第二章生产菌种的来源

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工业发酵菌种必须具备的基本特征
能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并能生成较 多的发酵产物； 培养条件如温度、渗透压等易于控制； 抗杂菌和抗噬菌体能力较强； 遗传稳定性高、不易退化； 不产生有害的生理活性物质或毒素（食品或医药微生 物菌株）
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4、性能测定（毒性试验）
自然界的一些微生物在一定条件下会产毒； 除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作 为食用无须作毒性试验外，其他均需 2年以上的毒性试 验； 医药卫生上的产品，还须通过安全试验和临床试验，获 得国家的药品生产许可证，方能使用； 生产性能测定； 生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、温度、 pH值、提取工艺等； 经自然界分离筛选获得的有价值的菌种进一步进行人工 选育。
具体方法： 在固体选择培养基中加入酶作用的底物培养微生物，能够 利用此底物的酶产生菌得以生长，并且往往会在其菌落周 围形成一透明圈。 透明圈的大小与酶活力的高低成正相关，可以作为菌种初 筛的判断标准。 如：蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、纤 维素酶等
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目的微生物筛选方法的研究进展 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。 微生物的多样性及资源的开发仍然是今后若干 年的研究重点。 －－陈文新院士 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定 目标产物的筛选方面发挥了着越来越重要的作 用。如 :16SRNA同源性分析，基因序列分析及 DNA/DNA杂交技术等。
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几种重要生物活性物质产生菌的分离方法 抗病毒药物产生菌：用小平板测定由病毒引起的细胞 变性效果，是一种有用的筛选方法；检测病毒复制中 特有的DNA复制酶和核酸合成酶的酶抑制剂，是另一 种选择性更高的筛选方法。
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生长因子产生菌：通过观察分离菌能否促进营养 缺陷型菌株的生长来检出。 免疫激活剂产生菌：可以用细胞表面酶的抑制法， 筛选免疫激活剂产生菌； 多糖产生菌：可以通过菌落外观的观察来识别 （黏稠)
采样对象 土壤是微生物生长的大本营（材料来源越广泛，越有 可能获得新的菌种，特别是一些极端环境中）。
田园和沼泽土：细菌和放线菌为主 芽孢杆菌、病毒 油田、炼油厂：分解石油微生物 锅炉边：耐热酶制剂 污染水域：环保微生物 极端环境：适应了各种环境压力的微生物类群
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微生物是地球上分布最广泛、物种最丰富的生物种群； 能够生活在动物和植物可以生存和不可生存的地方； 可以生产许多特殊的生理活性物质(为适应环境、生 存压力）
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一）新菌种分离与筛选的原则
了解所需菌种的生长特性，然后制定分离、筛选方案
生产实际需要 目的代谢产物的性质
微生物可能的分类地位 微生物的生态环境
第二章
生产菌种的来源
Gaoys
发酵工程三要素
生产菌种的性能
发酵及提纯工艺条件
发酵工程
生产设备
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一、获得生产菌种的方法 菌种是发酵工业的“灵魂”
来源： 直接向有科研单位、高等院校、工厂索取或购买，从 中筛选所需菌株； 向国家及国外菌种保藏中心索取或购买； 从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋 白酶产生菌； 从大自然中分离筛选新的微生物菌种（所有发酵菌种 的最初来源）。
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恒化式富集培养（连续培养） 通过改变限制性基质的浓度，来控制两类不同菌株的比 生长速率µ。通过改变稀释速率进行连续富集培养，获 得所需要的菌种。 特点： 分离得到的菌种特别适合用于连续发酵生产； 可用于分离适应某种工业生产需要特性的菌株； 可筛选出能共生的稳定混合菌群。
固体培养基常用于分离各种酶产生菌
多数样品目的菌非优势菌或数量有限，为了增加分离 成功率，可通过富集培养增加待分离菌的数量 利用不同种类微生物生长繁殖对环境和营养的要求不 同，如温度、pH、氧气、渗透压、碳源、氮源等。
P17 表2-3 几种选择性培养基分离放线菌 表2-4 分离不同微生物时常用的抗生素或试剂
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氧控制
好氧微生物 厌氧微生物 嗜热微生物 非嗜热微生物 嗜酸微生物 嗜碱微生物
富 集
高温
pH条件
培养基营养成分（使某种碳源、氮源成为唯一碳源、氮源等） 在分离培养基上加入不同类型的抗生素
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富集（enrichment)培养
富集培养：目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设 计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最 适的环境下迅速生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势 种变为人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。
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3、菌种的分离（筛选）Separation(screening) 在自然界中获得的标本是很多种类微生物的混杂物
平板划线分离法； 纯种分离方法 平板稀释分离法； 涂布分离法等。
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施加选择性压力分离法
