IPTG诱导表达蛋白步骤

2 大肠杆菌中诱导表达目的蛋白步骤

大肠杆菌中诱导表达目的蛋白步骤1. 接种20 μL的工程菌于10 mL含抗生素的液体LB培养基中，37 ℃225 rpm 条件下培养10 h。

2. 以0.4% 的比例接种培养的细菌至含抗生素的液体LB培养基中（500 mL加2 mL），37℃250 rpm条件下培养2.5 h。

3. 降温至16 ℃，再培养0.5 h。

4. 加IPTG至终浓度0.2 M，16 ℃200 rpm条件下诱导20 h。

5. 8000 g离心5 min收集细菌。

6. 加入20 mL的缓冲液重悬细菌。

7. 8000 g离心5 min收集细菌，-80 ℃冰箱中保存。

裂解工程菌1. 从-80 ℃冰箱中取出冻存的工程菌，融化。

2. 加入17 mL 的缓冲液和2 mL甘油重悬细菌。

3. 加入1mL的Triton X-100（20 %），加DNase（1000:1），加蛋白酶抑制剂。

4. 超声裂解细菌，超声1 s，间歇1 s，直至菌液变澄清。

5. 离心分离可溶性部分（14000 g，40 min）。

6. 过滤可溶性部分（0.22 μm滤膜）。

7. 超滤管浓缩样品（定角转子最大可用离心力5000 g，最多装12 mL样品，超滤管的MWCO至少是目的蛋白的二分之一，可离心15-60 min，可达150-300 μL，可达20 mg/mL，保质期3年）。

（超滤管一旦湿了就不要再干，）硫酸铵沉淀1. 10%的硫酸铵沉淀杂蛋白：在20 mL蛋白溶液中加入1.12 g硫酸铵颗粒（颗粒越小越好），用搅拌器4 ℃搅拌8 h（先搅拌，后加硫酸铵，防止硫酸铵局部浓度过高）。

2. 5000 g离心20 min，取上清。

3. 每20 mL加硫酸铵1.14 g，搅拌过夜（10 h）。

4. 可见明显的蛋白析出（白色混浊），5000 g离心20 min，倒掉上清。

5. 加30 mL缓冲液溶解目的蛋白。

6. 3 h后，加80 mL缓冲液溶解。

7. 3 h后，10000 g离心20 min，取上清。

Protocol蛋白质纯化步骤

Protocol蛋白质纯化方法（镍柱）柱前操作1.IPTG诱导后，收菌，8000rpm/min(r/m)离心10min;2.用Binding Buffer（BB）溶解（每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min（工作：5s,停止：5s)，1500r/m离心10min,去除杂质；3.取上清，12000r/m离心20min, 得包涵体；4.用含2M尿素的BB洗包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；？？？5.用含6M尿素的BB溶解包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；6.对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱；平衡柱子（柱体积：V）7. 3V（3倍柱体积）ddH2O(洗乙醇）；8. 5V Charge Buffer（CB); ？？？9. 3V BB;柱层析10.上样；11. 10V Washing Buffer（WB）；12. 6V Elute Buffer（EB);13.分管收集，每管1~2ml.各种缓冲液配方1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑），pH=7.91000mlNaCl: 58.44×4=233.76gTris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824gImidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g2. 8×CB: 400mM NiSO41000mlNiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.91000mlNaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.91000mlNaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g5. 6M 尿素1000ml尿素：60.06×6=360.36gNi柱纯化蛋白注意事项(2011-10-13 16:01:39)使用Ni柱纯化带有His标签的融合蛋白，是我们大家再熟悉不过的实验操作了。

IPTG诱导蛋白表达全面介绍

IPTG全面介绍：优点·使用·配制·特点摘要: 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。

IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。

它常与X-Gal 或Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。

IPTG 与lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因lacZ 的抑制。

中文名：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)英文名称：Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside用途：异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。

IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。

它常与X-Gal 或Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。

IPTG 与lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因lacZ 的抑制。

使用方法：首先把IPTG配制成23.83 mg/ml(100 mM)的水溶液，并进行过滤除菌后保存。

然后在100 ml的琼脂培养基中，加入100 μl 的上述溶液、200 μl的X-Gal(20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100 μl的Amp(100 mg/ml)，制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。

