蛋白质分离纯化与表征优秀课件
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蛋白质分离纯化和表征优秀课件
2)也与蛋白质分子形状、溶液的密度 和粘度有关。
超速离心法的二个用途 1、测定蛋白质的分子量； 2、分离纯化蛋白质。
超速离心基本原理
1、离心力(Fc)
离心作用是根据在一定角度速度下作 圆周运动的任何物体都受到一个向外的离 心力进行的。离心力的大小等于离心加速 度ω2X与颗粒质量m的乘积，即：
FC＝mω2X 其中ω是旋转角速度，以弧度／秒为 单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以 cm为单位：m是质量，以克为单位。
1、什么叫扩散？
如小心地把纯水放在蛋白质溶液的上面， 则蛋白质分子将从下面的高浓度区向上面的 低浓度区迁移，直至达到平衡为止。由于浓 度差引起的这种溶质分子的迁移称为扩散。 扩散是高浓度向低浓度方向进行的。
2、扩散系数
它在数值上等于当浓度为一个单位时，在 一秒钟内通过1厘米2面积而扩散的溶质量
3、影响扩散系数的因素
Sephadex
G-25
G-75
G-100
1000-5000
3000—80000 4000—150000
2、聚丙烯酰胺凝胶: (Bio-gel) Bio-Rad公司(美国)
Bio-gel
P-4
P-10
P-100-150000
3、琼脂糖凝胶：(Sepharose) pharmacia公司(瑞典)
利用渗透压的测定来计算蛋白质分子量时，是通过测 定几个不同浓度的渗透压，用范霍夫公式(略)求出蛋白质分 子量。
渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点
优点： 所用的实验装置简单。
缺点： 要求被测蛋白质纯度要高，如果蛋白质样品中含有其他
杂质蛋白，那么由渗透压测得的结果实际上代表几种蛋白质 的平均分子量。
(三)蛋白质的扩散和扩散系数
超速离心法的二个用途 1、测定蛋白质的分子量； 2、分离纯化蛋白质。
超速离心基本原理
1、离心力(Fc)
离心作用是根据在一定角度速度下作 圆周运动的任何物体都受到一个向外的离 心力进行的。离心力的大小等于离心加速 度ω2X与颗粒质量m的乘积，即：
FC＝mω2X 其中ω是旋转角速度，以弧度／秒为 单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以 cm为单位：m是质量，以克为单位。
1、什么叫扩散？
如小心地把纯水放在蛋白质溶液的上面， 则蛋白质分子将从下面的高浓度区向上面的 低浓度区迁移，直至达到平衡为止。由于浓 度差引起的这种溶质分子的迁移称为扩散。 扩散是高浓度向低浓度方向进行的。
2、扩散系数
它在数值上等于当浓度为一个单位时，在 一秒钟内通过1厘米2面积而扩散的溶质量
3、影响扩散系数的因素
Sephadex
G-25
G-75
G-100
1000-5000
3000—80000 4000—150000
2、聚丙烯酰胺凝胶: (Bio-gel) Bio-Rad公司(美国)
Bio-gel
P-4
P-10
P-100-150000
3、琼脂糖凝胶：(Sepharose) pharmacia公司(瑞典)
利用渗透压的测定来计算蛋白质分子量时，是通过测 定几个不同浓度的渗透压，用范霍夫公式(略)求出蛋白质分 子量。
渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点
优点： 所用的实验装置简单。
缺点： 要求被测蛋白质纯度要高，如果蛋白质样品中含有其他
杂质蛋白，那么由渗透压测得的结果实际上代表几种蛋白质 的平均分子量。
(三)蛋白质的扩散和扩散系数
蛋白质的分离纯化.ppt
logMr
三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 法测定相对分子质量
聚丙烯酰胺凝胶电泳，（简称PAGE），也称 圆盘电泳，它以聚丙烯酰胺凝胶（单体丙烯 酰胺Arc和交联剂甲叉双丙烯酰胺Bis共聚而 成）为支持物 。
蛋白质颗粒在各种介质中电泳时，它的迁移率
决定于它所带的电荷以及分子大小和形状(电 荷效应、分子筛效应)。
v =沉降速度（dx/dt）
s
=
—ω—v2x——
ω=离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的
距离（cm）
沉降系数的单位常用S，1S=1×10-13（s）
蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系
M = —D—（—1R－—TsV—ρ）—
R—气体常数（8.314×107ergs·mol -1 ·度-1） T—绝对温度 D—扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机 转速很快，则忽略不计） V—蛋白质的微分比容（m3·g-1） ρ—溶剂密度（20℃，g·ml-1） s—沉降系数
二、凝胶过滤法测定相对分子质量
凝胶过滤原理
分子筛色谱 （凝胶过滤）
利用Andrews的实验经验式：
logMr = a/b—Ve/bVo
Ve（elution volume）为某一溶质组分的洗脱 体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱峰 （峰顶）出现时所流出的体积。
V0 (outer volume)为外水体积，即存在于柱床 中凝胶珠外孔隙的水相体积。测定出不能被 凝胶滞留的大分子溶质如蓝色葡聚糖—2000 的洗脱体积可以决定V0。
在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质 胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白 质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不 可能再重新溶解于水。
