基因工程改造秸杆发酵产氢的关键技术研究

课题类型：探索导向类申请受理编号： SQ2006AA05Z109513

国家高技术研究发展计划（863计划）

专题课题申请书

技术领域名称：先进能源技术领域

专题名称：氢能与燃料电池技术

申请指南技术方向：制氢技术

课题名称：基因工程改造秸杆发酵产氢的关键技术研究

申请人：程军

依托单位：XX大学

中华人民XX国科学技术部

2006-09-05

机物从而生产氢气的生物工程技术，它是一种符合可持续发展战略的可再生能源技术。它克服了常规制氢方法（如从煤、石油、天然气等化石燃料中提取或通过水电解法制取等）需要消耗大量化石燃料和能量、并且产生大量污染的弊病。目前在生物法制氢研究方面主要分为发酵法和光合法两大类，其中发酵法具有产氢细菌生长速率快、产氢能力高、反应无需光源、发酵底料来源广等优点，所以更容易实现连续产氢和工业化生产。因此，利用秸杆等生物质以微生物法制氢对发展清洁高效的可再生能源和减少环境污染具有重要意义，是一个处于国际学术前沿的十分活跃的热点课题，具有重要的学术价值和应用前景。

国内外许多学者关于发酵法产氢的研究X 围主要局限于反应机理相对简单的富含水溶性碳水化合物（尤其是葡萄糖）的有机废水，对于主要由复杂大分子有机质即不溶性的大分子碳水化合物、脂类物和蛋白质组成的生物质及固体有机废弃物的发酵产氢问题较少研究。后者的厌氧消化产氢过程可分为水解、酸化和产氢产乙酸三个阶段，由于其降解产氢过程的复杂性，国内外在该领域的研究方兴未艾，目前已逐步引起许多学者的高度重视。国外已有部分相关报道，如日本在90年代末到本世纪初，在暗发酵制氢方面的科研投入大大增加，尤其在2001-2004年产生了大量基础性的研究结果。日本东北大学曾将餐厅剩菜与粪便污泥混合配成培养基料，利用加热预处理的厌氧活性污泥和大豆粉仓中富含的产氢菌进行发酵制氢，发现底料的产氢潜力分别高达140ml/g 和180ml/g ，而厌氧活性污泥的接种产氢速率可高达45ml/（gVSS•h ），2004年日本产业技术研究所的废弃食物产氢项目已经进入中试阶段。另外，韩国、新加坡、印度在此领域的研究也比较活跃。而国内对于固体有机废弃物发酵产氢的研究才刚刚起步，如中国科学院、清华大学、中国科技大学、XX 大学、XX 工业大学、XX 大学等曾对固体废弃物发酵产氢进行了一些探索性研究，取得了一定的研究成果。众多专家一致认为：如何使生物质及固体废弃物高效降解成可资利用的还原糖是利用其发酵产氢的首要技术难点和重大关键点。而生物质发酵产氢能否获得产业化应用的瓶颈问题是过程的经济性，即如何降低发酵制氢的成本，使之可以和化石能源催化重整制氢的经济性相比拟，或者可以与其他生物能源过程（即生物制甲烷、燃料酒精、生物柴油）相竞争。其核心问题是如何提高氢气从葡萄糖的转化率、如何降低底物成本、以及如何在生物反应器水平上实现高效产氢。目前国际上最新的研究方向是从现有产氢纯菌的工艺优化中走出来，开发新的产氢菌种，通过基因工程改造产氢菌及氢酶，并开发高效的产氢反应器。

利用富含纤维素的秸杆等生物质大规模高效低成本地发酵转化为燃料乙醇、甲烷或氢气等清洁能源是目前国际上的一大热点课题。若能通过基因工程手段在目标植株细胞中成功表达降解不同生物体高分子的酶，如将纤维素酶基因片段植入水稻的基因组中，而在收获的水稻秸秆中获得大量纤维素酶，使得秸杆在后续的加热到90℃左右水解过程中不需要酸碱预处理和外加纤维素酶等，即能高效降解成产乙醇细菌或产氢细菌直接可资利用的小分子还原糖，则能大幅度降低秸杆水解糖化和发酵利用的处理成本，并大幅度提高其转化效率，取得巨大的经济和社会效益。目前美国麻省理工学院、密歇根州立大学、加州大学Davis 分校、杜邦公司和Syngenta 公司等正在加紧开展相关的研究探索，主要在玉米、甘蔗等植株生长过程中表达纤维素酶和半纤维素酶，以获得更有利于秸秆高效水解的农作物，但至今很少见到公开的文献报导[1]。

厌氧发酵产氢中起主要作用的是氢酶，氢酶分为放氢酶和吸氢酶，分别催化反应222H H e →++的正逆反应。作为一种有机金属酶类，氢酶对氢代谢至关重要，研究其基因结构和空间结构、催化中心、电子载体种类和传递顺序等具有很高的理论价值，深入发掘这些生物信息对于人们定向改进氢酶性能，获得高产氢菌种具有指导意义。目前已经有超过100种的氢酶基因序列可以在基因库上获得，但是仍然有大量已知产氢菌株的氢酶基因尚未克隆，获得更多的氢酶基因也是生物制氢研究的重要方向。Mishra [2]等分离出高产氢菌阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae IIT BT08的氢酶基因进而进行了酶分子特性研究。大肠杆菌的氢酶基因都属于Ni ．Fe 氢酶，梭菌属的氢酶都属于铁氢酶，目前其中3株所具有的铁氢酶得到测序，但是关于其附属基因、调控机制还不清楚。梭菌的铁氢酶已经成功的克隆，并异源表达到光合细菌内，强化了光合菌的产氢过程。虽然一部分氢酶基因得到解析，但是整体进展仍然比较缓慢而且不系统，有很大的研究探索空间。无论是纯种还是混菌培养，提高关键菌株产氢效率都是最重要的工作。单纯的条件优化手段已不能满足这一要求，

