溶菌酶

⑵ 装柱：取直径1.6cm，长度为30cm的层析 柱，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液， 关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的 溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积至15～ 20cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH6.5, 0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液 pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持液面高出 树脂表面1cm左右。 ⑶ 上柱吸附：将上述蛋清溶液仔细直接加到 树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内，流 速为1ml/min。
⑷ 洗脱：用柱平衡液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的 过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱 情况，当基线开始走平后，改用含1.0mol/L NaCl的 pH值6.5，浓度为0.02 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，收 集洗脱液。 ⑸ 聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液合并装入透析袋内， 置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加盖，酶液中 的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。当浓缩 到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇， 小心取出浓缩液。 (6) 透析除盐：蒸馏水透析除盐24小时。
三.溶菌酶分布
1.1 鸡蛋清溶菌酶：鸡蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白的 3.4％～3.5％， 作为溶菌酶类的典型代表，是目前重点研究的对象，也是了解最清 楚的溶菌酶之一。它由18种129个氨基酸残基组成， 具有4个S-S 键，其分子量为14 000，最适pH为6～7。在pH4～7、100℃处理1 分钟不失活.鸡蛋清溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，其 水解位点是N-乙酰胞壁酸(NAM)的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺 (NAG)的4位碳原子间的β-1，4糖苷键。肽聚糖是细菌细胞壁的主 要成份，它是由NAM、NAG和肽“尾”(一般是4个氨基酸)组成， NAM与NAG通过β-1.4糖苷键相连，肽“尾”则是通过D-乳酰羧基 连在NAM的第3位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”(肽键或少数几 个氨基酸)连接，NAM、NAG、肽“尾”与肽“桥”共同组成了肽 聚糖的多层网状结构，作为细胞壁的骨架，上述结构中的任何化学 键断裂，皆能导致细菌细胞壁的损伤。对于G+细菌与G-细菌，其 细胞壁中肽聚糖含量不同，G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成， 而G-细菌只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶对G+细菌的作用优 于对G-细菌的作用。
1.3 植物溶菌酶：目前已从木瓜、无花果、芜菁、大麦等植物中分 离出溶菌酶，其分子量较大，约为24000～29100。植物溶菌酶对 溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3，但对胶体状甲壳 质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。 1.4 微生物产生的溶菌酶：人们从60年代开始，发现微生物也能产 生溶菌酶，并且进展很快。目前微生物产生的溶菌酶大体上分以下 5种：（1）内N-乙酰已糖胺酶，此酶同于鸡蛋清溶菌酶，破坏细菌 细胞壁肽聚糖中的β-1，4糖苷键。（2）酰胺酶，切断细菌细胞壁 肽聚糖中NAM与肽“尾”之间的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸键。（3） 内肽酶，使肽“尾”及肽“桥”内的肽键断裂。（4）β-1，3、β-1， 6葡聚糖酶和甘露聚糖酶，此酶分解酵母细胞的细胞壁。（5）壳多 糖酶，这是分解霉菌细胞壁一种溶菌酶。
在1965年,David Phillips 和他在牛津的同事以 0.2nm分辨率的X射线 晶体结构分析法阐明 了溶菌酶的三维结构.
