脂多糖对人肠微血管内皮细胞水通道蛋白1表达及功能的影响陈信浩

［６］　Ｓｉ　ＭＬ，Ｚｈａ　Ｓ，Ｗｕ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．ｍｉＲ－２１－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００７，２６（１９）：２７９９－２８０３．［７］　ＡｓａｎｇａｎｉＩ　Ａ，Ｒａｓｈｅｅｄ　ＳＡ，Ｎｉｋｏｌｏｖａ　ＤＡ，ｅｔ　ａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ－２１（ｍｉｒ－２１）ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ　ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ＰＤＣＤ４ａｎｄ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００８，２７（１５）：２１２８－２１３６．［８］　Ｚｈｕ　Ｓ，Ｗｕ　Ｈ，Ｗｕ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ－２１ｔａｒｇｅｔｓ　ｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ，２００８，１８（３）：３５０－３５９．［９］　Ｍｅｎｇ　Ｆ，Ｈｅｎｓｏｎ　Ｒ，Ｗｅｈｂｅ－Ｊａｎｅｋ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ－２１ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＰＴＥＮ　ｔｕｍｏｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｇｅｎｅ　ｉｎｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００７，１３３（２）：６４７－６５８．［１０］　Ｇａｂｒｉｅｌｙ　Ｇ，Ｗｕｒｄｉｎｇｅｒ　Ｔ，Ｋｅｓａｒｉ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ－２１ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｇｌｉｏｍａ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ｂｙ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，２００８，２８（１７）：５３６９－５３８０．［１１］　Ｓｅｌａｒｕ　ＦＭ，Ｏｌａｒｕ　ＡＶ，Ｋａｎ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ－２１ｉｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　４ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ３［Ｊ］．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００９，４９（５）：１５９５－１６０１．［１２］　史春梅，陈玲，徐广峰，等．人ｍｉＲ－１７－９２ｃｌｕｓｔｅｒ慢病毒载体构建及其在人脂肪细胞的表达验证［Ｊ］．江苏医药，２０１２，３８（６）：６２４－６２７．（收稿日期：２０１２－０６－１１）（供稿编辑：单晓光）·论著·脂多糖对人肠微血管内皮细胞水通道蛋白１表达及功能的影响陈信浩　纪俊标　吕纯业　戴存才【摘要】　目的　研究脂多糖（ＬＰＳ）对人肠微血管内皮细胞（ＨＩＭＥＣ）水通道蛋白（ＡＱＰ）１表达及功能的影响。

方法　４０份ＨＩＭＥＣ均分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ四组。

Ａ、Ｂ、Ｃ组分别经浓度为０．１、１、１０ｍｇ／Ｌ的ＬＰＳ作用；Ｄ组为对照组，只加培养基。

各组细胞培养１２ｈ。

Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测ＨＩＭＥＣ　ＡＱＰ－１的表达；ＲＴ－ＰＣＲ检测ＨＩＭＥＣ　ＡＱＰ－１ｍＲＮＡ的表达；放射法测定ＨＩＭＥＣ的摄水功能。

