第七章 特殊毒性及其试验与评价方法(1)

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最高剂量组剂量应该超过预期人类实际接触 水平，希望能使亲代动物出现轻度中毒，但 不出现死亡或死亡率不超过10%，也不能完 全丧失生育能力。 低剂量组的亲代动物不应观察到任何中毒症 状。 另设中间剂量组应仅能出现极为轻微的中毒 症状。 中间剂量与高剂量和低剂量应呈等比级数。
①三代两窝生殖试验
大鼠断奶或出生8周后，开始喂受试物或以
其它方式与受试物接触，共进行8～12周，
即直到性发育成熟，相当出生后4个月左右。 每周至少称体重一次，记录进食量并观察 有无中毒症状或死亡。
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将雌雄亲代动物（F0）同笼交配，雌雄比
例为1︰1或2︰1，直到受孕或进行3周为
生殖毒性试验的目的在于了解外源化学物 及其代谢产物对机体成年哺乳动物的生殖 功能和生育力的影响。 多代繁殖试验在整个生命期内接触受试化 学物，更符合人类实际生活中长期低剂量 接触食品添加剂、微量重金属、农药及环 境污染物的情况。
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（1）试验方法原则
生殖毒性试验多用性成熟大鼠，也可用小鼠或 家兔。大鼠自然受孕率较小鼠为高，较为理想。 一般设三个剂量组，另设对照组。
构的缺陷。如后天生长发育或生殖功能受影响。
受试动物接触外源化学物的方式与途径应与人体实 际接触情况一致，一般多经口给予，雌鼠妊娠的第 7～15天染毒，常用灌胃方式。 试验期间每2～3天称取孕鼠体重。通过体重变化可 观察受试动物的妊娠情况和胚胎发育情况。 受孕鼠的体重如持续增长，则表示妊娠过程及胚胎 发育正常；如体重停止增长或下降，可能由于受试 物的毒性作用或母体的其它原因，引起胚胎死亡或 流产。
(3)动物交配处理
将性成熟雌雄动物按雌雄l︰1或2︰1比例同 笼交配。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各 剂量组和对照组。
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由于致畸作用有极为明确的敏感期，应精确掌 握动物接触受试物的时间，必须在器官发生期。 如提前在着床前接触，将影响受精卵的着床。 如在胚胎发育的最初阶段，例如裂卵期和囊胚 期接触受试物，往往可使胚胎死亡，不能造成 畸形。如在器官发生期以后接触受试物，则各 种器官已发育成熟，致畸作用不易表现。 只有器官发生期的胚胎，对致畸物最为敏感， 易于出现畸形。
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传统常规致畸试验
(1)动物选择
(2)剂量分组
(3)动物交配处理
(4)胎仔检查
(5)数据处理
(6)结果评定
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(1)动物选择
致畸试验的动物选择，除参照毒性试验中选
择动物的一般原则（食性和对受试物代谢过
程与人类接近，体型小，驯服，容易饲养和 繁殖及价廉）外，还应特别注意妊娠过程较 短、每窝产仔数较多和胎盘构造及厚度与人 类接近等特点。
往在笼下粪便盘中检出。发现阴栓或检出精子， 即为受孕0日，也有作为受孕第1日。
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亲代动物（F0）所生仔鼠为第一代（F1）。出生后应检查每窝幼 仔数、死亡数以及肉眼可见幼仔畸形。出生后第4天和第21天逐个 称取重量，仔鼠断奶后，母鼠休息10天，再与雄鼠交配一次，并生 出第二窝仔鼠，亲代共生出仔鼠两窝，分别为F1a和F1b。F1b出生 后，将雄性亲鼠淘汰，雌性亲鼠继续喂受试物，直至F1b出生后21
活动及行为的缺陷或异常。功能不全或异
常往往在出生后一定时间才被发现，因为
正常情况下，有些功能在出生后一定时间
才发育完全。
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④胚胎或胎仔致死作用
某些外来化合物在一定剂量范围内，可在胚胎或
胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使
其死亡。具体表现为天然流产或死产、死胎率增
（三）观察指标
在上述各种生殖毒性试验中，根据哺乳动物全部 生育繁殖过程，可观察下列4个指标：
1．受孕率反映雌性动物生育能力以及雌性动物受
孕情况。 受孕率= ————————×100%
交配雌性动物数 妊娠雌性动物数
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2．正常分娩率反映雌性动物妊娠过程是否受到影 响。 正常分娩率= ————————