当dna 片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体)，然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。

配制方法：在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。

IPTG诱导表达蛋白步骤

IPTG诱导表达蛋白步骤15-11-3配固体培养基和液体培养基，灭菌。

配BindingBuffer和脱盐液各500ml。

在400ml体积时调节溶液pH值至7.4，定容后转到试剂瓶中。

溶液使用前要抽滤（滤除溶液内的气泡和不溶性杂质）。

倒板：（5个灭菌的培养皿）①微波加热溶解固体培养基（每次加热30s待有沸腾的迹象时，减少加热的时间）。

②超净台操作，以1˸1000的比例（1ml培养基~1μl抗生素）向培养基中加入Kan+(50mg/ml)，摇匀。

③倒板。

④培养皿放置在超净台上凝固，凝固后将培养皿倒着放入培养箱中15-11-4热转化：（将质粒导入大肠杆菌中）①提前将大肠杆菌（冰上融化）和质粒拿出来融化，混合（冰上操作）后冰上放置30min。

②42℃热水浴1min（超过90s会损伤细菌），取出后立即放在冰上冷却2~3min，加入1mlSOC培养基。

③摇床上摇45min，150rp，37℃。

（使菌体复苏）④离心，3000rpm3min。

⑤涂板：取200μl上述液体，喷到板上，用玻璃涂布棒涂匀，放入培养箱中30min晾干后倒着放置。

（12~16h）15-11-5配IPTG（0.2g/ml），用灭菌水，超净台操作。

挑单克隆：将细菌放入培养液中，以便进行扩大培养和后续实验）①提前准备好几支装有3ml培养基的试管，每管加入3μl Kan+抗生素(50mg/ml)，塞好塞子，试管倾斜，是抗生素溶入培养液中。

（塞子打开前和塞好后都要在酒精灯上过火灭菌）。

②小镊子过火灭菌后，夹取一个枪头，在培养皿上挑一个单个的菌落，轻轻划过。

将带有菌落的枪头放入试管中，塞好塞子（试管中培养基液澄清）③将试管放在摇床中培养一晚，37℃,250rpm。

（尽量不超过12h）【试管中培养基液变混浊】注意：操作尽量在靠近酒精灯的地方进行。

15-11-6扩大培养、诱导表达①以（抗生素˸培养基）1˸1000的比例向培养基中加入Kan+抗生素，摇匀后再加入（100ml培养基）1ml单克隆溶液，摇匀。

蛋白表达操作流程

蛋白表达操作流程：
1、感受态细胞的制备
OD590≈0.375，3mL分装到两个EP管，4℃，5000转离心3分钟；沉淀重悬于500 uL 0.1M CaCl2中；4℃，5000转离心3分钟，沉淀重悬于200 uL 0.1M CaCl2中。

Note:所有操作都要在冰上进行，确保低温。

2、构建好的载体的转化
1uL PGS-21a 加到100 uL感受态细胞BL21（DE3）中,孵育30~40 min，42℃热激2 min，立即置冰上3 min，加650 uL LB（37℃），37℃，200 rpm摇1 h，室温，5000转离心3分钟，留大约150 uL涂板，37℃培养箱培养过夜。

3、蛋白的诱导，表达
挑抗性板上单克隆，接种到4 mL LB（含抗性）中，37℃，200 rpm 摇过夜，保存菌种，转接到新鲜的LB（含抗性）中，摇OD590≈0.6，加入IPTG至终浓度为1 mM IPTG，37℃诱导5 h。

（每份做两管，一管加IPTG，一管不加，做为阴性对照）
4、表达蛋白的检测
4℃，5000转离心5 min，收集菌体，重悬于0.25倍体积预冷的20 mM Tris-HCl（PH8.0）,100℃煮5 min，10000转离心，取上清，进行SDS-PAGE电泳检测。