由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性 质的变化，所以又称为变性沉淀。
第六章-蛋白质的分离、纯化PPT课件
a． 分散相质点1-100nm b． 分散相质点带有同种电荷，互相
排斥不聚成颗粒而沉淀 c． 分散相的质点能与溶剂形成溶剂
化层
2021/3/12
16
蛋白质：
a. 胶体质点的范围
c． 丁达尔效应 d． 布朗运动 e． 不能透过半透膜
2021/3/12
17
2．蛋白质的沉淀
2021/3/12
18
沉淀蛋白质的方法：
因此，所有SDS-蛋白质复合物， 电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极 移动。
② 改变了蛋白质单体分子的构象。
2021/3/12
8
• SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴 直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的 分子量而成正比例地变化。 电泳迁移率μ与多肽链分子量的对数有 下列关系
2021/3/12
① 盐析法：
中性盐（NH4SO4，NaSO4，Nacl等）－→ 蛋白质脱去水化层
优点：不引起蛋白质变性 ② 有机溶剂沉淀法：
极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）－→ 脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点 间的相互作用
条件：低温操作 缩短时间
2021/3/12
பைடு நூலகம்
19
③ 重金属盐沉淀法
当溶液pH>pI,蛋白质颗粒带负电荷, 易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)－→生成沉淀
∵在蛋白质分子中受到邻近电荷的影响 F．蛋白质可看作一个多价离子
2021/3/12
3
• 蛋白质等电点--在某一pH值，蛋白质所 带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷 为零。这一pH称为蛋白质等电点
2021/3/12
4
• 等离子点--没有其他盐类干扰时，蛋白质 质子供体基团界离出来的质子数与质子 受体基团结合的质子数相等时的pH称等 离子点。特征常数。
排斥不聚成颗粒而沉淀 c． 分散相的质点能与溶剂形成溶剂
化层
2021/3/12
16
蛋白质：
a. 胶体质点的范围
c． 丁达尔效应 d． 布朗运动 e． 不能透过半透膜
2021/3/12
17
2．蛋白质的沉淀
2021/3/12
18
沉淀蛋白质的方法：
因此，所有SDS-蛋白质复合物， 电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极 移动。
② 改变了蛋白质单体分子的构象。
2021/3/12
8
• SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴 直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的 分子量而成正比例地变化。 电泳迁移率μ与多肽链分子量的对数有 下列关系
2021/3/12
① 盐析法：
中性盐（NH4SO4，NaSO4，Nacl等）－→ 蛋白质脱去水化层
优点：不引起蛋白质变性 ② 有机溶剂沉淀法：
极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）－→ 脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点 间的相互作用
条件：低温操作 缩短时间
2021/3/12
பைடு நூலகம்
19
③ 重金属盐沉淀法
当溶液pH>pI,蛋白质颗粒带负电荷, 易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)－→生成沉淀
∵在蛋白质分子中受到邻近电荷的影响 F．蛋白质可看作一个多价离子
2021/3/12
3
• 蛋白质等电点--在某一pH值，蛋白质所 带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷 为零。这一pH称为蛋白质等电点
2021/3/12
4
• 等离子点--没有其他盐类干扰时，蛋白质 质子供体基团界离出来的质子数与质子 受体基团结合的质子数相等时的pH称等 离子点。特征常数。
第3章蛋白质分离纯化ppt
相对分子量 Mr
待测蛋白分子量
ABC
D
蛋白质含量
洗脱液体积（mL）
2－蛋白质的分子形状与大小
SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳法测相对分子量
• 电泳时的迁移率取决于蛋白的净电荷、分子大 小、形状；
• SDS（十二烷基硫酸钠）与蛋白质结合，使全 部呈负电荷，同时改变蛋白质单体分子构象成 近似球形；巯基乙醇打开二硫键，使亚基分离；
凝胶过滤
• 凝胶过滤层析是依据分子大小这一物理性质进行分离 纯化的。
• 凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒 的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。
• 当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后， 各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度 取决于孔穴的大小和组分分子大小。