溶菌酶相对分子质量为14.6X103，由 129个氨基酸组成的单肽链蛋白质， 含有4对二硫键。 溶菌酶分子近椭圆形，大小为 4.5nmX3.0nmX3.0nm。它的构象比较 复杂，α螺旋仅占25%，在分子的一些 区域有伸展着的β片层构象。
3.D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析 ⑴ D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗 去杂物，滤出，用1mol/L NAOH 搅拌浸泡并搅 拌4～8小时，抽滤干, 用蒸馏水洗至近pH7.5, 抽滤干, 再用1mol/L HCl按上述方法处理树脂， 直到全部转变成氢型，抽滤干HCL, 用蒸馏水 洗致近pH5.5，保持过夜，如果pH之不低于5.0， 抽滤干HCL,用2mol/L NAOH 处理树脂使之转变 为钠型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加pH6.5 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡树脂。
用大小不同的NAG寡聚体作底物测定被溶 菌酶水解的相对速率，结果发现，少于4 个糖的寡聚体水解速率甚小，当由四聚体 增加到五聚体时，水解速率猛增500倍， 五聚体增加到六聚体，速率增加近8倍， 六聚体增加到八聚体，速率不再变化。这 种情况与X射线晶体结构分析结果一致， 活性部位所在的裂缝(cleft)正好被6个糖残 基所装满。
溶菌酶的内部几乎全部是非极性的。疏 水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起 重要作用。在溶菌酶分子的表面，有一 个比较深的裂缝，其大小恰好能容纳多 糖底物的6个单糖，这是溶菌酶的活性 部位。
溶菌酶是一种葡糖苷酶，能催化水 解NAM的C1和NAG的C4之间的糖苷 键，但不能水解NAG C1和NAM C4之 间的β（1-4）糖苷键。几丁质是甲 壳类动物甲壳中所含的多糖，仅由 NAG残基通过β（1-4）糖苷键连接 而成，几丁质也是溶菌酶的底物。
1.2 人及哺乳动物溶 菌酶：人溶菌酶存在于眼泪、唾液、 鼻粘液、乳汁等分泌液以及淋巴腺和白血球中， 1ml眼泪 中含7mg溶菌酶，1ml乳汁中含0.1～0.5mg。人溶菌酶由 130个氨基酸残基组成，有4个S-S键，分子量为14600， 其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍。对于哺乳动物溶菌酶， 目前仅从牛、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶，其化 学性质与人溶菌酶相似，但结构尚不清楚，其溶菌活性也 远低于人溶菌酶约3000倍。人及哺乳动物溶菌酶的作用 机制与鸡蛋清溶菌酶相同。
四·溶菌酶的制备.分离. 活力测试 · . .
溶菌酶（ 实验原理：溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在 ） 1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称 年发现的，它是一种有效的抗菌剂， 年发现的 溶菌酶， 粘肽N-乙酰基胞壁 为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽 乙酰基胞壁 ， 溶菌酶 又称作粘肽 酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸52 酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸 和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶 糖苷水解酶， 和谷氨酸 ，是一种糖苷水解酶，能催化水解 粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖 乙酰氨基葡萄糖（ 粘多糖的 乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰 ） 乙酰 胞壁酸（ 糖苷键， 胞壁酸（NAM）间的 ，4糖苷键，相对分子 ）间的β-1， 糖苷键 质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其 氨基酸残基构成， 质量 ， 氨基酸残基构成 中含有较多碱性氨基酸残基， 中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高 左右， 达10.8左右，最适温度为 左右 最适温度为50OC，最适 为6～7 ，最适PH为 ～ 左右。 的消光系数[ 左右。在280nm的消光系数 ]为13.0。该酶活 的消光系数 为 。 性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10性可被一些金属离子 、 、 （ 5～10-3M）以及 乙酰葡萄糖胺所抑制，能被 乙酰葡萄糖胺所抑制， ～ ）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制 Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、 ）、NaCl所激活。 所激活。 、 （ ～ ）、 所激活
四.溶菌酶的作用机理 溶菌酶的作用机理
溶菌酶种类及作用机制溶菌酶按其所作用的微生物不同 分两大类，即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。 细菌细胞壁溶菌酶有两种，一种是作用于β-1，4糖苷键 的细胞壁溶解酶，另一种是作用于肽“尾”和酰胺部分 的细胞壁溶解酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁 溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶。溶菌酶广泛地分布于自然 界中，在人的组织及分泌物中均可以找到，动物组织中 也有，以鸡蛋清中含量最多。其它植物组织及微生物细 胞中也存在。根据来源不同，其性质及作用机制略有差 异。
溶菌酶
• 组员.刘英炜，甘文圣 ，牛根坡，石方.