Note:低温操作。

IPTG诱导蛋白表达

IPTG诱导蛋白表达E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。

I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。

在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（C AP）结合位点。

由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。

在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。

此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。

当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。

在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。

乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。

后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。

异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃ 保存。

( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。

IPTG

lac operon中, CAP 正性调节与lac阻遏物负性调节共存。当葡萄糖水平下降时，细胞内cAMP水平升高并结合到CAP 上，cAMP-CAP 复合物结合到 lac operon 刺激增强转录。
低半乳糖时
葡萄糖低 cAMP浓度高
高半乳糖时
RNA-pol
O
葡萄糖高 cAMP浓度低
O
mRNA
O
O
小结

乳糖操纵子受到两种调节：
① ②
阻遏蛋白的负调节， CAP的正调节。

一个操纵子中的一组基因有两道控制开关，只有两道开关同时打开时, 即只有在缺乏葡萄糖并存在乳糖时,基因才能够转录。
乳糖操纵子诱导物

乳糖操纵子的安慰诱导物除了异丙基巯基半乳糖苷（IPTG)，还可以是巯基半乳糖苷（TMG）、O硝基半乳糖苷（ONPG)。 IPTG为常用的诱导物，是一种十分有效的乳糖操纵子的诱导剂,可与阻遏物结合促进基因的表达。然而由于IPTG对于人体具有潜在的毒性,当利用 IPTG诱导表达应用于人体的重组药物时,有可能对最终的产品带来一些不利影响，一般用量为0.5mM。

别乳糖(allolactose)是诱导物. 异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG ， isopropylthiogalactoside)：是一种半乳糖苷的化和物，能被β-半乳糖苷酶识别,并与阻遏蛋白结合,但不被细菌分解且性质稳定，在实验室被广泛用作诱导剂。)
（三）CAP/CRP的正性调节
+ + + + 转录 DNA

CAP (catabolite activator protein, 分解代谢物激活蛋白) 涉及到正性调节. CAP 又称为 CRP (cAMP receptor protein), lac operon高水平转录必需的一个激活蛋白。

IPTG诱导表达

原核生物的转录单位是操纵子，操纵子包括相关结构基因及其上游的调控序列。
调控序列
结构基因
乳糖操纵子（元）调节机制
操纵序列O
调控区
乳糖操纵子结构基因
启动序列P 调节基因 I Z 半乳糖苷酶 Y A 透酶乙酰基转移酶
操纵子
I
CAP P O
Z
调控区
P：启动序列 O：操纵序列
Y 结构基因
X
I：调节序列
lac recA
Ara BAD
TTGATA
CTGACG TTGACA
共有序列

蛋白样品制备
取1.5ml诱导后菌液及预先准备的未诱导培养的菌液离心，将沉淀部分加入相同体积的蒸馏水与上样buffer，将蛋白样品于沸水中加热10 分钟，离心取上清进行SDS-PAGE，检测融合蛋白的表达情况。
RNA聚合酶保护区结构基因
5 3 5 3 -35 区 TTGACA AA C T G T RNA-pol辨认位点 (recognition site) 开始转录 -10 区 T A T A A T Pu A T A T T A Py (Pribnow box) 3 5 3 5
乳糖（-）
I
诱导物
CAP
P
O
Z
Y
X
乳糖（+）
I
CAP
P
O
Байду номын сангаас
Z
Y
X
要点
阻遏蛋白的负性调节真正的诱导剂是半乳糖异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）
pGEX-4T载体图谱
IPTG诱导表达实验步骤
第一天在超净台中将含有PGEX-4T-2空载体的甘油菌 5ul接种在5ml的LB培养液中，摇床过夜。第二天 • 将含有PGEX-4T-2空载体的过夜菌按照1:200比例接种至100mlLB中， 37℃振荡培养2.5小时。 • 留取1.5ml菌液作为未诱导培养的对照。 • 在超净台中加入终浓度为0.4-1mM的IPTG于30℃ 诱导表达3.5小时。

