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。
方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。
保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤（5克）置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基（以含水量为土壤最大持水量的60%为宜），然后高压灭菌。
菌种的传代与保藏
分子生物学鉴定
总结词
通过分析菌种的基因组或特定基因序列，对菌种进行高精度鉴定。
详细描述
分子生物学鉴定主要基于DNA或RNA的序列分析，通过比较基因组的相似性和差异性，可以更准确地 确定菌种的分类地位和亲缘关系。该方法具有很高的灵敏度和特异性，适用于各种复杂环境中的微生 物鉴定。
04
菌种安全性
安全性评估
05
菌种传代与保藏的应用
在工业生产中的应用
生产食品和饮料
例如酸奶、面包、啤酒等，需要使用传代和保藏的菌种来发酵和 生产。
生产酶和生物催化剂
某些菌种可以产生特定的酶或生物催化剂，通过传代和保藏这些菌 种，可以持续生产所需的酶或生物催化剂。
生产抗生素和药物
某些菌种可以产生抗生素和其他药物，传代和保藏这些菌种对于药 物的持续生产和质量控制至关重要。
病原性评估
对菌种进行病原性评估，确保其不具有致病性 或致病性较低。
耐药性评估
对菌种进行耐药性评估，确保其不携带耐药基 因或耐药性较低。
毒力因子评估
对菌种进行毒力因子评估，确保其不具有强毒力或毒力因子较少。
安全措施
操作规范
消毒措施
制定严格的菌种操作规范，确保实验 人员遵循安全准则。
对实验区域和器具进行定期消毒，以 消除潜在的污染源。
空气
保持一定的空气流通，以防厌氧菌的 生长繁殖。
保藏期限
低温保藏
一般可保存数月至数年不等，具体时间取决于菌种的特性和保藏条件。
真空干燥保藏
一般可保存数年至数十年不等。
液体石蜡保藏
一般可保存数年至十余年不等。
甘油保藏
一般可保存数月至一年左右。
03
菌种鉴定
形态学鉴定
菌种保藏方法
菌种保藏方法(来源:微生物保藏管理中心)定期移植法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。
适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。
适用于细菌和酵母菌等。
菌种传代与保藏
菌种传代与保藏
菌种保藏的原则
根据微生物生理、生化特点，人工创造条件，主要是
低温、干燥、缺氧三者，使微生物的代谢处于不活泼、 生长繁殖受抑制的休眠状态，以达到保持纯种优良性 状的目的。
菌种传代与保藏
长期保藏法： -80℃低温保藏法 真空冷冻干燥法 液氮超低温保藏法 沙土管保藏法
菌种传代与保藏
菌种传代与保藏
标准菌株主要来源 美国菌种保藏中心（ATCC） American Type Culture Collection Center 中国普通微生物菌株保藏中心（CGMCC） China General Microbiological Culture
Collection Center 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC） China Center for Industrial Culture Collection 中国医学微生物菌种保藏中心（CMCC） China Center for Medical Culture Collection
5.6.3.4 实验室应有程序和措施以保证标准菌种的安 全，防止污染、丢失或损坏，确保其完整性（具体措 施）。
谢谢！
菌种都应注明 ：名称、标准号、接种日期、传代数、 操作者； 菌种使用记录，流转记录。 销毁记录
菌种传代与保藏
菌种保藏管理要求相关标准： 《病原微生物实验室生物安全管理条例》 GB 19489—2008 实验室生物安全通用要求 GB/T 27405-2008 实验室质量控制规范 食品微生物检测 CNAS CL05 实验室生物安全认可准则 CNAS-CL09 实验室认可准则在微生物检测实验室的应用说
短期保藏法： 传代培养保藏法 液体石蜡保藏法
菌液的制备及保存
1目的菌种保藏使微生物的代谢活动处于最低的状态,但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。
规范菌种原始菌液的制备及长期保存。
2内容2.1定义原始菌液-—由冻干菌或冷冻菌直接传代的孢子或生长菌的原始悬浮液.工作菌液-—由原始菌液直接稀释，或根据一般试验需要而等量稀释的特定浓度的孢子或细菌的悬浮液。
2。
2 总则微生物室收到实验菌种后应进行活化及纯化，并进行传代（芽孢杆菌除外）.每一新菌种在适宜的琼脂平板上划线分离，检查是否纯种,观察菌落形态并用革兰氏染色或芽孢染色法进行镜检，如果是芽孢悬浮液，用常规方法测定其存活孢子数。
经检查如果满意,贴上合适的标签，并将贮备菌存放在实验室专用的冰箱里（2 ~8℃)或冷冻室内,以避免与实验室正在使用的其它菌种相混淆,作好菌种传代的记录以便能追踪传代史。
生孢梭菌的孢子悬浮菌应每年制备一次。
原始菌种的传代次数最多传至第五代。
2。
3 培养基2.4 冻干菌制备原始菌液2。
4.1 由甘油冷冻菌制备原始菌液2。
4.1.1 把冻干菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第一代。
2。
4.1。
2 从冷冻箱内取出冷冻菌，使其在室温下慢慢融化；2。
4。
1.3 把冷冻菌无菌转移至100ml该菌所适用的液体培养基中；2。
