流式细胞仪

55 97 96 .5 3 80 .9 4 18 9.73
15 2.97 68 3.82
59 9.15
10 6
F/P FITC, PerCP: 2-9; APC, PE: 1; PE-Cy7, APC-Cy7: 1, N;
抗原密度 高丰度抗原：任何荧光素；低丰度抗原：PE，APC
染色指数 自发荧光
高：APC； 低：FITC 非特异形结合
FcR; 荧光自身
直接标记
特异性信号: 弱 非特异性结合:低 对照：相同荧光
为保证样品中细胞是一个一个分别受到光 照并且受照强度十分一致,须将样本流与激 光束正交且相交于激光能量分布峰值处
激光光源和光学系统
氩离子气体激光管：Ex488nm; 氦氖离子气体激光管:Ex633nM; 紫外激光管：Ex355nM Violet:Ex405nM
单波长、高强度、高稳定性
光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组 成，大致可分为流动室前和流动室后两组。
“ready”：域值参数设置过高或过低 ；域值没有选择正 确的参数（通常为FSC）；进样器堵塞；密封圈破损；联机 失败 ；
“standby “：run按钮 ；液流系统漏气（鞘液箱未密封 ； 样品管破损 ；密封圈破损；）
2. 上样速度过高：
样品流中有气泡；域值过低 ；样品浓度过高 ；鞘液系统 中有空气
➢ 开机、联机 cytometer-computer；
➢ 检查鞘液箱 是否有足够鞘液（3L）。 盖子关紧。 鞘液箱处于压力下。（黑色金属板） 管道没有渗漏。
➢ 检查废液箱 预装400ml含氯消毒液 没有渗漏
➢ 在cellquest下： 设置参数： PMT-voltage; compensation; shreshold; status(standby-3-4 V; ready-14-15 V) counter 建立自己的文件
横坐标：散射光(FSC or SSC-线性)或荧光信 号(FL1, 2,3,4-对数)的相对强度值；
纵坐标：表示细胞数。 根据阴性对照设定适当的“门”（直线门）， 仪器的计算机就会给出测定值（包括阳性细胞% 和平均荧光强度）。
Fi l e: CD8086 .0 06
Marke r % Gated Al l 10 0.00 M1 95 .4 9
补偿与荧光强度成正比
FL2
未补偿
FL1
部分补偿 充分补偿
Uncompensated vs Compensated
FL1-%FL2
FL1-%FL2
FL2-%FL1
FL2
FL1
Forward Angle Light Scatter (FSC)
Laser
FALS Sensor
FSC 与入射光在同一方向的散射光，与细胞表面积相关
4．分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪 能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时 要求必须达到的。
5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞ 1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。
流式细胞仪构造
可分为五部分： (1)流动室及液流驱动系统; (2)激光光源及光束成形系统; (3)光学系统; (4)信号检测与存贮、显示、分析系统， (5)细胞分选系统。
流动室及液流驱动系统
流动室(Flow Chamber或 Flow Cell) 仪器核心部件，被测样品在此与激光 相交。 充满了鞘液, 将样品流环包，使样品 流不会脱离液流的轴线方向，保证每 个细胞通过激光照射区的时间相等。
改变样本的进样速率开关,可提高采样分析的速度, 但是, 并不提高样本流的速度,而是改变了细胞间的 距离,样本流变宽,细胞间距离缩短,这样单位时间内 流经激光照射区的细胞数就增加。
激光焦点处能量分布为正态分布,中心处能量最高, 因此当样本速率选择高速(Hi)时,处在样本流不同位 置的细胞或颗粒,受激光光照射的能量不一样,从而 被激发出的荧光强度也不相同，这就会造成测量误 差,当在检测分辨率要求高的实验时 如， DNA analysis应选用低速(Low)
每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光 信号强弱，与被照射的时间和激发光的强 度有关，因此细胞必须达到足够的光照强 度。
Mea n 99 .3 3
10 3.75
2.双参数数据显示和分析
表示：一维直方图、二维点阵图、等高线图和 密度图显示和分析。
二维图：横坐标-FSC/SSC/FL1/2/3/4；纵坐 标-FSC/SSC/FL1/2/3/4
根据阴性对照设置“四方格”标尺,分为四个区： LL-双阴性；LR和UL-单阳性；UR-双阳性；每个 区都可以用%和平均荧光强度表示。也可以设置 “门”。
阈值
减少杂颗粒：细胞碎片；坏死细胞；红细胞； 血小板等
➢ 关机
上含有3ml的含氯消毒液（10％），底下的托架 推至一边持续1min。 回归托架，在run的状态下，高速继续上样5min。 改用蒸馏水，重复上述过程。 探针继续放在蒸馏水中。换至”standby“. 脱机 关电源
常见问题
1. 没有信号出现
流式细胞仪技术 -应用和分析
基础部免疫教研室 刘书逊
Tel: 70316-21; lsx_2k2002@yahoo.com.cn
流式细胞仪的概述
一、概述 流式细胞仪（Flow Cytometer 简称
FCM）是一项集激光技术、电子物理技术、 光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化 学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科 技仪器。
流式细胞仪主要技术指标
1．流式细胞仪的分析速度： 一般检测1000～ 5000个细胞/秒,大型机可达每秒上万个 细胞。
2．荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分 子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。
3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC） 反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～ ０.5μm。
3. 上样速度过低：
域值设定过高 ；样品未充分混匀 ；样品稀释过大 ；进样 针堵塞
