实验课5 ——【医学微生物学精品讲义】

三、结核分枝杆菌及抗酸染色
1、分枝杆菌简介
（1）分枝杆菌属细菌是一类细长、略弯曲，呈分枝生长 趋势的杆菌。主要致病菌有结核分枝杆菌和麻风分枝杆 菌。其中，结核分枝杆菌是引起结核病的主要病原体。
（2）结核分枝杆菌需氧生长，营养要求高且生长缓慢。
（3）结核分枝杆菌细胞壁含有大量脂质，一般不易着色， 若经高温或延长染色时间而着色后能抵抗盐酸酒精的脱 色。
（四）操作步骤：
• 初染：将已固定的标本片用染色夹夹好，玻片上加一小块吸 水纸片（防止染液流洒），然后滴加石炭酸复红染液，在酒 精灯上微微加热，直到染液冒出蒸气为止（不可煮沸和煮干), 及时补充染液,维持3~5min，水洗。
• 脱色：用3%盐酸酒精脱色30sec，脱色时应轻轻晃动玻片。水 洗。
• 复染：滴加碱性美兰液复染1min，水洗。 用吸水纸吸干，镜检。
3、肉毒梭菌（ C. botulinum ）：革兰阳性wenku.baidu.com短粗杆 菌，芽胞椭圆形，位于次极端，大于菌体，使菌体 呈网球拍状 。
二、厌氧培养
1、厌氧培养方法分类：
• 物理法：厌氧袋法、厌氧缸法等 • 化学法：焦性没食子酸法等 • 生物法：庖肉培养法、共生法等
2、厌氧培养试验（Anaerobic cultivation test）
（一）实验材料 １、卡介苗或结核病人痰液 2、抗酸染色液等 （二）实验方法 １、用接种环取卡介苗2～3环。涂片、干燥和固定。 ２、用抗酸染色法染色。 ３、镜检。 （三）实验原理
结核分枝杆菌细胞壁含有大量脂质，一般不易着色， 若经高温或延长染色时间而着色后能抵抗盐酸酒精的脱色。
【染液】
抗酸性染液（一）（石炭酸复红液 Carbon fuchsin ） 抗酸性染液（二）（3%盐酸酒精 3%Acid-alcohol ） 抗酸性染液（三）（碱性美兰液 Alkaline methylene blue ）
• 实验材料：肉汤培养基、土块、凡士林
• 实验步骤：将土块放入肉汤培养基中 凡士林封于液面 养24h。
37℃培
• 观察结果：下次实验课。
3、汹涌发酵试验（ stormy fermentation test ）
产气荚膜梭菌在牛乳培养基中能迅速分解乳糖产酸，凝固酪蛋 白，产生大量气体又将凝固的酪蛋白冲散成海绵状碎块，并可将培 养基表面的凡士林冲至试管塞处，气势汹涌。
一、厌氧芽胞梭菌的形态染色特征
1、破伤风梭菌(C. tetani) ：革兰阳性，菌体细长杆状，芽胞圆 形，位于菌体顶端，大于菌体，使细菌呈鼓槌状。
2、产气荚膜梭菌（ C. perfrigens ）：革兰阳性， 粗大杆状，芽胞椭圆形，位于菌体次极端，但体 内标本不易看到芽胞，只见到四周有明显的荚膜。
实验五
厌氧性细菌和分枝杆菌
ANAEROBES AND MYCOBACTERIUM
目的要求
1. 熟悉破伤风梭菌(C. tetani)、产气荚膜梭菌(C. perfrigens )与肉毒梭菌(C. botulinum)形态及染色性
2. 熟悉厌氧培养方法（Anaerobic cultivation methods） 3. 掌握抗酸染色法(Acid-fast stain)
三、结核分枝杆菌及抗酸染色
结核病是一种严重危害人民健康的慢性传染病， 目前全球有约20亿人被感染，每年新出现结核 病患者约800-1000万，每年因结核病死亡人数 约为200-300万。目前我国结核病年发病人数 约为130万，因结核病死亡人数每年达13万， 超过其它传染病死亡人数的总和。我国是全球 22个结核病流行严重的国家之一，同时也是全 球27个耐多药结核病流行严重的国家之一。我 国结核病患病人数居世界第二位，仅次于印度。 结核病是我国重点控制的重大疾病之一。
抗酸染色结果观察
2、结核杆菌培养特性
• 固体培养基上菌落呈干燥、 坚硬、颗粒状、乳白色或米 黄色，不透明，表面皱纹状， 形似花菜。
• 在液体培养基内呈表面生长， 形成菌膜。
3、结核分枝杆菌的检查程序：
痰液
直接涂片、抗酸染色镜检 接种于罗氏培养基
集菌处理 涂片染色镜检（抗酸染色或金胺染色）
4、抗酸染色（acid-fast stain）