4。
1.4 根据菌种的类型，将接种后的培养基在适当温度下培养24h或更长一些时间；2。
4.1。
5 把甘油冷冻菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第二代。
2。
4。
2 由集菌平板制备原始菌液2.4。
2.1 在超净工作台内，把经过24h（或更长时间)培养的菌液摇匀，各取1ml，无菌转移至5只培养基平板上,轻轻转动平板，使菌液均匀分布于平板表面.不同培养基适用于不同菌种。
2.4。
2.2 另用一只平板，划线分离菌液，培养之,以检查菌液是否纯种.2。
4。
2.3 在适当的温度下培养以上平板，不同菌种所需培养周期不一。
2。
4。
2.3.1 生长菌—24h以内即可显见增长;2。
4.2.3。
2 孢子—需要3～7天或更长时间才能得到50％孢子，这样可确保提到浓的悬浮液。
药品检验用菌种的传代和保藏(2021精选文档)
影响集菌培养效果的若干因素
温度 渗透压 氧气 光 pH值和氧化还原电位 培养基 抗生素
验证纯培养的主要依据
1、用显微镜观察时，全部的生物个体是相似的， 如果是细菌，对革兰氏染色反应应当是一致的。
2、将培养物制成悬液，重新倾注平板，或平板 划线培养后，所形成的全部菌落的形态应该是 相似的。如果是细菌，将重新形成的菌落各作 穿刺培养，其培养特征应当是一致的。
琼脂斜面低温保藏法
适用细菌、霉菌、酵母菌及放线菌保藏 优点：简便、大多数微生物适用 缺点：保藏期短；传代次数多；容易发
生变异及污染。 生孢梭菌用硫乙醇酸盐培养基、乙型溶
血性链球菌及肺炎球菌用血肉汤（琼脂） 培灭菌去 水备用。获得需要保藏菌种的纯培养， 将液体石蜡注入培养容器中，并完全覆 盖培养基。
我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管 理委员会（CCCCM）管理，涉及药品微生 物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管 理中心（CMCC）提供
标准菌种的保藏形式
我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的 形式包装于熔封的厚玻璃容器中。在这 种容器中，微生物通常与赋形剂共存， 由于缺乏生长必须的环境条件，一般呈 休眠状态。
获取纯培养的工作环境
1、洁净工作室：环境洁净度10000级下的 局部100级的单向流空气区域内，全过程 必须无菌操作，防止微生物污染。
2、无菌隔离舱
获取纯培养的接种工具
1、接种环 2、接种针 3、接种铲 4、接种钩 5、其他玻璃器械
获取纯培养的其他器具
1、玻璃器皿：如各种规格培养皿。 2、微生物实验室常用的设备，如高压灭菌
纸表面 干燥 将形成的明胶片密封保藏
麸皮保藏法
我国历史悠久的微生物保藏法 适于保藏根霉、曲霉、青霉、红曲霉等
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菌种的传代、保藏及菌液制备
标准菌种的概念及其管理
§
§
检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中
菌种的名称
§
生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１］§白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］
§
微生物菌种的使用、保存与管理、验证。
§一.制定菌种使用保藏管理程序
§
§
标准菌种的保藏形式
培养基的选择§
菌种的传代
§
§
§菌种的接种
菌种的复苏
《
的传代次数不得超过
从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种
后为第
严格控制菌种的传代
§
1.复溶菌种并转种按菌种说明书要求复溶所转菌种并转接于适当的增菌培养基内（为第一代）
2.鉴定菌种后制甘油冷冻管
后，挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管
面，工作用菌种（为第三代）
§3.将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于试验
§
保存管（第三代）斜面养基适当温度培养后作为工作用菌种（第三代）
§将（第三代）菌种冷冻或低温保存，将生长、转种后的第二代菌种灭菌处理。
§当工作用用菌种代数小于
上代工作用菌种转接下代工作用菌（第三代）可直接
§转接第四代，直至四代转为五代。
菌种保藏标签的规范与要求
菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标签必须字迹清晰可见，应注明：
称，系列号
旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必处理掉处理过程应记录。
严格菌种的质量控制，确保菌种的质量
菌种的质量对检验至关重要，对实验式储备的菌种而言，除了在起始阶段要对菌种进行纯度和属性确认外，还应对每一次传代都进行确认的质量控制系统。
因为微生物菌种从上一代传到下一代时，很可能发生污染或变异，因此每次传代中至少要对
菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必要时应做菌种鉴定试验，所有被确认受到污染的菌种应及时销毁，不得用于常规实验。
菌种处理的注意事项与有关记录
§
都是病原菌，这就要求处理菌种时有一些有别于其他标准品的特殊要求。
1.
的危害程度，要实行严密安全的保藏管理。
2.
