IPTG诱导表达蛋白步骤

IPTG诱导表达蛋白步骤

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配固体培养基和液体培养基，灭菌。

配BindingBuffer和脱盐液各500ml。在400ml体积时调节溶液pH值至7.4，定容后转到试剂瓶中。溶液使用前要抽滤（滤除溶液内的气泡和不溶性杂质）。倒板：（5个灭菌的培养皿）

①微波加热溶解固体培养基

（每次加热30s待有沸腾的迹象时，减少加热的时间）。

②超净台操作，以1˸1000的比例（1ml培养基~1μl抗生素）向培养基中加入Kan+(50mg/ml)，摇匀。

③倒板。

④培养皿放置在超净台上凝固，

凝固后将培养皿倒着放入培养箱

中

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热转化：

（将质粒导入大肠杆菌中）

①提前将大肠杆菌（冰上融化）和质粒拿出来融化，混合（冰上操作）后冰上放置

30min。

②42℃热水浴1min（超过90s会损伤细菌），取出后立即放在冰上冷却2~3min，加入1mlSOC培养基。③摇床上摇45min，150rp，37℃。（使菌体复苏）

④离心，

3000rpm3min。

⑤涂板：取200μl上述液体，喷到板上，用玻璃涂布棒涂匀，放入培养箱中30min晾干后倒着放置。（12~16h）

15-11-5配IPTG（0.2g/ml），用灭菌水，超净台操作。

挑单克隆：将细菌放入培养液中，以便进行扩大培养和后续实验）

①提前准备好几支装有

3ml

培养基的试管，每管加入3μl Kan+抗生素(50mg/ml)，塞好塞子，试管倾斜，是抗生素溶入培养液中。（塞子打开前和塞好后都要在酒精灯上过火灭菌）。

②小镊子过火灭菌后，夹取一个枪头，在培养皿上挑一个单个的菌落，轻轻划过。将带有菌落的枪头放入试管中，塞好塞子（试管中培养基液澄清）

③将试管放在摇床中培养一晚，37℃,250rpm。（尽量不超过12h）【试管中培养基液变混浊】注意：操作尽量在靠近酒精灯的地方进行。

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扩大培养、诱导表达

①以（抗生素˸培养基）1˸1000的比例向培养基中加入Kan+抗生素，摇匀后再加入（100ml培养基）1ml单克隆溶液，摇匀。

②摇床上放置2.5h,37℃,180rpm

③以48μl IPTG/100ml培养基的比例加入IPTG诱导，移去牛皮纸，恒温摇床上摇6h，

30℃,180rpm。冰上放置一晚（抑制细胞生长

速率，有利于蛋白质充分折叠）

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离心收集细菌：将培养液倒入50ml 离心管中，8000rpm, 离心5min ，弃上清。沉淀加水冲洗混匀，再离心，弃上清。加PBS 冲洗混匀，离心，弃上清。加PBS 混匀，将溶液移入PU 管中，-20 ℃保存。

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破碎、离心细胞

① 4ml 细胞液用超声破碎3~4 次（探头不能碰到管底和管壁，且离管底1cm 左

右,4~7ml ），至溶液透明。

②将溶液分装到1.5ml 离心管中，（10000rpm ，4 ℃ ,10~15min ）离心2~3

次至没有白色沉淀。蛋白质纯化脱盐

①离心后得到的上清液用针筒抽取过膜，先后用镍柱纯化、

脱盐柱脱盐（柱子不能干，不能有气泡）。