IPTG诱导的外源蛋白表达课件

2.3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控
细菌中的cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解产生能量时，cAMP生成少而分解多，cAMP 含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。
2.3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控
细菌中有一种能与cAMP特异结合的cAMP 受体蛋白CRP（cAMP receptor protein），当CRP未与cAMP结合时它是没有活性的，当cAMP浓度升高时，CRP 与cAMP结合并发生空间构象的变化而活化，称为CAP（CRP-cAMP activated protein），能以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。
量可增加1000倍。这就是乳糖对lac操纵元的
诱导作用。
SUCCESS
THANK YOU
2019/9/10
可编辑
2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控
在这过程中乳糖（实际起作用的是别乳糖）就是诱导剂，与R结合起到去阻遏作用（derepression），诱导了利用乳糖的酶类基因转录开放
2.1 乳糖操纵元（lac operon）
乳糖操纵元含有ｚ、ｙ和ａ3个结构基因。ｚ基因表达产物为β -半乳糖苷酶，催化
乳糖转变为别乳糖(allolactose)，再分
解为半乳糖和葡萄糖；ｙ基因编码半乳糖透过酶，促使环境中的乳糖进入细菌；ａ
基因编码转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化。
2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控
2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控
当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，
lac操纵元处于阻遏状态。此ｉ基因在其自身的启动子Pi控制下，低水平、组成

IPTG诱导蛋白表达全面介绍Word版

IPTG全面介绍：优点·使用·配制·特点摘要 : 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。

IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。

它常与 X-Gal 或 Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导 lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。

IPTG 与 lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因 lacZ 的抑制。

中文名：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)英文名称：Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside用途：异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。

IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。

它常与 X-Gal 或 Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导 lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。

IPTG 与 lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因 lacZ 的抑制。

使用方法：首先把IPTG配制成23.83 mg/ml(100 mM)的水溶液，并进行过滤除菌后保存。

然后在100 ml的琼脂培养基中，加入100 μl 的上述溶液、200 μl的X-Gal(20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100 μl的Amp(100 mg/ml)，制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。

当dna 片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体)，然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。

配制方法：在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。

蛋白质诱导方法[1]

蛋白质诱导步骤：
1. 一次活化：将10μL菌液加入到10mL LB培养基（含5μL卡那）中，37℃振荡培养过夜（卡那终浓度50ug/ml）
2. 二次活化：取100μL一次活化菌液加入到10 mL LB培养基（含5μL卡那）中，37℃摇床培养1～2小时（OD＝0.4～0.6）后，分装到1mL EP管中，加入不同浓度的0.5ug-0.7-1.0 IPTG诱导，30，37℃振荡培养4小时左右（0.7,30℃效果好，每小时取样一次，设对照）
3.1ML,0.1%SDS,10000rpm，离心1min，弃上清，加50μL蛋白上样缓冲液吸打混匀，煮沸10min，10000rpm，离心1min，取10μL上清进行SDS－PAGE电泳。

将测序正确的载体pET-41b-CecD 转化到感受态大肠杆菌BL21 中，挑单克隆接种于含卡那霉素的LB 液体培养基中，37 ℃、250 r /min 振荡培养12 h，按1∶100 的体积比，将培养的菌液接到新的含卡那霉素的LB 培养基中，37 ℃培养至OD600为0. 6 ～0. 8，加入1 mmol /L异丙基β-D 硫代半乳糖苷( IPTG) 于37 ℃诱导4 h，离心收集菌体，PBS 重悬，冰浴下超声波破碎菌体，离心收集上清和沉淀，10% SDS －PAGE 电泳分析。

表达条件优化分2 组进行，1 组分别诱导1、3、4、6 h，取样; 另1 组分别以IPTG 终浓度0. 01、0. 02、0.
05、0. 10、0. 50 mmol /L 进行诱导，取样。

IPTG诱导蛋白表达全面介绍Word版

IPTG全面介绍：优点·使用·配制·特点摘要 : 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。

IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。

它常与 X-Gal 或 Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导 lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。

IPTG 与 lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因 lacZ 的抑制。

中文名：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)英文名称：Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside用途：异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。

IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。

它常与 X-Gal 或 Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导 lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。

IPTG 与 lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因 lacZ 的抑制。

使用方法：首先把IPTG配制成23.83 mg/ml(100 mM)的水溶液，并进行过滤除菌后保存。

然后在100 ml的琼脂培养基中，加入100 μl 的上述溶液、200 μl的X-Gal(20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100 μl的Amp(100 mg/ml)，制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。

当dna 片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体)，然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。

