DNA侧翼未知序列获取的方法

染色体步移技术(Genome walking）：这是一项重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。染色体步移技术主要有以下几方面的应用：

①根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究；

②步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；

③鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等；

④用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；

⑤用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接。

对于基因组测序已经完成的少数物种（如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等）来说，可以轻松地从数据库中找到某物种已知序列的侧翼序列。但是，对于大多数生物而言，在不了解它们的基因组序列以前，想要知道一个已知区域两侧的DNA序列，只能采用染色体步移技术。常用的方法有：

1. 反向pCR（reverse PCR）:其基本点是用适当内切酶裂解核心区外分子，使这些酶切片段自身连接形成环状分子，从而将边侧区域转化为内部区域。用与核心区末端同源的引物，但其3’端趄向未知区域，可以进步用pCR扩增环中的未知区域。

反向pCR程序

目前，反向pCR所扩增的片段的大小实际上限为3-4kb。在许多情况下，首先需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向pCR的片段的末端片段。能裂解核心区的内切酶使反向pCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类型决定的接点。对于扩增左翼或右翼序列，初试时最好靠近识别上个碱基位位的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向pCR 从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入合适的酶切位点。

用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环。在一些实验中，为产生对反向pCR大小适当的DNA片段需要两种内切酶，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环化前需用Klenow或噬菌体T4DNA聚合酶修理(钝化)。连接前，需用酚或热变性使内切酶失活。

聚合酶链反应条件与经典所用的相同，例如，94℃-30秒变性，58℃-30秒引物退火， Taq聚合酶70℃延伸3分钟，进行30个循环。将反向 pCR用于测序时，与核心区末端后部结合的扩增引物更为有用，它使测序引物扩增部分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近，减少了扩增引物的干扰。

2. 接头PCR技术：接头PCR技术的原理为,首先设计一个长链接头和一个与之互补的短链接头,并在短链接头的3′端设计一个NH2序列,以阻止聚合酶催化的短链延伸。两条单链退火后形成的双链接头能在3′端形成一个酶切位点的粘性或平末端,然后选用能形成该酶切位点末端的限制性内切酶酶切基因组,形成

大量大小不一的酶切片段,将这些片段与接头连接,取适量连接产物为模板,一端以接头引物,另一端以基因特异引物进行两轮嵌套PCR反应李鹏丽等利用该方法分离了大豆中与衰老相关的类受体蛋白酶基因rlpk2 5′上游1801 bp片段。功能分析表明,该启动子能驱动GUS基因在大豆幼苗生长点和番茄愈伤组织中瞬时表达,具有启动子活性。

3.热不对称交错式PCR技术( thermal a sym-metric in terlaced PCR, TAIL-PCR) ：TA IL-PCR技术的基本原理是利用目标序列旁侧的已知序列设计3个嵌套的特异引物( special p rimer,约20bp ) ,用它们分别和1个具有低Tm值的短随机简并引物( ar-bitrary degenerate p rimer,约14bp)相结合,以基因组DNA作为模板,根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环,通过分级反应扩增特异产物。该技术最早由L iu等提出,此后由于该方法可以直接以基因组DNA 为模板,高效快捷地克隆未知序列而得到广泛的应用。Terauchi等改进了传统的TAIL-PCR方法,采用RAPD引物为随机引物,同时设计5个基因特异引物进行5轮嵌套PCR以增加反应的特异性,并用该方法获得了洋芋苯丙氨酸裂解酶基因5′上游序列。陈军营等在克隆小麦GLP3基因启动子时将传统TA IL-PCR的第1轮PCR反应的前10个降低严谨度的循环省去,分别延长了3轮PCR反应中的变性时间和延伸时间,同时增设了不同的退火温度,得到了1748 bp的GLP3基因上游侧翼序列,测序结果表明该序列还有TATA-box、CAAT-box等核心启动子元件,为小麦GLP3启动子序列。

以PCR技术为基础的染色体步移的主要问题是，在预先不了解未知区域序列信息的情况下，如何设计两个特异性引物来扩增未知区域。而传统的染色体步移方法，如：反向PCR法、连接接头法等，都有操作复杂、非特异性扩增、连接效率低等弊端。