• 分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。 这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到 小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
1－蛋白质的酸碱性质
蛋白质中可解离的基团
-NH3+
pKa=7.6~8.4
-COO-
pKa=3~3.2
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1－蛋白质的酸碱性质
蛋白质中可解离的基团
-COOpKa=3.0~4.7
-COOpKa=4.4
1－蛋白质的酸碱性质
蛋白质中可解离的基团
pKa=5.6~7.0
-NH2 pKa=9.4~10.6
• 常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。
4－蛋白质的分离纯化
Differential centrifugation as a first step in protein purification
差 速 离 心
4－蛋白质的分离纯化
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1.前处理：因动/植物/细菌而异
2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/ 有机溶剂分级分离等方法
3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交 换层析、吸附层析以及亲和层析等
4.结晶是最后步骤
五、蛋白质的分离纯化方法
（一）根据分子大小不同的纯化方法
1、透析和超过滤 利用蛋白质分子不能透过半透膜将其
与小分子物质分开 半透膜为玻璃纸或纤维素材料
量
（一）根据化学组成测定最小分子量
1、测定蛋白质中某一微量元素的含量 2、假设蛋白质中仅含一个铁原子
最低相对分子质量= 100* 55.8/铁的百分含量 例如肌红蛋白含铁量为0.335%，那么其最低相对 分子质量就是 55.8/0.335 × 100 = 16700
（五）凝胶过滤法测定相对分子质量
蛋白质分子通 过凝胶柱的速 度并不取决于 分子的质量， 而是它的斯托 克半价。
如果某种蛋白质与一理想的非水化球体过柱速度相同， 则认为具有与该球体相同的半径，称斯托克半径
蛋白质混合样
标准蛋白质（已知Mr和斯托克半径）和待测 蛋白质必须具有相同的分子形状（接近球形）
（六）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法 测定相对分子质量
• pI通常在 6.0 左右
二、蛋白质分子的大小与形状
蛋白质的分子量
一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12
≈1.66×10-27千克
测定蛋白质相对分子质量的原理和方法
（一） 根据化学组成测定最低相对分子质量 （二） 渗透压法测定相对分子质量 （三） 蛋白质的扩散和扩散系数 （四） 沉降分析法测定相对分子质量 （五） 凝胶过滤法测定相对分子质量 （六） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质
盐溶—盐析
盐溶
• 等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉 淀溶解—盐溶
• 原因？
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少 量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，
溶于水中
盐析 盐析（（NH4）2SO4）
• 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质 会沉淀析出
• 原因？
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
2.有机溶剂沉淀 脱去水化层以及降低介电常数而增 加带电质点间的相互作用
蛋白质分子的形状
蛋白质分子在溶液中的形状或构象的信息，可 借助其摩擦系数与理想球体的摩擦系数之比， 也就是所谓的蛋白质分子的摩擦比来推测。
摩擦比越大，蛋白质分子的不对称性越高。
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
（一）胶体性质（colloidal system）
胶体溶液的特点： 分子直径在1-100 nm内 溶于水 不易聚集沉淀
六、蛋白质含量测定和纯度鉴定
（一）蛋白质含量测定
常用方法：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚 试剂法（Lowry法）、紫外吸收法、染料结合 法（bradford或考马斯亮蓝法）和胶体金测定 法。
双缩脲反应：含两个或两个以上的肽键化合物 与CuSO4溶液都能发生双缩脲反应省市紫红色 或蓝紫色复合物。 Lowry法，主要是利用folin-酚试剂能与Cu+离 子反应，而Cu+是由蛋白质的巯基或酚基氧化 Cu2+而产生
大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液
蛋白质胶体溶液的稳定因素：
1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥 2.水膜弹性 3.质点的大小（1～100nm）
蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗 运动以及不能通过半透膜等性质
（二）蛋白质的沉淀
Pr从胶体溶液中析出
任何破坏稳定蛋白质溶液的因素都可能使蛋白 质沉淀