①生长迟缓 即胚胎与胎仔的发育过程在外来化合物影响下， 较正常的发育过程缓慢。 ②致畸作用 由于外来化合物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某 种器官表现形态结构异常。致畸作用所表现的形 态结构异常，在出生后立即可被发现。
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③功能不全或异常
即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经
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通过致畸试验可以确定一种受试物是否具有 致畸作用。致畸试验是检查受试外源化学物 能否通过妊娠母体引起胚胎毒性或后代畸形 的动物试验。 胚胎在器官形成期，可因受到化学物或放射 性物质的作用，使细胞分化、器官形成和正 常发育受到阻滞，以致出现胎仔器官的器质 性缺陷而呈现畸形。
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致畸作用包括：
1. 母体效应: 受试物对母体产生了损害作用，
从而影响了正常妊娠，而不是对胚胎的直接损
害。 2. 胚胎效应: 受试物对胚胎的直接损害作用。 3. 出生前胎儿效应: 出生胎儿出现外表或内脏 畸形。
4. 出生后效应: 引起子代的生理功能或生理结
加。
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发育毒性研究的目的是通过计数胚胎或 胎仔吸收或死亡数，测量胎仔的重量和 性别比，检查外观、内脏和骨骼的形态， 来识别受试物有无对胚胎或胎仔的致死、 致畸或其他毒性作用。
最佳联合方案是对成年动物进行染毒并包括 子代从受精卵到性成熟所有生长发育阶段。 观察期应贯穿一个完整的生命周期，以 检测近、远期效应。 最常选用的方案为三阶段试验 。
近年来许多国家与机构多规定采用两代一窝或 一代一窝试验法。 两代一窝生殖试验法基本程序与三代两窝试验 法相同，但只进行到第二代F2，每代只交配一 窝。
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两代一窝(和一代一窝)生殖试验
出生第8周给予受试物（F0） 第16~19周 雌雄交配
F1（每窝选留幼仔８只，雌雄各半） 断奶，给予受试物 F１交配 F2出生，每窝留８只幼仔 F2断奶，检查发育情况
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F0（断奶或出生８周）
第一次交配 给予受试物8到12周
第二次交配
F１a
观察三个月，喂饲普通饲 料，观察其生长发育情况
F１b
断乳后给予受试 物８到１２周
F２a
观察三个月，喂饲普通饲 料，观察其生长发育情况
F２b
断乳后给予受试 物８到１２周
F３a
F３b
2．两代一窝和一代一窝生殖试验
止。雌鼠受孕后即单笼饲养，继续接触
受试物。交配3周后，如仍未受孕，则停
止交配，并进行生殖器官病理学检查。
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确定是否受孕的方法是每日清晨进行雌性动物阴 道涂片，检查有无精子；亦可检查阴道有无阴栓 出现，以确定受精日期。小鼠阴栓可在阴道口存
留较长时间，但在大鼠极易脱落，次晨检查时往
三段生殖试验图解
Ⅰ生育力和早期胚胎发育毒性试验 Ⅱ胚体一胎体毒性试验(致畸试验) Ⅲ出生前后发育毒性试验
I 阶段试验
雌雄性交配前-受孕-雌性受精-雌性着床 期间染毒 研究对成年雌雄性的生殖功能、配子的 发生及成熟、交配行为、受精、着床前的 发育和着床的影响
Ⅱ阶段试验
从着床到硬腭闭合期间染毒 研究对成年雌性生殖功能、胚胎 发育、器官形成期的发育毒性
天断奶为止。F1a断奶后观察其发育情况，不再喂受试物。F1b断
奶后，继续接触受试物8 ～12周，直到性发育成熟，选出雌雄各 16～20只，按前法进行交配。F1b所产第一窝幼仔为F2a，F2a断奶
后，其母鼠F1b休息10天，再次交配，所生幼仔为F2b，F2b断奶后，
将F1b淘汰。F2b交配处理方法与F1b相同。但F2b也可只交配一次， 所产仔鼠为F3a，不再进行第二次交配，试验结束。
第七章 特殊毒性作用及其试验 与评价方法
第一节 生殖发育毒性及其试验与评价方法 第二节 致突变作用及其试验与评价方法 第三节 致癌作用及其试验与评价方法
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第一节 生殖发育毒性及其试验与评价方法
一、 生殖毒性试验与评定 二、发育毒性试验与评定