结果　随着作用于ＨＩＭＥＣ的ＬＰＳ浓度增加，ＡＱＰ－１蛋白及其ｍＲＮＡ表达和ＨＩＭＥＣ的摄水功能均逐步减少（Ｐ＜０．０５）。

结论　ＨＩＭＥＣ　ＡＱＰ－１表达与ＬＰＳ浓度呈负性相关。

【关键词】 细菌内毒素；内皮细胞；水通道蛋白１；脂多糖【中图分类号】　Ｒ３２９ 【文献标识码】　Ａ 【文章编号】　０２５３－３６８５（２０１２）２２－２６４９－０３Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｏｎ　ａｑｕａｐｏｒｉｎ　１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ＣＨＥＮ　Ｘｉｎｈａｏ，ＪＩ　Ｊｕｎｂｉａｏ，ＬＶ　Ｃｈｕｎｙｅ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，ＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｎａｎｊｉｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１００２９，ＣＨＩＮＡ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）ｏｎ　ａｑｕａｐｏｒｉｎ　１（ＡＱＰ－１）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ（ＨＩＭＥＣ）．ＭｅｔｈｏｄｓＦｏｕｒｔｙ　ｐｉｅｃｅｓ　ｏｆ　ＨＩＭＥＣ　ｗｅｒｅ　ｅｑｕａｌｌｙ　ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ　ｉｎｔｏ　４ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　Ａ（ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＬＰＳ　０．１ｍｇ／Ｌ　ｆｏｒ１２ｈ），Ｂ（ｗｉｔｈ　ＬＰＳ　１ｍｇ／Ｌ），Ｃ（ｗｉｔｈ　ＬＰＳ　１０ｍｇ／Ｌ）ａｎｄ　Ｄ（ｂｌａｎｋ　ｃｏｎｔｒｏｌ）．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ＡＱＰ－１ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｍＲＮＡ　ｉｎ　ＨＩＭＥＣ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎｄ　ＲＴ－ＰＣＲ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｗａｔｅｒ　ｉｎｔａｋｅｏｆ　ＨＩＭＥＣ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｓ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＬＰＳ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ＡＱＰ－１ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｍＲＮＡ　ｉｎ　ＨＩＭＥＣ　ｗｅｒｅ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．Ｓｏ　ｄｉｄ　ｔｈｅ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆｗａｔｅｒ　ｉｎｔａｋｅ　ｏｆ　ＨＩＭＥＣ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＡＱＰ－１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｓ　ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ＬＰＳｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】 Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；Ｈｕｍａｎ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ；Ａｑｕａｐｏｒｉｎ　１；ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ［Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｍｅｄ　Ｊ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２０１２，３８（２２）：２６４９－２６５１．］ 基金项目：南京市科技计划项目（２０１２０１０８５）；南京市青卫工程资助项目作者单位：２１００２９　江苏省，南京医科大学第一附属医院普通外科（陈信浩、戴存才）；南京医科大学附属江宁医院（陈信浩、纪俊标、吕纯业）通讯作者：戴存才　Ｅ－ｍａｉｌ：ｄａｉｃｕｎｃａｉｄｙ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ·９４６２·江苏医药２０１２年１１月第３８卷第２２期　Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｍｅｄ　Ｊ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２０１２，Ｖｏｌ　３８，Ｎｏ．２２ 脂多糖（ＬＰＳ）是革兰阴性细菌合成释放的主要细菌内毒素，是导致感染性休克的最重要的生物因子。

微血管内皮细胞是其主要的作用靶细胞之一，而肺、肠是最易受到攻击的靶器官。

已有众多文献报道受到攻击的肺微血管通透性增加是其重要特征，可导致肺水肿，引起低氧血症甚至急性呼吸窘迫综合征（ＡＲＤＳ），从而加重病情和病死率。

而对肠微血管内皮功能在感染情况下血管通透性的改变，目前尚未得到阐明。

为了观察腹腔感染时肠内皮细胞水通道蛋白１（ＡＱＰ－１）表达及功能改变，本研究以人肠微血管内皮细胞（ＨＩＭＥＣ）为研究对象，观察ＬＰＳ对ＡＱＰ－１表达及功能的影响，揭示ＡＱＰ－１在腹腔感染中ＨＩＭＥＣ通透性改变中的意义。

材料与方法一、材料ＨＩＭＥＣ购自上海细胞生物所。

抗ＡＱＰ－１多克隆抗体及免疫组织化学试剂盒购自美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司，聚合酶链反应（ＰＣＲ）引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

ＰＣＲ试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

二、方法１．细胞培养　细胞复苏后，用１６４０培养基加５％小牛血清，于细胞培养箱内３７℃、５％ＣＯ２，４０份ＨＩＭＥＣ分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ四组，每组１０份。