I 可逆沉淀 – 温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷 – Pr结构和性质没有变化 – 适当条件下可重新溶解
蛋白质颗粒在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时， 它的迁移率取决于： 所带电荷 分子量 分子形状
但是如果在该系统中添加SDS和少量巯基乙醇，则蛋 白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量。
十二烷基磺酸钠
磺酸基 极性亲水 烷基 亲油（蛋白质疏水区）
？
原态蛋白质 巯基乙醇破坏二硫键
变性
迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量
——非变性沉淀 • pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等
Ⅱ不可逆沉淀 • 强烈沉淀条件 • 破坏Pr胶体溶液稳定性 • 也破坏Pr结构和性质 • 沉淀不能再重新溶解 ——变性沉淀 • 如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐
和生物碱沉淀等
1.盐析法
加入大量中性盐（硫酸铵、硫酸钠 和氯化钠）脱去蛋白质的水化层， 盐析一般不引起变性
双向电泳
离子交换层析
（四）利用蛋白质选择性吸附的性质
• 羟磷石灰层析 • 疏水作用层析
（五）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法
具有极强的专一性
亲和色谱颗粒
（六）高效液相层析和快速蛋白质液相层析
多种类型的柱层析都可用HPLC来代替，例如分配 层析，离子交换层析，吸附层析以及凝胶过滤。
加
压
血液透析
血液
透析液
小分子溶出 小分子被带出
透析机Байду номын сангаас
2、密度梯度（区带）离心
用一定的介质（如蔗糖）在离心管内形成一连续或不连 续的密度梯度，将蛋白质混合液置于介质的顶部，通过 重力或离心力场的作用使蛋白质分层、分离。
3. 凝胶过滤 3、凝胶过滤
（二）利用溶解度差别的纯化方法
影响溶解度的外部因素有：pH值、离子强度、介 电常数和温度。
1.等电点沉淀 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀
2.盐溶和盐析 3.有机溶剂分级分离法
降低介电常数 争夺水化膜 4. 温度对蛋白质溶剂度的影响
（三)根据电荷不同的分离方法
1.电泳 原理： • 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 • 分子大小不同，电场中移动速度也不同
• 平板电泳
等电聚焦电泳
3.等电点沉淀
蛋白质分子带有相同数量的正负电荷， 因此，蛋白质分子相互吸引，从而聚集 沉淀。
4.重金属盐沉淀 与带负电荷蛋白质结成不溶性盐
5.生物碱试剂和某些酸类沉淀 与带正电荷蛋白质生成不溶性盐
6.加热变性沉淀 天然结构解体，疏水基外露， 破坏水化层及带电状态
四、蛋白质分离纯化的一般原则
总目标：增加制品纯度或比活
蛋白质分离纯化与表征
扬州大学生物科学与技术学院
蛋白质纯化应根据研究工作和生产的具体目的和要求， 制订分离纯化的合理程序。
蛋白质分离纯化是利用其特性的差异
• 分子的大小和形状 • 酸碱性质 • 溶解度 • 吸附性质 • 对配体分子的特异生物学亲和力
一、蛋白质的酸碱性质
蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大
2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/ 有机溶剂分级分离等方法
3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交 换层析、吸附层析以及亲和层析等
4.结晶是最后步骤
五、蛋白质的分离纯化方法
（一）根据分子大小不同的纯化方法
1、透析和超过滤 利用蛋白质分子不能透过半透膜将其
与小分子物质分开 半透膜为玻璃纸或纤维素材料
量
（一）根据化学组成测定最小分子量
1、测定蛋白质中某一微量元素的含量 2、假设蛋白质中仅含一个铁原子
最低相对分子质量= 100* 55.8/铁的百分含量 例如肌红蛋白含铁量为0.335%，那么其最低相对 分子质量就是 55.8/0.335 × 100 = 16700
（五）凝胶过滤法测定相对分子质量
蛋白质分子通 过凝胶柱的速 度并不取决于 分子的质量， 而是它的斯托 克半价。
如果某种蛋白质与一理想的非水化球体过柱速度相同， 则认为具有与该球体相同的半径，称斯托克半径
蛋白质混合样
标准蛋白质（已知Mr和斯托克半径）和待测 蛋白质必须具有相同的分子形状（接近球形）
（六）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法 测定相对分子质量
• pI通常在 6.0 左右
二、蛋白质分子的大小与形状
蛋白质的分子量
一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12
≈1.66×10-27千克
测定蛋白质相对分子质量的原理和方法
（一） 根据化学组成测定最低相对分子质量 （二） 渗透压法测定相对分子质量 （三） 蛋白质的扩散和扩散系数 （四） 沉降分析法测定相对分子质量 （五） 凝胶过滤法测定相对分子质量 （六） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质
盐溶—盐析
盐溶
• 等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉 淀溶解—盐溶
• 原因？