需要运用分子生物学的手段对菌种进行改造，以达到高效产氢的目的。由于产氢细菌内的氢酶种类繁多，通过敲掉基因片段的方法是一个可行策略。Lindblad[3]已将这一策略应用到光合细菌Anabaena PCC7120中，敲掉了其中的吸氢酶HupL基因片段，使产氢速度比野生型高出了两倍。此外，通过蛋白质工程手段对氢酶进行强化，包括增加其活性、耐氧性也都是可行策略。

通过复合诱变选育，得到遗传稳定好的高效产氢突变株，并提高菌种对环境的耐受力，在高产氢菌种的选育中耐高温或耐酸菌是值得重视的一个育种方向。有报道对产气肠杆菌进行激光诱变，筛选得到一株能够耐受pH3.0的高产氢突变株，产氢量较出发菌提高了48％[4]。任南琪教授在其CSTR反应器中分离出一株产氢发酵细菌ZGX4，以其为出发菌株，对其进行紫外和亚硝酸复合诱变选育，经过连续传代得到一株遗传稳定很好的高效产氢突变株YR1，产氢能力提高35％，平均产氢速率提高23％[5]。此外，也可将产氢能力高的菌株的氢化酶植入一些虽然不产氢但是对环境耐受力高（如酸碱度、温度、底物浓度）的菌株，如在非产氢菌Escherichia coli中植入丁酸梭菌的氢化酶，产氢量可达到3.12molH2/mol葡萄糖，高于原丁酸梭菌2.2molH2/mol葡萄糖的产氢量[6]。

运用代谢工程手段等现代生物技术手段对产氢细菌进行改造的研究目前在生物制氢领域还没有展开，是很值得深入研究的方向。Jonathan Wood Ward[7] 用10种商业用酶使戊糖磷酸盐循环与氢酶产氢过程相耦合，使产氢达到11.6mol／mol葡萄糖，充分展示了人工构建代谢途径对于产氢的巨大潜力。但是这一方法目前还只能在体外进行，成本相当高。通过细菌的代谢工程改造和控制，将会是突破暗发酵制氢低转化率的重要突破口。目前已知的发酵制氢的产氢途径包括甲酸途径、丙酮酸途径和NADH途径。其中NADH途径是最具开发潜力的方向，多篇文献中提到提高NADH的含量是有利于产氢的。目前普通的产气肠杆菌产氢量仅为1.58 molH2/mol葡萄糖，但是Tanisho等推测通过加入一种抑制剂使NADH 脱氢酶络合物不能形成则NADH的氧化步骤被阻断而FADH2的氧化不受影响，从而使三羧酸循环所产生的NADH用于产氢，从理论上可望实现每摩尔葡萄糖产10 mol氢气[8-9]。核心问题是如何把细胞代谢过程中产生大量NADH，通过代谢途径的导向直接为氢酶提供还原力进行产氢。现代分子生物学的发展已经可以操作电子呼吸链，因此通过基因工程手段改变代谢途径，从而大大提高产氢效率的梦想是完全有可能实现的。

经检索表明，国内外关于在转基因水稻秸杆中表达纤维素酶和半纤维素酶促进其高效水解的相关专利尚未见到，关于在产气肠杆菌中剔除乳酸等不利于产氢的基因片段并且导入产氢酶[Fe]-hydrogenase基因片段的相关专利也没有见到。日本专利JP2003102482 [10]报道了从梭菌Clostridium paraputrificum中得到一种具有特殊碱基序列的氢化酶基因，将其植入寄主细胞进行基因重组可提高产氢量。日本专利JP62134091[11]将一种在柠檬酸细菌的染色体DNA上表达的氢化酶基因植入普通的DNA单元质粒，从而形成一种混合的DNA质粒能使产氢能力显著提高。欧洲专利WO2006062130[12] 在一株含有甲酸盐脱氢酶基因(formate dehydrogenase gene)和氢化酶基因的菌株内植入一种活性剂基因，从而提高了甲酸的产氢量。美国专利仅有一篇关于改造藻类基因强化其光合作用产氢的报道，中国专利主要集中于氢酶的鉴定和基因测序，美国和中国专利都没有关于发酵产氢细菌基因改造方面的报道。

参考文献：

[1] Gadab C. Ghosh Biswas, Callista R, et al. Expression of biologically active Acidothermus cellulolyticus endoglucanase in transgenic maize plants. Plant Science, 2006 (In press).

[2] J. Mishra, N. Kumar, A.K. Ghosh, D. Das. Isolation and molecular characterization of hydrogenase gene from a high rate of hydrogen-producing bacterial strain Enterbacter cloacue

IIT-BT 08. International Journal of Hydrogen Energy 27 (2002) 1475– 1479.

[3] Lindblad P, Christensson K, Lindberg P,et al. Photoproduction of H2 by wildtype Anabaena PCC 1720 and a hydrogen uptake deficient mutant; from laboratory to outdoor culture. International Journal of Hydrogen Energy,2002,27:1271-1281.

[4] Lu WY. Wen JP. Jia XQ.et al. Effect of He-Ne laser irradiation on hydrogen production by Enterobacter aerogenes. International Journal of Hydrogen Energy (in press).

[5] X国香，任南琪，林海龙等. 诱变菌种选育高效产氢菌株. 第六届全国氢能学术会议论文集. 2005；11：137.

[6] G. Chittibabu, Kaushik Nath, Debabrata Das. Feasibility studies on the fermentative hydrogen