配制方法：在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。

IPTG诱导表达步骤

大肠杆菌中蛋白质诱导表达
(一)材料
1. IPTG(用去离子水配成1 00mM，用0.22μm滤器过滤除菌，-20℃保存)
2. 10xPBS缓冲液: NaCl 1.37 M
KCl 27 mM
Na2HPO4 100 mM
KH2PO420 mM
3. PMSF(用异丙醇配成10mM，-20℃保存)
4. 10% TritonX-100
(二)方法
1. 挑取单克隆接种于少量含有抗生素的LB液体培养基中，37℃, 250rpm震荡培养过夜;
2. 将过夜培养物按1:100的比例接种到新鲜的含有抗生素的LB液体培养基中，37℃,
250rpm震荡培养2-4h至OD600为0.5;
3. 加入IPTG至终浓度为0.3mM，继续37℃, 250rpm震荡培养2-3h;
4. 4℃, 4000rpm离心10min后，去上清，加入适量IxPBS重悬，在加入PMSF至终浓度为
0.1 mM，冰上预冷10min;
5. 进行冰浴超声破碎5-10min (10-20sec/次)，至菌液较为澄清;
6. 加入10% TritonX-100至终浓度为0.5%, 4 ℃震荡15min;
7. 4℃, 12000rpm离心10min后，取上清:
8. 用相同体积的1 xPBS重悬沉淀，将诱导前及诱导后所取的样品，以及超声破碎后的上清
和沉淀分别进行蛋白电泳检测，考马斯亮蓝染色，脱色:
9. 根据脱色结果，可确定是否表达出目的蛋白，并且判断所表达的蛋白是可溶性还是以包
涵体形式存在。

7.29IPTG诱导蛋白表达

7.29IPTG诱导蛋白表达
IPTG诱导蛋白表达
1.将两个工程菌的种子液取1ml转接至50ml的离心管中，37度揺菌2到3小时，至OD 值为0.6，每个菌做3个重复。

2.将转接后的两种菌液IPTG诱导表达，分别设置3个浓度梯度，GLCNASE(周质空间表达蛋白）的浓度梯度分别为0.01mM（每10ml 菌液加1M的IPTG0.1μL),0.05mM(每10ml菌液加1M的IPTG0.5μL),0.1mM(每10ml菌液加1M的IPTG1μL)。

GLCNACASE （胞内表达蛋白）的浓度梯度分别为0.1 mM(每10ml菌液加1M的IPTG1μL),0.5mM(每10ml菌液加1M的IPTG5μL),1mM(每10ml菌液加1M的IPTG10μL).
3.每管加10mlLB培养基和10μl浓度为100mg/ml的AMP,使混合溶液的终浓度为
100μg/ml.GLCNACASE在30度揺菌4小时，6小时，8小时分别取样，GLCNASE分别揺菌2小时4小时6小时分别取样保存。

4.配制SDS_PAGE蛋白电泳用胶，存放在4度冰箱备用。

IPTG诱导方法

ITPG诱导方法1、诱导将BL-pET-FAT/CD36菌液接种到4 mL LA液体培养基中，37 ℃，200 rpm振摇培养过夜。

（IPTG浓度）取100 µL培养过夜的菌液接种到5 mL LA液体培养液中，共接8管，37 ℃，200 rpm振摇培养至OD600至0.6~0.8时，加入1 M的IPTG，使IPTG 终浓度分别为使IPTG终浓度分别为0，0.01，0.1，0.2，0.5，1，5，10 mM，置37 ℃摇床继续培养4 h，置4 ℃保存备用。

另取不含外源基因片段的质粒pET-32a(+)转化BL21感受态细胞作相同处理，加IPTG诱导4 h作为对照。

样品处理后进行SDS-PAGE分析。

（诱导时间）取100 µL培养过夜的菌液接种到5 mL LA液体培养液中，共接8管，37 ℃，200 rpm振摇培养至OD600至0.6~0.8时，加入1 M的IPTG，使IPTG 终浓度为0.5 mM，进行诱导表达，分别在诱导0、1、2、3、4、6、8、12 h时，每次取出一个离心管，置4 ℃保存备用。