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二、发育毒性试验与评定
1.基本概念 发育毒性指出生前经父体和（或）母体接 触外源理化因素引起的在子代到达成体之 前内出现的有害作用，包括结构畸形、生 长迟缓、功能障碍及死亡。 能造成发育毒性的物质称为发育毒物。
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Hale Waihona Puke Baidu
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根据上述原则综合考虑，致畸试验可选用二种哺乳动
物，一般首先考虑大鼠，此外可采用小鼠或家免。大 鼠受孕率高，每窝产仔8～10只，易于得到足够标本 数；而且经验证明，大鼠对大多数外来化合物代谢过 程，基本与人类近似，故可首先考虑。
小鼠自然畸形发生率较大鼠高，但低于家兔，对形成 腭裂的致畸物更较敏感。
妊娠动物数 正常分娩雌性动物数
×100%
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3．幼仔出生存活率反映雌性动物分娩过程是 否正常，如分娩过程受到影响，则幼仔往往在 出生4天内死亡。
幼仔出生存活率= ———————————×100%
分娩时出生幼仔数 出生后4天存活幼仔数
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动物接触受试物的方式应参照人类实际接触 途径。
一般可混入饲料或饮水中，由动物摄取；也
可采用灌胃或胶囊法。
利用大鼠或小鼠进行试验时，每组雌雄各
16～20只，或雌性16～20只，雄性8～10只。
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（2）试验方法
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4．幼仔哺乳成活率反映雌性动物授乳哺育幼 仔的能力。 幼仔哺乳成活率= —————————×100%
出生后4天幼仔存活数 21天断奶幼仔存活数
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（四）结果判定
将试验组动物各项观察指标统计结果与对 照组动物进行比较，如试验动物在交配、 妊娠、幼仔存活、幼仔发育(哺育)等方面 受到影响，则说明受试物对动物繁殖功能 有损害作用。
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高剂量组：LD50的1/5或1/3。
原则是引起母体轻度中毒，死亡率<10%;
低剂量组：LD50的1/30～1/100。
原则是不引起母体的任何中毒症状。
中剂量组：在高、低剂量之间成等比关系。
原则是只引起母体极轻微毒性反应。
或者以实际接触量为低剂量，以其10倍量为 高剂量。
Ⅲ阶段试验
从着床到幼仔断乳期间对孕（乳）母染毒 从着床到子代性成熟的母体生殖毒性(妊娠、分 娩和哺乳)和子代的发育毒性（胚胎、胎儿生长 发育，新生幼仔宫外生活的适应性，断乳前后的
生长发育，独立生活能力和性功能成熟）
人、大鼠和家兔的致畸作用关键期的比较，短线表示“靶窗”
3.发育毒性作用评价
发育毒性主要表现为致畸作用，所以发育 毒性作用评价主要是评价受试物的致畸作 用。
家兔为草食动物，与人类代谢功能差异较大，妊娠期 不够恒定，有时延长至36天，自然畸形发生率也较高。
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(2)剂量分组
致畸试验中剂量分组的一般原则是一方 面要求出最大无作用剂量，以及引起致 畸的阈剂量，同时还要保持母体生育能 力，不致母体大批流产和过多胚胎死亡， 也应避免较多母体死亡。
畸形：指出生前因素引起发育生物体的严重 的解剖学上形态结构的缺陷。
致畸性和致畸作用：均指在妊娠期（出生前） 接触外源性理化因素引起后代结构畸形的特 性或作用。
变异：是由遗传和遗传外因素控制的外观变 化，或由于分化改变而引起的中途歧异。
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2.发育毒性的表现
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一、生殖毒性试验与评定
外来化合物对生殖过程的损害作用，即生殖 毒性。生殖毒性可发生于妊娠期，也可发生 于妊娠前期和哺乳期。
生殖毒性试验主要研究外来化合物对生殖细 胞发生、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分 娩和哺乳过程的损害及其评定。过去也称为 繁殖试验。
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