检查和保藏等都应有专门的微生物分析员处理和控制，建立进出账目，填写菌种纪录，纪录内容
包括：菌种名称、编号、来源、形态特征、培养特性、
和培养条件、保藏方法、储存条件及保存库址等。
§
4.为了防止菌种污染或将污染传播到别处，其他部门的人员未经允许不得进微生物实验室。
所有的意外情况，都必须立即向主管部门报告以便得到及时解决。
5相关记录
中，应建立菌种制备、保藏和使用的记录格式。
菌种的确认
一.初步鉴定试验
分离培养
革兰染色
生化试验
用及代谢产物，借以鉴别细菌的种类
二.全面鉴定
铜绿假单胞菌
§
芽胞、有荚膜、单端有1～3根鞭毛。
§培养特性：专性需氧，最适温度为
长是铜绿假单胞菌的一个特点。
营养无特殊要求，普通培养基上均能生长，菌落大小不一，扁平湿润，边缘不齐，可产生各种水溶性色素，故使培养基变为蓝绿色。
在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长，常在其表面形成菌膜。
§分离培养：十六烷三甲基溴化铵培养基
§生化反应：氧化酶试验（＋）（培养物呈粉红色渐变为紫红色）
铜绿假单胞菌—琼脂平板的形态
铜绿假单胞菌—鞭毛染色形态
生孢梭菌
形态特征：G粗大芽胞杆菌、但在陈旧培养物中菌体
革兰染色为阴性
体，位于军体中央或近端，有周身
培养特性：专性厌氧，但要求不严格。
一般培养时不易形成芽孢，在普通营养琼脂培养基形成不规则菌落。
在硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基上形成圆形、光滑、湿润、不透明的菌落。
在硫乙醇酸盐流体培养基
中常在其表面形成菌膜。
大肠埃希菌
§
运动。
有菌毛。
培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养基上生长良好，形成较大的圆形、光滑、湿润、灰白色的菌落。
在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。
分离培养：伊红美兰培养基（
§生化反应：IMViC试验结果：＋＋－－
大肠埃希菌—EMB平板菌落形态
大肠埃希菌—显微镜下菌体形态
大肠埃希菌—电镜下菌体形态
金黄色葡萄球菌
§
列呈葡萄串样，无
培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，在普通营养琼脂培养基上形成较大的圆形、光滑、湿润、隆起、边缘整齐、不透明的菌落。
菌落因种不同而出现不同的色素。
在营养肉汤培养基中呈均匀
混浊生长。
分离培养：高盐甘露醇培养基
生化反应：
金黄色葡萄球菌—显微镜下菌体形态
金黄色葡萄球菌—电镜下菌体形态
沙门菌
§
周身鞭毛，能运动。
有菌毛。
培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养基上可生长，形成圆形、光滑、湿润、半透明、边缘整齐的菌落。
在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。
分离培养：沙门菌属志贺菌属琼脂
§分离培养：
基
生化反应：
沙门菌—SS平板菌落形态
沙门菌—显微镜下菌体形态
沙门菌—血清凝集试验结果
枯草芽孢杆菌
§
胞，位于菌体中心或次极端，不小于菌体。
培养特性：为需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通营养琼脂培养基上形成较大的圆形或不规则的、表面粗糙、可有皱褶、菌落下面可形成红色色素的灰白色菌落。
在营养肉汤培养基中形成菌膜
§分离培养：营养琼脂平板
枯草芽孢杆—琼脂平板的形态
枯草芽孢杆—显微镜下菌体形态
真菌的初步鉴定试验
§
真菌的分离培养
⑴.
细菌菌落相似，但较大些，菌落表面光滑、湿润、边缘整齐，有部分单细胞真菌可在培养基中形成假菌丝，此菌落称为类酵母型菌落。
⑵.
状、绒毛状、粉末状，并产生不同的色素。
快速显色鉴别培养法：经
果。
如白色念珠菌呈绿色或蓝绿色菌落，黑曲霉呈白色丝状菌落，里面呈淡粉红色，一周后逐渐变成黑色。
霉菌各种菌落形态
白色念珠菌
§
§
落。
培养稍久，菌落增大。
在改良马丁培养基中
白色念珠菌—显色平板的形态
白色念珠菌—显微镜下菌体形态
黑曲霉§
§
黑曲霉—显微镜下菌体形态
黑曲霉—电镜下菌体形态
菌种传代的工作环境、工具及其他器皿§
1
2
§
1
2
3
4
5、酒精灯及其他玻璃器械
菌种的接种操作步骤
一. 斜面接种法：
1.
2.
菌名及接种日期，和传代菌种一并移入接种室或
管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约
灼，往返通过三次。
4.右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种
环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后
上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。
取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。
将已接种好的细菌管置
箱培养
培养箱培养
直刺入，接近管底但不接触管底，然后接种针沿穿刺线原路退出。
三
界处的管壁上轻轻研磨，使菌混合于培养
液中。
黑曲霉接种方法：
§
环境）中进行，关闭风机，靠近酒精灯，拧开瓶盖，用无菌吸管吹吸管内液体，取
用吸管涂布均匀，置
态可参照下图。
如上图，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色；斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。
转种完毕的冻存管和使用过的器具应经
分钟再作处理。
菌种的保藏
菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。
一、菌种保藏的目的
性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不
被污染，以达到便于研究
二、菌种保藏的原理
§首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行§
§
三、菌种保藏方法
及性。