第三章 病毒的复制.

第三章病毒的复制

第一节研究病毒复制的一般性方法

1.1建立病毒复制的实验研究系统

研究病毒的常用培养系统

①噬菌体——细胞培养系统

用该系统研究噬菌体复制的优点：

敏感的宿主细菌易于在琼脂平板上培养，其数目易于控制；

噬菌体在细菌内增殖导致细菌培养物变清亮，在合适的接种密度下很容易在琼脂平板上形成噬斑，其结果容易观察；

噬菌体和细菌的增殖速度快、增殖周期短，在一定时间内可多次反复实验。

噬菌体同步感染敏感的细菌培养物—建立了测定一步生长曲线的实验方法，弄清了噬菌体的复制循环。

②动物病毒—动物细胞培养系统

目前已建立了很多细胞株，包括脊椎动物细胞（哺乳动物细胞株）和无脊椎动物细胞（昆虫细胞株），为研究病毒复制打下了良好的基础。

在离体条件下，避免了机体内的控制机制及其他因素的影响，因此只能近似反映动物机体内病毒的复制过程。

③植物病毒—原生质体培养系统

高活性的原生质体的分离和培养方法的建立，把病毒与植物机体或组织之间的复杂关系，转变为病毒与植物单细胞的简单关系，提高了感染效率。

植物体的单细胞体外培养目前无法实现。在植物体外，有由纤维素组成的细胞壁，植物病毒感染植物体的感染效率要低很多。前二者都是一个病毒感染一个细胞，但是要104～106个植物病毒才能感染一个植物体。

采用原生质体（去掉细胞壁），则病毒的感染效率大大提高。但是总的效率还是比噬菌体和动物病毒差。

无论是哪种培养系统，都要考虑：

①宿主细胞的敏感性与生理状态

②注意感染复数病毒感染宿主细胞后，会导致宿主细胞出现裂缝，胞内的物质渗漏，使宿主细胞死亡。要尽可能做到感染复数为1，即一个对一个。

感染复数(multiplicity of infection, m.o.i) ：用以起始病毒感染的每个细胞所需的病毒颗粒数目。单位（PFU/cell）

1.2一步生长实验（定量描述烈性噬菌体的生长规律）

以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附后，再高度稀释病毒－细胞培养物（避免二次吸附），或以抗病毒抗血清处理病毒－细胞培养物（去除过量的噬菌体，也是为了避免二次吸附）以建立同步感染，然后继续培养，定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线。体现3个时期：①潜伏期②突破期③平稳期

潜伏期中包含有隐蔽期(有感染性的病毒粒子从消失到出现这段时期)

潜伏期：噬菌体吸附到细胞到释放出新噬菌体的时间

隐蔽期：病毒在受染细胞内消失到细胞内出现新的感染性病毒的时间

（1）潜伏期，这一时期几乎没有形成噬菌斑，进入裂解期后就形成了噬菌斑，也就是有新的病毒粒子释放出来了，因此潜伏期是指病毒吸附于细胞到受染细胞释放出子代病毒所需的最短时间。不同病毒潜伏期长短不一，噬菌体一般有几分钟，动物病毒和植物病毒以小时或天计。

（2）裂解期：在潜伏期后，病毒效价急剧增加，这是新合成的病毒核酸和蛋白质装配成大量病毒粒子，并释放的结果。潜伏期后宿主细胞裂解释放出大量子代病毒的时期称为裂解期或成熟期。

这一点跟细菌的生长曲线不同，细菌的生长曲线中的延滞期是为分裂做准备，对数期是大量繁殖的时期，而病毒一步生长曲线中的裂解期则是病毒大量释放的时期，而不是繁殖（即复制）的时期（复制过程实际上是在潜伏期完成的）。

（3）稳定期：裂解期末，受染细胞将子代病毒粒子全部释放出来，病毒效价稳定在最高处的时期，称为稳定期，即病毒粒子已经全部释放，没有新的病毒粒子释放了，所以形成的噬菌斑数量保持不变，不会下降，因此不会像细菌的生长曲线那样有衰亡期。

一步生长曲线的意义：

（1）可获知潜伏期和裂解期。

（2）可获知裂解量：每一受感染细胞所产生的子代病毒粒子的平均数。

稳定期的病毒粒子数目

裂解量= ————————————

潜伏期受感染细胞的数目

第二节病毒的复制周期

病毒增殖（multiplication）只在活细胞内进行，以病毒基因为模板，在酶作用下，分别合成其基因及蛋白质，再组装成完整的病毒颗粒，这种方式称复制。

从病毒进入宿主细胞开始，经过基因复制，到最后释放出子代病毒，称为一个复制周期。病毒的复制周期依次包括吸附，穿入，脱壳，生物合成及组装，成熟和释放。

2.1吸附（adsorption）

病毒附着于敏感细胞的表面，细胞表面能吸附病毒的物质结构称为病毒受体。

敏感的宿主细胞是病毒复制的第一阶段。该过程包含静电吸附及特异性受体吸附两阶段。细胞及病毒颗粒表面都带负电荷，Ca2+、Mg2+等阳离子能降低负电荷，促进静电吸附。静电吸附是可逆的，非特异的。