菌种分离
随机分离法
小型三角瓶发酵试验，采用与工业生产相近的培养基 和培养条件。
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1) 施加选择性压力分离法
选择性高的筛选方法 生产菌种
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1、标本采集
1)采样和采集方法
★从特定生态系统中分离具有代表性的细菌菌群（分离 那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重 视样本的采集）。 ★样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、 镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。
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2)采样的注意事项 采样时应尽可能保持相对无菌； 所采集的样本必须具有某种代表性； 采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地 点以及采集地点的地理环境条件、生态参数等，以备 查考； 采样的季节性和时间因素（真正的原地菌群的出现可 能是短暂的）； 为减少微生物数量和类型变化，采好的样及时处理， 暂不能处理的应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。
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2）物理、化学和诱饵技术等方法的预处理
不同温度处理：热处理方法可以减少材料中不耐热的菌株； 膜过滤法：浓缩水中的细胞，滤膜品种对收集菌的类型有重要影响； 离心法：可以浓缩水中的细胞； 空气搅拌法：将含孢子的空气撞击到平板上，减少分离中的细菌数 成分 pH 石蜡棒
物理
化学
诱饵法
花粉 蛇皮 毛发
将诱饵固体物质加在待分离的土壤或水中， 待其菌落长出后再铺平板分离
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2、采样标本预处理 在分离之前，对含微生物的采集标本进行预处理，可 大大提高菌种分离的效率。
增殖培养 物理、化学和诱饵技术等方法的预处理（P16）
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1）增殖培养
通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。 如碳源的控制： 唯一碳源的确定，糖、淀粉、纤维素、石 油等 大肠杆菌，用麦康凯培养基； 沙门氏菌，用胆硫琼脂平板
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二、生产菌种的分离（separation）
新菌种的分离:从混杂的各类微生物中依照生产的要 求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地 把所需要的菌种挑选出来； 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重 新进行分离纯化； 优良的菌种的筛选和分离，必须要有合适的工艺条件 和合理先进的设备与之配合。
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如何获得生产菌种？
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稀释法、扩散法和抑菌圈法等。
稀释法：将抗生素或发酵产物按一定倍数逐级稀 释，每级接种一定浓度的指示菌，经过一定时间 培养后便可得到抑制指示菌生长的最大稀释倍数， 再与标准抗菌物质作比较，就可推算出发酵产物 的相对抑菌强度（效价）。
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扩散法：将抗生素或发酵液通过一定的载体置于平 板上，由于扩散作用，平板上可形成一个以加样处 为中心的浓度梯度圈，离中心越远，浓度越小。事 先在平板上涂布指示菌，经过一定时间培养后，浓 度高的地方指示菌不能生长，浓度低的地方能生长， 就可形成一个抑菌圈，观察抑菌圈的大小。
底物（营养成分） 培养温度 抗生素
pH条件 培养时间 氧的控制
目的微生物在种群中占优势
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抑 制 不 需 要 的 菌 类
控 制 培 养 条 件
控 制 营 养
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富集培养的方法
分批式富集培养（摇瓶培养）
施加选择性压力培养法
恒化式富集培养（连续培养）
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分批式富集培养（摇瓶培养）
分批式富集培养：将富集培养物转接到新的同一种 培养基中，重新建立选择性压力，如此重复转种几次 后，再取此富集培养物接种到固体培养基上，以获得 单菌落。 分批式富集培养中，转种的时间是关键，应在所需 菌种占优势情况下转种。
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菌种分离的两种方案
定向培养:采用特定的有利于目 的微生物富集的条件，进行培 养。 随机分离方法：不能提供任何 有助于筛选产生菌的信息时只 能通过随机分离的办法
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2）随机分离方法
有些微生物的产物对产生菌的筛选没有直接的 选择性指示作用，因此利用随机分离的方法进 行分离。
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抗生素产生菌的筛选和分离
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试验菌的选择是成功的关键，它直接与检 出的灵敏性、抗菌素的活性和抗菌谱有关； 专一性强的筛选技术，主要是利用与抗生 素作用机制相关的酶、酶抑制剂、激活剂、 抗体等
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几种重要生物活性物质产生菌的分离方法
抗肿瘤药物产生菌：利用DNA修复能力突变株进行 抗肿瘤药物的筛选；
几种重要生物活性物质产生菌的分离方法 酶抑制剂（药物）产生菌：某种化合物能在体外抑制 某种关键的人体酶，它就可能在体内有药理作用。故 主要选择与生理和病理关系明确的酶为靶酶进行筛选