一·溶菌酶定义：溶菌酶（lysozyme） 又称 胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚 糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏 多糖的碱性酶。
二·溶菌酶是百度文库何被发现的？
1922年的一天，正 在感冒的英国细菌 学家Alexander Fleming发现，把一 些鼻粘液加入细菌 的培养基后会引起 细胞的溶解。而这 种存在于鼻粘液中 的能杀死细菌的重 要物质被认为是一 种酶， Fleming命名 其为溶菌酶 （ Lysozyme ）。
⑷ 聚乙二醇浓缩：合并活性峰溶液，用聚乙二醇 浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚 乙二醇，小心取出浓缩液。 ⑸ 透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时。收集透析 液，量取体积。 5. 溶菌酶活力测定 ⑴ 酶液配制：准确称取溶菌酶样品5mg, 用 5mg, 0.1mol/L,pH6.2磷酸缓冲液配成1mg/ml的酶液， 再将酶液稀释成50µg/ml. ⑵ 底物配制：取干菌粉5mg加上述缓冲液少许， 在乳钵中（或匀浆器中）研磨2分钟，倾出，稀 释到15～25ml，此时在光电比色上的吸光度最好 在0.5～0.7范围内。
（3 ）活力测定：先将酶和底物分别放入25℃恒 温水浴预热10分钟，吸取底物悬浮液4mL放入比 色杯中，在450nm波长读出吸光度，此为零时读 数。然后吸取样品液0.2mL（相当于10µg酶）， 每隔30s读1次吸光度，到90s时共计下四个读数。 活力单位的定义是：在25℃，pH6.2，波长为 450nm时，每分引起吸光度下降0.001为1个活力 单位。 酶的活力单位数=△A450nm/t×0.001 比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质
4.Sephadex G50分子筛柱层析 ⑴ 装柱：先将用20%乙醇保存的Sephadex G50抽滤 除去乙醇，用6g/LNaCl溶液搅拌Sephadex G50数分 钟，再抽滤，反复多次直至无醇味为此。(如果 Sephadex G50是新的，则按实验五中的方法处理凝 胶)。加入胶体积1/4的6g/L NaCl溶液，充分搅拌， 超声除去气泡，装入玻璃层析柱（1.6×50cm）， 柱床45cm。 ⑵ 上样：与实验五中的方法相同。 ⑶ 洗脱:样品流完后，先分次加入少量6g/L NaCl洗 脱液洗下柱壁上的样品，连接恒流泵，使流速为 0.5mL/min，用部分收集器收集，每10分钟一管。
【实验操作】 1.蛋清的制备 将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清 流出（鸡蛋清pH值不得小于8），轻轻搅拌5分钟， 使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带 块，量体积约为100ml。
2.鸡蛋清粗分离 按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边加入等体积的去 离子水，均匀后在不断搅拌下用1mol/L HCl调pH 值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。
【实验材料】 1.实验器材 循环水式真空泵 HSB-IⅡ; 蛋白紫外检测仪; 记录仪; 紫外分光光度计; 梯度混合器 (500mL); 721型光分光光度计; 冰冻离心机； 冰箱；透析袋；酸度计；部分收集器；恒 流泵；圆盘电泳装置；恒温水浴锅；层析 柱(2.6×50cm)(1.6×30cm)；布氏漏斗 (500mL)；吸滤瓶(1000mL)；G-3砂芯漏斗 (500mL)
2实验试剂 ⑴ 鸡蛋清（鲜鸡蛋） ⑵ 底物微球菌粉 ⑶ D152大孔弱酸性阳离子交换树脂 ⑷ 固体氯 化钠（NaCl）；固体硫酸铵(NH4)2SO4；固体磷酸 氢二钠（Na2HPO4•12H2O）；固体磷酸二氢钠 （NaH2PO4•2H2O）；固体磷酸钠（Na3PO4） ⑸ 乙醇；蒸馏水；甲醇；考马斯亮蓝；三氯醋酸； 丙酮 (6) 溶菌酶标准品；Sephadex G50 ⑺ N-乙酰葡萄糖胺；硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌； 氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸 ⑻ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂；蛋白含量测定 （福林法）试剂 ⑼ 聚乙二醇-20000、两性电解质