Fluorescence compensation: 单标记荧光调节补偿
FL2-%FL1
需要调节补偿的参数对 FL1/FL2；FL2/FL3；FL3/FL4
对照设置-以检测带有源自文库ITC/PE/APC的 样品为例 1.空白、阴性对照 2.单标记对照：FL1(FITC); FL2(PE); FL4(APC) 3. 混合对照：以上对照的两两组合；3 个混合
90 Degree Light Scatter
Laser
FALS Sensor
SSC 与入射光成 90 ° 的光，与 细胞内部复杂度 相关，颗粒密度
90LS Sensor
根据FSC/SSC可以将全血中的淋巴细胞，单核 细胞和粒细胞分开
荧光参数 自发荧光：未经荧光染色，细胞内部的荧
光分子经激光照射后发出的荧光信号。 自发荧光的细胞成分： 核黄素，细胞色素等。 死亡细胞的自发荧光较高 需要设置阴性对照。
Excitation Emisson
400 nm
500 nm
Wavelength
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Relat iv e I nt ens it y
Protein
Phycoerytherin (PE)
Excitation Emisson
300 nm 400 nm
300 nm 400 nm
500 nm
632.5 nm (HeNe)
600 nm
700 nm
Excitation Emisson
Protein
如何选择荧光偶联的抗体
荧光偶联抗体的亮度 S/N(Positive/negative): 4-6 fold PE, PE-cy7,PE-cy5, APC>APC-cy7, alexa 647>FITC, alexa488
特征荧光：经标有特异荧光素的单克隆 抗体染色后经激光激发发出的荧光。
Fluorescence Detectors
Laser
FALS Sensor
Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
FITC Alexa488 PE PI 7-AAD PE-Cy5 PerCP PE-Cy5.5 PE-Cy7
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Propidium Iodide
Excitation
300 nm 400 nm
500 nm
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Relat iv e I nt ens it y
DNA
PI
Allophycocyanin (APC)
APC APC-Cy7 Alexa647
激发光波长(Ex)
488 488 488 488 488 488 488 488 488
633 633 633
发射光波长(Em)
519
FL1
519
578
FL2
630
670
668
FL3
667
695
785
660
785
FL4
668
300 nm
Fluorescein (FITC)
流动室前的光学系统由透镜和小孔组成， 透镜和小孔（一般为2片透镜、1个小孔） 的主要作用是将激光光源发出的横截面为 圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆 形激光光束，使激光能量成正态分布，使 通过激光检测区的细胞受照强度一致，最 大限度的减少杂散光的干扰
流动室后光学系统
(1)长通滤片(LP)：使特定波长以上的光通过，特定波长以下 的不通过。
Fi l e: CD808 6.003
Qua d Locatio n: 1 4, 3 2
Qua d UL UR LL LR
Events % Gated % Total X Mean X Geo Me an Y Mean Y Geo Me an
88
1.52 1.27
9.33
8.68 86 .5 9
66 .4 4
素标记的同型对 照；或者预先用 抗体来源动物血 清封闭
间接标记
➢ 特异性信号: 强, 5-6 2nd Ab/ 1st Ab;
➢ 非特异性结合: 高 ➢ 对照：一抗来源
的同型对照或血 清＋二抗
Avidin-Biotin method
biotinylated primary Ab biotin avidin biotinylated dye
绿色荧光(FITC)：LP550和 BP525
橙红色荧光(PE)：LP600和 BP575
红色荧光(CY5)：LP650和BP675
流式细胞仪的使用
调试和校准：流式细胞计在使用前，甚至 在使用过程中都要精心进行调试，以保证 工作的可靠性和最佳性能。 1. 激光强度 2. 液流速度 3. 测量区光路调节
概括来说，流式细胞术就是对于处在快速 直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参 数的、快速的定量分析和分选的技术。
流式细胞仪的机型
1. 台式机 检测和分析 B.D. : FACSCalibur; LSRII; LSRI
2. 大型机 分选细胞 B.D. : FACSVantage ；FACSAria Beckman Coulter: MoFlo （DAKO）
荧光抗体的搭配
理论上，不同通道检测的参数可以同时进 行检测。但是如果进行3个荧光参数的检测， 尽可能的选择只需要调节一对参数之间的 补偿的荧光。 如，FL1+FL2+FL4; FL1+FL3+FL4; 注意：PE-Cy5和APC不能同时检测。
流式细胞仪的数据显示和分析
一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。 1．单参数数据显示和分析— 一维直方图
➢ 上机（管道密闭）： 气阀关闭；”run”
PMT-voltage
未染色的细胞（空白对照）或者同型对照 ➢ Dot plot: FSC-SSC
线性坐标（细胞）；对数坐标（bead-CBA) 显示不同细胞群体，关注群体-设门 ➢ Dot plot: FL1/FL2; FL1/FL3; FL2/FL3 对数坐标
如,LP500允许500 nm以上的光通过，而500 nm以下的 光吸收或返回。
(2)短通滤片(SP)：使特定波长以下的光通过，特定波长以 上的光吸收或返回。
(3)带通滤片(BP)：允许相当窄的一波长范围内光通过，一 般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一 为允许通过光波段的范围。如BP 500 / 50表示其允许通 过波长范围为475nm-525nm。