可逆性吸附：又称为静电吸附，指病毒体与细胞接触，进行静电结合。非特异性、可逆的，是由随机碰撞、布朗运动、静电引力引起，其他的粒子也可以发生这种吸附，如灰尘的吸附等。

不可逆吸附：又称为真正的吸附，指病毒体表面位点（蛋白质结构）与宿主细胞膜上相应的受体结合。是决定病毒感染的真正开始。如噬菌体通过尾丝与细菌表面的受体结合，再如流感病毒通过HA（血凝素蛋白）与宿主细胞表面的唾液酸受体结合。

吸附类型的转变：

一般情况下病毒与宿主细胞通过不可逆吸附后即发生侵入过程，但有时也会由不可逆吸附变为可逆性吸附，这个过程主要取决于三方面的条件，即病毒吸附蛋白、病毒的细胞受体和环境因素。

病毒吸附蛋白：能够识别细胞表面特异性受体的病毒体表面结构蛋白称为病毒吸附蛋白

（VAP）(virus attachment protein,BAP)。它决定了病毒与敏感的细胞表面受体的特异性结合。吸附后病毒粒子或病毒核酸能进入宿主细胞中。

实例：如：T－偶数噬菌体的吸附蛋白→噬菌体尾丝蛋白。有包膜的动物病毒的吸附蛋白是包膜上的糖蛋白突起（流感病毒→血凝素糖蛋白）；无包膜的动物病毒腺病毒的吸附蛋白是二十面体壳体上的五邻纤维。

病毒的细胞受体：

能被病毒吸附蛋白识别，是启动感染发生的特殊细胞位点。它在很大程度上决定了病毒的宿主范围、组织亲和性，并影响病毒的致病性（不同的宿主上有不同的受体，不同的细胞上也有不同的受体）。

病毒受体可分为细胞受体单位和细胞受体位点

细胞受体单位（cellular receptor unit）：是指能够识别一个病毒吸附蛋白的细胞分子。通常由几个亚基单位构成，其活性依赖于分子的空间结构。

细胞受体位点（cellular receptor site）：是指由一个或几个受体单位组成，并能有效地结合一个病毒粒子的细胞表面结构。

具有种系特异性。一些不同种系动物的细胞存在不同的病毒受体。如多瘤病毒受体只存在于小鼠细胞上。

具有组织特异性。动物不同组织细胞上存在不同的病毒受体，从而决定了病毒的组织嗜亲性。如HIV可感染具有CD4抗原的T辅助性淋巴细胞，单核巨噬细胞。而不能感染其他细胞。实例：①细菌病毒：大多数噬菌体的细胞受体在细菌的细胞壁上，如LPS、脂蛋白、蛋白质等。噬菌体的细胞受体特异性很强，因此噬菌体的专一性很强。

②动物病毒：多数动物病毒的细胞受体单位是镶嵌在细胞质脂双层之间的糖蛋白，即细胞膜上的糖蛋白。

植物病毒没有吸附这一步，因此没有细胞受体，其感染是通过昆虫的刺入或者胞间连丝完成的。

③病毒吸附蛋白与细胞受体结合的机制

毒吸附蛋白与细胞受体结合的机制：氢键、离子间静电引力、范德华力等

可逆性吸附：只是静电引力引起，无化学键结合，易受pH影响

不可逆性吸附：病毒吸附蛋白与细胞表面受体形成牢固的化学键

植物病毒迄今尚未发现有特异性细胞受体，其病毒进入植物的机制是通过伤口或媒介昆虫传播的。

④病毒外壳蛋白与寄主细胞受体之间的关系

植物病毒不表现出外壳蛋白与寄主细胞表面受体之间的特异性

1把不能侵染番茄的TMV株系的RNA包上一个能侵染番茄的TMV株系的外壳，所得杂种仍不能侵染番茄。单独用不能侵染番茄的TMV毒株的RNA来接种也不能侵染番茄。反过来，能侵染番茄的RNA和不能侵染番茄的外壳装配成的病毒仍然可以侵染番茄。

2用体外装配的方法把脊髓灰质炎病毒的RNA包上另一种同属肠道病毒组能侵染小鼠细胞的柯萨奇病毒的蛋白质衣壳，这种体外装配的杂种病毒就能侵染原来脊髓灰质炎病毒不能侵染的小鼠细胞。

⑤环境因素

（1）温度：在一定范围内，病毒的吸附速率与温度成正比，例如：脊髓灰质炎病毒在1℃的吸附率仅是37℃的十分之一。

（2）离子环境：在一定浓度的阳离子存在的条件下，能够促进病毒对细胞的吸附（二价阳离子能促进噬菌体的吸附）。螯合剂可抑制吸附。

（3）pH：不同的病毒－－细胞系统吸附反应的最适pH有很大的不同。例如：腺病毒T