另取不含外源基因片段的质粒pET-32a(+)转化BL21感受态细胞，加IPTG诱导4 h作为对照。

样品处理后进行SDS-PAGE分析。

2、样品处理（0.5 mM、6h找出最佳IPTG浓度和诱导时间）取100 µL培养过夜的菌液接种到5 mL LA液体培养液中，37 ℃，200 rpm振摇培养至OD600至0.6~0.8时，加入1 M的IPTG，使IPTG终浓度为mM，诱导h，10000 rpm离心1 min收集菌体，弃上清。

在细菌沉淀中加入1 mL 1×结合缓冲液，冰浴超声50次，每次4s，间隔9s，超声结束后13000 rpm离心30 min，分离上清和沉淀。

取上清50 µL，加入50 µL 2×SDS上样缓冲液；沉淀加入500 µL 1×SDS上样缓冲液，均在100 ℃水浴加热5 min，用于SDS-PAGE电泳3、SDS-PAGE分析（1）样品的处理取1 mL菌液，10000 rpm离心1 min，弃上清，重悬于100 µL 去离子水，加入100 µL 2×SDS凝胶上样缓冲液，涡旋混匀，100 ℃加热3-5分钟，10000 rpm 离心3 min备用。

IPTG诱导方法

ITPG诱导方法1、诱导将BL-pET-FAT/CD36菌液接种到4 mL LA液体培养基中，37 ℃，200 rpm振摇培养过夜。

（IPTG浓度）取100 µL培养过夜的菌液接种到5 mL LA液体培养液中，共接8管，37 ℃，200 rpm振摇培养至OD600至0.6~0.8时，加入1M的IPTG，使IPTG 终浓度分别为使IPTG终浓度分别为0，0.01，0.1，0.2，0.5，1，5，10mM，置37 ℃摇床继续培养4 h，置4 ℃保存备用。

另取不含外源基因片段的质粒pET-32a(+)转化BL21感受态细胞作相同处理，加IPTG诱导4 h作为对照。

样品处理后进行SDS-PAGE分析。

（诱导时间）取100 µL培养过夜的菌液接种到5 mL LA液体培养液中，共接8管，37 ℃，200 rpm振摇培养至OD600至0.6~0.8时，加入1M的IPTG，使IPTG 终浓度为0.5mM，进行诱导表达，分别在诱导0、1、2、3、4、6、8、12 h时，每次取出一个离心管，置4 ℃保存备用。

另取不含外源基因片段的质粒pET-32a(+)转化BL21感受态细胞，加IPTG诱导4 h作为对照。

样品处理后进行SDS-PAGE分析。

2、样品处理（0.5 mM、6h找出最佳IPTG浓度和诱导时间）取100 µL培养过夜的菌液接种到5 mL LA液体培养液中，37 ℃，200 rpm振摇培养至OD600至0.6~0.8时，加入1M的IPTG，使IPTG终浓度为mM，诱导h，10000 rpm离心1 min收集菌体，弃上清。

在细菌沉淀中加入1 mL1×结合缓冲液，冰浴超声50次，每次4s，间隔9s，超声结束后13000 rpm离心30 min，分离上清和沉淀。

取上清50 µL，加入50 µL 2×SDS上样缓冲液；沉淀加入500 µL 1×SDS上样缓冲液，均在100 ℃水浴加热5 min，用于SDS-PAGE电泳3、SDS-PAGE分析（1）样品的处理取1 mL菌液，10000 rpm离心1 min，弃上清，重悬于100 µL 去离子水，加入100 µL 2×SDS凝胶上样缓冲液，涡旋混匀，100 ℃加热3-5分钟，10000 rpm 离心3 min备用。

IPTG诱导外源基因表达

IPTG诱导表达原理及操作步骤E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。

I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。

在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。

由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。

在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。

此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac 阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。

当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。

在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。

乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。

后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。

异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）培养基酵母膏 (Yeast extract) 5g蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g琼脂 (Agar) 1-2%蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。

( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF）。

IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤

IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。

I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。

在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。

由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。

在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。

此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。

当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。

在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。

乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。

后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。

异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20℃ 保存。

( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。