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少 量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，
溶于水中
盐析 盐析（（NH4）2SO4）
• 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质 会沉淀析出
• 原因？
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
2.有机溶剂沉淀 脱去水化层以及降低介电常数而增 加带电质点间的相互作用
蛋白质分子的形状
蛋白质分子在溶液中的形状或构象的信息，可 借助其摩擦系数与理想球体的摩擦系数之比， 也就是所谓的蛋白质分子的摩擦比来推测。
摩擦比越大，蛋白质分子的不对称性越高。
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
（一）胶体性质（colloidal system）
胶体溶液的特点： 分子直径在1-100 nm内 溶于水 不易聚集沉淀
六、蛋白质含量测定和纯度鉴定
（一）蛋白质含量测定
常用方法：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚 试剂法（Lowry法）、紫外吸收法、染料结合 法（bradford或考马斯亮蓝法）和胶体金测定 法。
双缩脲反应：含两个或两个以上的肽键化合物 与CuSO4溶液都能发生双缩脲反应省市紫红色 或蓝紫色复合物。 Lowry法，主要是利用folin-酚试剂能与Cu+离 子反应，而Cu+是由蛋白质的巯基或酚基氧化 Cu2+而产生
大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液
蛋白质胶体溶液的稳定因素：
1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥 2.水膜弹性 3.质点的大小（1～100nm）
蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗 运动以及不能通过半透膜等性质
（二）蛋白质的沉淀
Pr从胶体溶液中析出
任何破坏稳定蛋白质溶液的因素都可能使蛋白 质沉淀
I 可逆沉淀 – 温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷 – Pr结构和性质没有变化 – 适当条件下可重新溶解
蛋白质颗粒在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时， 它的迁移率取决于： 所带电荷 分子量 分子形状
但是如果在该系统中添加SDS和少量巯基乙醇，则蛋 白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量。
十二烷基磺酸钠
磺酸基 极性亲水 烷基 亲油（蛋白质疏水区）
？
原态蛋白质 巯基乙醇破坏二硫键
变性
迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量
——非变性沉淀 • pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等
Ⅱ不可逆沉淀 • 强烈沉淀条件 • 破坏Pr胶体溶液稳定性 • 也破坏Pr结构和性质 • 沉淀不能再重新溶解 ——变性沉淀 • 如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐
和生物碱沉淀等
1.盐析法
加入大量中性盐（硫酸铵、硫酸钠 和氯化钠）脱去蛋白质的水化层， 盐析一般不引起变性
双向电泳
离子交换层析
（四）利用蛋白质选择性吸附的性质
• 羟磷石灰层析 • 疏水作用层析
（五）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法
具有极强的专一性
亲和色谱颗粒
（六）高效液相层析和快速蛋白质液相层析
多种类型的柱层析都可用HPLC来代替，例如分配 层析，离子交换层析，吸附层析以及凝胶过滤。
加
压
血液透析
血液
透析液
小分子溶出 小分子被带出
透析机Байду номын сангаас
2、密度梯度（区带）离心
用一定的介质（如蔗糖）在离心管内形成一连续或不连 续的密度梯度，将蛋白质混合液置于介质的顶部，通过 重力或离心力场的作用使蛋白质分层、分离。
3. 凝胶过滤 3、凝胶过滤
（二）利用溶解度差别的纯化方法
影响溶解度的外部因素有：pH值、离子强度、介 电常数和温度。
1.等电点沉淀 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀
2.盐溶和盐析 3.有机溶剂分级分离法
降低介电常数 争夺水化膜 4. 温度对蛋白质溶剂度的影响
（三)根据电荷不同的分离方法
1.电泳 原理： • 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 • 分子大小不同，电场中移动速度也不同
• 平板电泳
等电聚焦电泳
3.等电点沉淀
蛋白质分子带有相同数量的正负电荷， 因此，蛋白质分子相互吸引，从而聚集 沉淀。
4.重金属盐沉淀 与带负电荷蛋白质结成不溶性盐
5.生物碱试剂和某些酸类沉淀 与带正电荷蛋白质生成不溶性盐
6.加热变性沉淀 天然结构解体，疏水基外露， 破坏水化层及带电状态
四、蛋白质分离纯化的一般原则
总目标：增加制品纯度或比活
蛋白质分离纯化与表征
扬州大学生物科学与技术学院
蛋白质纯化应根据研究工作和生产的具体目的和要求， 制订分离纯化的合理程序。
蛋白质分离纯化是利用其特性的差异
• 分子的大小和形状 • 酸碱性质 • 溶解度 • 吸附性质 • 对配体分子的特异生物学亲和力
一、蛋白质的酸碱性质
蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大