Ａ、Ｂ、Ｃ组分别经浓度为０．１、１、１０ｍｇ／Ｌ的ＬＰＳ作用，Ｄ组为对照组，只加培养基作用。

各组细胞培养１２ｈ后，弃去培养液，用胰酶将细胞消化脱壁，收集到试管内，１５００ｒ／ｍｉｎ离心弃上清液，然后分别加入１００μｌ裂解液置冰上裂解３０ｍｉｎ，１０００ｒ／ｍｉｎ离心弃沉淀。

２．ＨＩＭＥＣ　ＡＱＰ－１表达的检测　采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法，取各组细胞中提取的蛋白上清液，加１０μｌ蛋白上样液煮沸５ｍｉｎ，备用。

配制１０％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离胶和５％的浓缩胶，用７０Ｖ电压电泳，待蛋白质到达浓缩胶－分离胶界面后，将电压调到１１０Ｖ，１．５ｈ后终止电泳。

将凝胶用聚偏二氟乙烯膜（ＰＶＤＦ膜）转膜９０ｍｉｎ，然后用２．５％牛奶封闭ＰＶＤＦ膜，再以１∶１０００的ＡＱＰ－１一抗４℃孵育过夜，第２天回收一抗，用ＴＢＳＴ清洗５遍，每次１０ｍｉｎ。

用１∶２０００的二抗孵育２ｈ。

然后用ＴＢＳＴ洗５遍，用Ｈ２Ｏ２和鲁米诺混合化学发光液覆盖ＰＶＤＦ膜，作用２ｍｉｎ，于暗室曝光，显影，扫描胶片。

３．ＡＱＰ－１ｍＲＮＡ表达测定　采用ＲＴ－ＰＣＲ方法，ＬＰＳ（０．１、１、１０ｍｇ／Ｌ）刺激细胞后１２ｈ，用Ｔｒｉｐｕｒｅ试剂盒提取总ＲＮＡ，与下游引物反转录合成ｃＤＮＡ，以合成ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ反应，反应条件：９４℃预变性５ｍｉｎ、９４℃变性５０ｓ、６０℃退火５８ｓ、７２℃延伸６０ｓ、循环次数３０次、末次循环后７２℃延伸８ｍｉｎ；β－ａｃｔｉｎ作为内参，反应条件：９４℃预变性５ｍｉｎ、９４℃变性５０ｓ、５５℃退火６０ｓ、７２℃延伸６０ｓ、３５个循环、末次循环后７２℃延伸１０ｍｉｎ。

ＡＱＰ－１引物使用ＤＮＡ　ｃｌｕｂ　ｐｒｉｍｅｒ软件设计为正向：５′－ＴＧＴＧＣＧＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣ－３′；反向：５′－ＣＴＡＴＴＴＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣ－３′，扩增片段为３５９ｂｐ。

β－ａｃｔｉｎ引物正向：５′－ＣＣＡＡＧＧ　ＣＣＡＡＣ－ＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣ－３′；反向：５′－ＡＧＧＧＴＡ－ＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣ　ＧＣＣＡＧＡＣ－３′，扩增片段为５００ｂｐ。

ＰＣＲ产物电泳后行图像扫描分析。

４．ＡＱＰ－１摄水功能测定　将细胞传代培养在９６孔培养板，ＬＰＳ作用１２ｈ后每孔加氚水３７×１０４Ｂｑ，继续放入孵箱孵育５ｈ，从孵箱中取出９６孔板，每孔加胰酶０．４ｍｌ，用加样枪吹打，剥脱混匀细胞，吸出细胞悬液，计数板计数，每管加７０％过氯酸１００μｌ后，加新鲜Ｈ２Ｏ２２００μｌ，放置７０℃水浴箱１５ｍｉｎ，每孔取０．１ｍｌ悬液放入闪烁瓶，加５ｍｌ闪烁液，盖好瓶盖后放入３７℃恒温箱，过夜后测量放射性。